Procedimiento en fase sólida para aislamiento, enriquecimiento y/o detección para aislar,

enriquecer y/o detectar hemocitoblastos tumorales y/o células tumorales en transición epitelio-mesénquima como células predeterminadas procedentes de una muestra de fluido corporal que contiene dichas células predeterminadas para al menos uno del grupo que comprende estadificación, pronóstico y guía terapéutica.

comprendiendo dicho procedimiento una etapa de selección para la selección o enriquecimiento de dichas células predeterminadas procedentes de la muestra en el que la muestra se pone en contacto con una superficie sólida para la unión preferente de dichas células predeterminadas a la superficie sólida y posteriormente la muestra se retira de la superficie sólida en una etapa de lavado,

caracterizado porque,

en dicha etapa de selección para la selección o enriquecimiento preferente en células tumorales, la muestra contiene un poliol durante al menos uno de entre poner en contacto la muestra con la superficie sólida y la etapa de lavado y en una etapa de detección que detecta en dichas células, que preferentemente se han seleccionado o enriquecido mediante dicha etapa de selección, la presencia o ausencia de expresión de al menos un marcador asociado con al menos uno del grupo que comprende hemocitoblastos tumorales y células tumorales en transición epitelio-mesénquima.

Detección de hemocitoblastos tumorales y células tumorales en la transición epitelio-mesénquima en fluidos corporales de pacientes de cáncer. La biología de las células tumorales circulantes (CTC) se puede evaluar mediante diferentes procedimientos biológicos (RT-PCR, PCR en tiempo real, tecnología de micro-chip). La determinación de genes expresados en exceso que son dianas farmacéuticas (receptor de estrógenos, receptor de progesterona, EGFR, HER2) podría ser de ayuda en el contexto de estrategias personalizadas para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, la determinación global de las rutas de transducción de la señal alteradas en el metabolismo de la célula cancerosa puede llevar a una mejor comprensión de la forma en la que las células tumorales son capaces de escapar al sistema inmunitario y desarrollar resistencia contra el tratamiento farmacológico. Algunos hallazgos clave en tejido tumoral primario sugieren que el potencial metastásico de un tumor se basa en la presencia de un número de células tumorales tipo hemocitoblasto que se han identificado como una fuente activa de diseminación metastásica. Se ha encontrado que los hemocitoblastos del cáncer detectados en el tejido tumoral primario son relevantes para el resultado clínico después del tratamiento. En consecuencia, se puede asumir que dichos hemocitoblastos tumorales se han diseminado desde el tumor primario hasta la circulación, y se escapan de la terapia debido a sus propiedades como hemocitoblastos hasta que alcanzan su órgano de acogida en el que actúan como semilla para la formación de una metástasis. Se ha encontrado que los hemocitoblastos cancerosos, enriquecidos desde el tumor primario, muestran una tinción positiva para el marcador CD44 de hemocitoblastos, pero negativa para el CD24. Más recientemente, también se ha encontrado que ALDH1 era un marcador específico de los hemocitoblastos cancerosos. Hay algunas pruebas de que las células tumorales circulantes podrían identificarse parcialmente como hemocitoblastos cancerosos debido a similitudes tales como una mayor resistencia a la quimioterapia y menor proliferación durante la circulación. Se ha informado de hallazgos similares para las células tumorales diseminadas en la médula ósea donde se han demostrado células tumorales con un fenotipo similar al de los hemocitoblastos. No existen resultados experimentales equivalentes para las CTC. Además, junto al concepto de hemocitoblasto canceroso, se ha teorizado que las células tumorales diseminadas en la circulación pueden experimentar cambios en el fenotipo, que se conocen como transición epitelio-mesénquima (EMT). Estas células tienen menor apoptosis y resistencia a fármacos. Esto les permite viajar hasta el punto de la metástasis y evita que se vean afectadas por los tratamientos convencionales. Se sabe que las EMT se producen en desarrollos embriónicos en los que las células epiteliales deben escaparse de las restricciones estructurales impuestas por la arquitectura del tejido. Esto lo consiguen adoptando un fenotipo más adecuado al movimiento de la célula. La progresión de los carcinomas a enfermedad invasiva y metastásica muestra una importante similitud con este proceso. Las células tumorales epiteliales anteriores que se podían convertir al fenotipo mesenquimal podían, de este modo, escaparse del tejido tumoral primario y desarrollar resistencia contra las pautas terapéuticas convencionales, como el tratamiento antihormonal, ya que pierden las dianas terapéuticas relevantes durante dicha transformación (hallazgo de los inventores). Por otra parte, también sería posible que la expresión de dianas terapéuticas potenciales, como el receptor Her2, pudiera inducirse en dichas células, incluso si se encontrara que el tumor primario era negativo para dichas dianas. Debido a que dicho acto de metastatización necesita la diseminación de hemocitoblastos tumorales o células tumorales que presenten EMT, la detección y caracterización de CTC que muestren un metabolismo tipo EMT o hemocitoblasto podría ser una potente herramienta diagnóstica para la determinación temprana de fracaso terapéutico o el riesgo potencial de resistencia a una intervención terapéutica dada. Hay muchos marcadores moleculares que son útiles para determinar células con un carácter potencial de hemocitoblasto, o de esas células que se encuentran en EMT (Tabla 1). Tabla 1: Ejemplos de marcadores para detectar y caracterizar células en EMT y hemocitoblastos tumorales. Marcadores relevantes células en EMT ES 2 366 269 T3 para caracterizar Marcadores relevantes para caracterizar el fenotipo de hemocitoblasto Integrina alfa V beta 6 FGF2 N-caderina BMI1 Vimentina ALDH1 Fibronectina CD44 Snail1, Snail2 CD24 2 Marcadores relevantes para caracterizar células en EMT (continuación) Twist1 KRT19 Goosecoide Twist1 FOXC2 BRCA1 SOX 10 PTEN MMP-2, MMP3, MMP9 MSI1 Beta catenina CD34 SMAD NOTCH NK kappa-beta Jaggedl Akt2 PI3K alfa c-kit CD133 VEGF NOTCH E-caderina Ciclina D TGF ß Mesotelina SIP1 ES 2 366 269 T3 Marcadores relevantes para caracterizar el fenotipo de hemocitoblasto Hasta la fecha, no se ha podido demostrar si la detección de hemocitoblastos que muestren propiedades de CTC o de EMT es un marcador pronóstico o predictivo debido a su potencial tumorigénico. Aunque se han publicado 5 experimentos de perfilado de expresión sobre las CTC, no hay datos disponibles que permitan caracterizar las células o hemocitoblastos tumorales en circulación en EMT tras enriquecimiento inmunomagnético de células CTC tras enriquecimiento a partir de sangre con la especificidad requerida. Esto se ha demostrado como un importante desafío ya que la detección y caracterización de este tipo de células en la sangre se complica por el hecho que los marcadores moleculares útiles para dicho objetivo también se expresan en linfocitos B activados y en otras células 10 mononucleares. Un enriquecimiento en CTC mediante, por ejemplo, estrategias inmunomagnéticas solo es posible si los marcadores escogidos a ese fin son más bien específicos de tumores y muestran un nivel bajo de expresión ilegítima en células mononucleares de la sangre. Sin embargo los genes, necesarios para la detección de los hemocitoblastos tumorales o células en EMT, se encuentran ampliamente expresados en células mononucleares de la sangre no tumorales. El atrapamiento no 15 específico de dichas células conduce a un elevado fondo no específico que evita la detección de marcadores en hemocitoblastos CTC/células en EMT. Es por tanto el objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento de aislamiento, enriquecimiento y/o detección en fase sólida para aislar, enriquecer y/o detectar hemocitoblastos tumorales y/o células tumorales, en el que dichas células tumorales se encuentran en la transición epitelio-mesénquima, así como usos para el mismo. 20 Este objeto se resuelve mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 y los usos de acuerdo con las reivindicaciones 10 a 12. Otras mejoras del procedimiento inventivo se proporcionan en las correspondientes 3 reivindicaciones dependientes. La presente invención utiliza un aditivo recientemente desarrollado, en concreto para un tampón de lavado (documento EP 07 018 205.0 de Adnagen AG, Langenhagen), para permitir la eliminación de células contaminantes no diana en el enriquecimiento de CTC y, de este modo, aumentar de forma sustancial la pureza de las CTC enriquecidas. El tampón de lavado de la presente invención contiene un poliol, usado en particular antes, durante y/o después de poner en contacto la muestra con una superficie sólida para la separación de las células deseadas de la muestra. El poliol debe comprender o consistir en al menos uno entre el grupo que comprende sorbitol, sacarosa, trehalosa, manitol, fructosa, maltitosa, lactitol, xilitol y glicerol en una cantidad (V/V o P/V) de al menos un 1%, preferiblemente de al menos un 10%, preferiblemente de al menos un 20% preferiblemente de al menos un 30%, preferiblemente de al menos un 50%, preferiblemente de al menos un 60% en la disolución tampón. De forma sorprendente, se ha encontrado que el enriquecimiento inmunomagnético de CTC combinado con dicho poliol, en particular como componente de un tampón de lavado, permite la detección de marcadores de células en EMT en una pequeña cantidad (5 células) de células de cáncer de ovario cultivadas diseminadas en 5 ml de muestras de sangre procedentes de un donante sano. Adicionalmente, las CTC con propiedades de hemocitoblasto tumoral así como las células que expresan marcadores EMT se pueden detectar específicamente en sangre de pacientes con cáncer metastásico. De forma aún más sorprendente, se ha encontrado que los pacientes con CTC que muestran hemocitoblastos detectables y marcadores EMT, son resistentes a la terapia y tienen una... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento en fase sólida para aislamiento, enriquecimiento y/o detección para aislar, enriquecer y/o detectar hemocitoblastos tumorales y/o células tumorales en transición epitelio-mesénquima como células predeterminadas procedentes de una muestra de fluido corporal que contiene dichas células predeterminadas para al menos uno del grupo que comprende estadificación, pronóstico y guía terapéutica. comprendiendo dicho procedimiento una etapa de selección para la selección o enriquecimiento de dichas células predeterminadas procedentes de la muestra en el que la muestra se pone en contacto con una superficie sólida para la unión preferente de dichas células predeterminadas a la superficie sólida y posteriormente la muestra se retira de la superficie sólida en una etapa de lavado, caracterizado porque, ES 2 366 269 T3 en dicha etapa de selección para la selección o enriquecimiento preferente en células tumorales, la muestra contiene un poliol durante al menos uno de entre poner en contacto la muestra con la superficie sólida y la etapa de lavado y en una etapa de detección que detecta en dichas células, que preferentemente se han seleccionado o enriquecido mediante dicha etapa de selección, la presencia o ausencia de expresión de al menos un marcador asociado con al menos uno del grupo que comprende hemocitoblastos tumorales y células tumorales en transición epitelio-mesénquima. 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizado porque la etapa de selección comprende una selección inmunológica dirigida a la selección o enriquecimiento preferente en células tumorales. 3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque antes, durante o después de poner en contacto la muestra con la superficie sólida, se añade un poliol a la muestra o fase sólida, en particular como un componente de un tampón de lavado. 4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el poliol se añade a la muestra o fase sólida o está presente en la muestra en una concentración final (V/V o p/V) de al menos 1 %, preferiblemente de al menos un 10 %, preferiblemente de al menos un 20 %, preferiblemente de al menos un 30 %, preferiblemente de al menos un 50 %, preferiblemente de al menos un 60 % de poliol. 5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho poliol comprende o es al menos uno del grupo de polioles que comprende sorbitol, sacarosa, trehalosa, manitol, fructosa, maltitosa, lactitol, xilitol y glicerol. 6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la superficie sólida es al menos una del grupo que comprende una superficie de gel, una superficie de sefarosa, una superficie de vidrio, una superficie de látex, una superficie cerámica, una superficie metálica y una superficie de plástico. 7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la superficie sólida es la superficie de perlas magnéticas. 8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se inmovilizan ligandos o anticuerpos sobre la superficie sólida, que son capaces de unirse específicamente a las células predeterminadas. 9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho fluido corporal es al menos uno del grupo que comprende sangre periférica, médula ósea, orina, ascites, esputo y similares procedentes de un paciente. 10. Uso de un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores para aislar, enriquecer y/o detectar células predeterminadas contenidas en una muestra. 11. Uso de un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9 para estadificación y/o pronóstico y/o guía en la terapia de tumores. 12. Uso de un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9 para ayudar a desarrollar fármacos nuevos contra células tumorales tipo hemocitoblasto y/o células tumorales en EMT y/o ayudar a definir nuevos fármacos dirigidos a terapias. 8 ES 2 366 269 T3 9 ES 2 366 269 T3 ES 2 366 269 T3 11 ES 2 366 269 T3 12 ES 2 366 269 T3 13 ES 2 366 269 T3 14