Célula de hibridoma depositada con el número de acceso DSM ACC 2666 el 13 de julio de 2004 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH en Braunschweig, Alemania

Anticuerpos monoclonales con especificidad por eritrocitos fetales.

Introducción

Los desarrollos sociales han supuesto un aumento en las investigaciones prenatales. La amniocentesis o con menor frecuencia el muestreo de las vellosidades corónicas se realiza en uno de cada diez embarazos para el análisis prenatal por ejemplo de la trisomía 21. El riesgo de defectos cromosómicos aumenta con la edad de la madre. Esta es la causa por la que la amniocentesis se realiza en más del 50% de las mujeres embarazadas de 35 o más años. Sin embargo, la mayoría de los niños con defectos cromosómicos o genéticos nacen de mujeres con una edad inferior a 35, si se considera la cifra total. La probabilidad de una trisomía 21 es del 0,3% en los fetos de mujeres con una edad de 35 años o superior. Esto debe considerarse en el contexto de que el procedimiento de la amniocentesis comporta un riesgo del 0,5% de inducción de abortos. A partir de estas cifras es obvio que existe una gran necesidad de un procedimiento de diagnóstico alternativo que de los mismos resultados sin suponer riesgos para el nonato. Una estrategia podría ser aislar las células fetales de la sangre materna. Esto eliminaría riesgos para el feto.

Se ha estimado que puede encontrarse una célula fetal en de 10⁵ a 10⁷ de las células hemáticas nucleadas maternas. Otras investigaciones han demostrado que, en presencia de aberraciones cromosómicas pueden detectarse más células fetales en la circulación materna. Esto suscita la posibilidad de detectar un feto aneuploide mediante procedimientos no invasivos.

Se han identificado tres tipos de células fetales en la sangre materna: linfocitos, trofoblastos y glóbulos rojos nucleados (NRBC). Los linfocitos fetales se han detectado todavía de 1a 5 años después del nacimiento. Esta longevidad puede interferir con el diagnóstico adecuado en los siguientes embarazos.

Los trofoblastos son dianas atractivas porque pueden identificarse fácilmente por su morfología. Sin embargo, no pueden usarse fácilmente con fines diagnósticos porque, como son células de la placenta, pueden diferir de las células del feto: en aproximadamente 1% de las aberraciones cromosómicas diagnosticadas en los trofoblastos, el feto resultó estar sano.

Los glóbulos rojos nucleados (NRBC) fetales aparecen temprano en la circulación materna, sin embargo no persisten tras el nacimiento. Como tienen núcleo, son los candidatos preferidos para el análisis cromosómico. Sin embargo, hasta la fecha no pueden diferenciarse de forma fácil e inequívoca de las otras células hemáticas.

Se identifican a través de un perfil de marcadores que es característico de las células precursoras eritroides y que es diferente de otras subpoblaciones de células hemáticas. Las células hemáticas se han caracterizado extensamente mediante los denominados marcadores de clústeres de diferenciación (CD) como se ha definido en el 7º Taller de trabajo y conferencia sobre antígenos para la diferenciación de leucocitos humanos (Harrogate 2000). Las células eritroides inmaduras expresan CD71 y carecen de CD45 que se expresa en los leucocitos. Este conocimiento puede usarse para distinguir las células precursoras eritroides de otras células mononucleadas.

Para aislar e identificar las células fetales (1 entre de 10⁵ a 10⁷ células nucleadas maternas) deben cumplirse los criterios más rigurosos. No existe ningún marcador de la superficie celular disponible todavía que se exprese exclusivamente en los NRBC fetales. Para enriquecer en células fetales habitualmente se usan técnicas de separación de células inmunomagnéticas o por citometría de flujo o solas o combinadas. Los resultados del análisis cromosómico o genético de las células aisladas se han comparado con los resultados obtenidos con células amnióticas. Muchas investigaciones han demostrado la viabilidad técnica de la estrategia no invasiva con cohortes grandes.

Sin embargo, los procedimientos existentes todavía no son adecuados para el diagnóstico rutinario. Debe asegurarse que las células en investigación son inequívocamente células fetales. La identificación de los NRBC fetales solo puede lograrse mediante el reconocimiento de un marcador, que preferentemente se exprese en las células eritroides fetales o que se exprese o esté localizada de una forma que sea específica para las células fetales del torrente sanguíneo.

La falta de marcadores, que identifiquen especialmente a las células fetales es el principal obstáculo para desarrollar un diagnóstico prenatal no invasivo fiable.

Huie et al. "Antibodies to human fetal erythroid cells from a nonimmune phage antibody library", Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 98 (5), 2001-02-27, páginas 2682-2687, XP002974719 describe anticuerpos contra células eritroides fetales humanas. Se generaron usando un nuevo tipo de colección de anticuerpos en fagos no inmunitarios en la que se presentan múltiples copias de fragmentos de anticuerpos en cada fago.

El objetivo de esta invención es la generación de anticuerpos, que permitan discriminar entre las células eritroides fetales y adultas y la identificación inequívoca de células fetales. Las células fetales reconocidas por estos anticuerpos preferentemente deberían poseer al menos en parte un núcleo celular intacto, expresar el antígeno CD71 y deberían carecer del antígeno CD45 conforme a los resultados publicados anteriormente.

Un objetivo adicional es proporcionar un procedimiento para la detección o identificación de células fetales y un procedimiento para la detección de aberraciones, defectos y/o variantes cromosómicos y/o genéticos en células fetales.

Además, el objetivo de la invención es generar anticuerpos monoclonales, que reaccionen específicamente con células fetales así como una línea celular de hibridoma, que produzca esos anticuerpos, así como sus usos. Este objetivo se resuelve mediante la célula de hibridoma de acuerdo con la reivindicación 1, el anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 a 4, el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 y el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9. En las reivindicaciones dependientes respectivas se proporcionan mejoras adicionales de los anticuerpos, la célula de hibridoma y los procedimientos.

Para los fines de la presente invención, se han inmunizado a 5 ratones con células eritroides aisladas de sangre umbilical (CD71+, CD45-), que portaba el antígeno "i" tal como se define en el autoanticuerpo que se describe en el documento DE 100 35 433 A1. La inmunización con estas células abre la posibilidad de que, además de los anticuerpos contra antígeno "i", se generen también anticuerpos con especificidades contra marcadores nuevos, que podrían usarse para identificar células precursoras eritroides. Las células de bazo de los ratones inmunizados se fusionaron con una línea celular de mieloma para producir hibridomas de acuerdo con procedimientos estándar (Schetters H, Production of Monoclonal Antibodies, en: Methods of Immunological Analysis, Masseyeff RF, Albert WH y Staines NA (Ed.) Vol. 2, Capítulo 4.3, 230-245, VCH Weinheim, 1993).

Diseño y procedimientos en detalle

En detalle, se inmunizó a los ratones con células hemáticas de cordón umbilical humano separadas por citometría de flujo (CD71+, antígeno-i+, CD19- y CD45-). Los sobrenadantes de los hibridoma se cribaron sobre células hemáticas de cordón umbilical mononucleares, mientras que la cantidad correspondiente de precursores eritroides se determinó mediante tinción citoquímica de frotis de sangre. Para el cribado de los hibridomas, se formuló un análisis por citometría de flujo de seis parámetros (cuatro colores, dispersión frontal y lateral) para la identificación simultánea de células precursoras eritroides, leucocitos, eritrocitos enucleados y para anticuerpos que reaccionan específicamente con células fetales. Además, se han realizado análisis inmunohistioquímicos con frotis de sangre fetal y cortes de hígado fetal de la 6ª a la 38ª semana de gestación así como con sangre de adulto, médula ósea normal de adulto y eritrocitos de adulto como controles.

Resultados

Se ha identificado un clon (número de acceso DSM ACC 2666 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)) con especificidad por un antígeno superficial que exclusivamente expresan las células eritroides fetales. El nuevo anticuerpo mostró unión inalterada a células eritroides de sangre fetal desde los...

1. Célula de hibridoma depositada con el número de acceso DSM ACC 2666 el 13 de julio de 2004 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH en Braunschweig, Alemania.

2. Anticuerpo monoclonal expresado por la célula de hibridoma de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 2 que reacciona con un antígeno superficial presente en los glóbulos rojos fetales y su células precursoras nucleadas, y que no reacciona con los antígenos superficiales de las células eritroides adultas.

4. Anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque reacciona con células eritroides fetales pero no con el antígeno CD71.

5. Uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 a 4 para la detección e identificación de células fetales en una muestra.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación precedente para la detección e identificación de células fetales en una muestra de sangre materna.

7. Procedimiento para la detección o identificación de células fetales en una muestra, caracterizado por el marcado de dichas células fetales mediante un anticuerpo de acuerdo con una de las reivindicaciones 2 a 4.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación precedente, caracterizado porque la muestra es de sangre materna.

9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque las células que se unen al anticuerpo monoclonal se separan mediante una de citometría de flujo, separación en fase sólida, separación con perlas inmunomagnéticas y cribado sobre superficies plásticas.

10. Procedimiento para la detección de aberraciones, defectos y/o variantes cromosómicos y/o genéticos en las células fetales que comprende las etapas de detectar o identificar las células fetales mediante un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 a 9, y posterior a dicha detección o identificación de células fetales, analizar dichas células fetales marcadas para determinar las aberraciones, defectos y/o variantes cromosómicos y/o genéticos.