PROCEDIMIENTO DE ENRIQUECIMIENTO Y/O AISLAMIENTO DE CÉLULAS EN FASE SÓLIDA.

Procedimiento de enriquecimiento y/o aislamiento de células en fase sólida La presente invención se refiere a un procedimiento en fase sólida para asilar y/o enriquecer células predeterminadas de una muestra. Dichos procedimientos se utilizan por ejemplo para predeterminar, asilar y enriquecer células como células fetales de una muestra de sangre periférica materna; células tumorales de una muestra de fluido corporal o células madre de una muestra fluida o fluidizada de tejido corporal o fluido corporal. La detección y análisis de células raras en sangre, médula ósea y otras muestras se vuelve una necesidad importante en los diagnósticos: La detección de células tumorales circulantes, incluyendo células madre tumorales y células madre en transición epitelio-mesénquima (EMT), y cáncer residual mínimo es particularmente útil en oncología para el pronóstico mejorado, detección temprana del avance de la enfermedad y monitoreo de terapia. Otras solicitud de dichas técnicas es la detección y análisis de células fetales en la sangre materna que permite el diagnóstico prenatal efectivo y no invasivo de anomalías genéticas y cromosómicas en los estadios tempranos de desarrollo fetal. El análisis de ADN en base a PCR o el perfil de expresión en base a RT-PCR son tecnologías sensible y fáciles de manipular para la detección y análisis de dichas células raras. Sin embargo, estas tecnologías son afectadas por el hecho, que los leucocitos contaminantes como fuente de señales de fondo específicas debido a la expresión ilegítima o expresión endógena de antígenos asociados al tumor, están reduciendo la especificidad de la detección de las células raras: por ejemplo células tumorales circulante. En forma similar, la genotipificación de ADN no es posible si las células tumorales asiladas o fetales no son suficientemente puras. El enriquecimiento de células de muestras corporales es una tarea importante en muchas aplicaciones terapéuticas, también, además de las aplicaciones diagnósticas, ya que los anticuerpos monoclonales (u otros ligandos y especificadores) están disponibles ahora, que permiten la separación de muchos tipos de células particulares de fuentes con poblaciones celulares mixtas tales como sangre, médula ósea y otros tejidos. Las terapias en base a células son un campo en crecimiento que coloca las demandas graves en la selectividad de cualquier técnica de aislamiento celular que sea útil para ese propósito. La ingeniería de injerto de células madre y la inmunoterapia de cáncer son una de las aplicaciones más importantes en la terapia celular. Pueden utilizarse células madre autólogas enriquecidas de sangre o médula ósea para soportar los regímenes de quimioterapia de altas dosis para una variedad de tumores malignos. Existe una gran demanda de una alta pureza de células aisladas con tecnologías de enriquecimiento celular. La utilidad de los productos de células madre enriquecidas es deteriorada por células malignas contaminantes que podrían ser una fuente de metástasis y recaídas tardías. Una contaminación con células T es la principal causa de una enfermedad de injerto contra huésped y es la razón primaria de falla de trasplante. De ese modo, una mejora de la eficacia de las tecnologías de enriquecimiento celular terapéutico existentes es un tema principal que debe ser tratado en forma urgente. Existen diversas técnicas disponibles para el enriquecimiento de células de sangre y otras muestras. La selección celular mediante tecnología FACS es un procedimiento muy específico que puede aplicarse para enumerar y recolectar células raras para el uso adicional y análisis. Sin embargo, este procedimiento no es aplicable aún en forma rutinaria a las muestras o grandes volúmenes de sangre completa y para preparaciones celulares a gran escala. Se han desarrollado diversos procedimientos inmunoquímicos para el enriquecimiento de células de muestras de fluido mediante la utilización de adsorción en fase sólida como por ejemplo mediante inmunocaptura. Los anticuerpos monoclonales (u otros ligandos adecuados como, por ejemplo, aptámeros u otros especificadores) pueden inmobilizarse en superficies sólidas como sefarosa, vidrio, látex o cuentas de plástico u otras superficies para aplicaciones por lote o columnas de flujo pasante. Aunque el manipuleo de estos dispositivos es relativamente conveniente, la recuperación y pureza obtenidas con dichos dispositivos es insuficiente en muchos casos. El uso de cuentas magnéticas etiquetadas con anticuerpos se volvió bastante eficiente, demostrando buenos índices de recuperación y un índice de enriquecimiento de 4-5 log10. No obstante, esta pureza aún es demasiado baja para el perfil de expresión, especialmente si el marcador molecular de interés no está sobreexpresado en las células diana en comparación con las células nucleadas potencialmente contaminantes como leucocitos o células madre eritropoyéticas. Además, los experimentos de tipificación genética a base de ADN para diferenciar células maternas de células fetales o células normales de células tumorales, en general, no son posibles en dichas muestras. Por ello, incrementar la eficacia o purificación celular con dispositivos inmunoquímicos en fase sólida o dispositivos similares es una necesidad urgente, no sólo para aplicaciones diagnósticas, sino también para aplicaciones terapéuticas. Existen varias razones para la unión no específica o captura de células no deseadas durante el enriquecimiento celular: 1. Aunque los anticuerpos monoclonales (u otros ligandos y especificadores seleccionados) deben exhibir una lata especificidad hacia el antígeno (o receptor) elegido para la separación celular, aún debe haber unión no específica considerable a estructuras de receptores o antígenos similares. 2   2. Otra razón para capturar células no deseadas pueden ser las interacciones física (interacciones electrostáticas, hidrofóbicas o simplemente captura mecánica) con o sin la estructura de fase sólida /anticuerpo (ligando o especificador). 3. Los antígenos o receptores diana elegidos para el enriquecimiento celular también podrían estar expresados en algunas células no diana presentes en la misa muestra (por ejemplo, a través de la expresión ilegítima o endógena) Con el fin de mejorar el desempeño de los procedimientos de enriquecimiento actuales, estos procedimientos podrían adaptarse para obtener mejor especificidad mediante la selección de un anticuerpo, ligando o especificador más específico hacia la diana de superficie celular elegida (véase los puntos 1 y 2 más arriba) mientras que el remanente no específico de células no diana no puede impedirse fácilmente (véase el punto 3 más arriba). Elegir cuentas magnéticas como vehículos para anticuerpos, ligandos o receptores en vez de columnas de flujo pasante rellenas con cuentas o elegir cuentas de polistirol en vez de sefarosa son ejemplos de mejoras posibles. Sin embargo, la mayoría de los intentos de mejoras técnicas no llevaron a las purezas requeridas en muchos casos, y aún existe una necesidad urgente de otra reducción de la cantidad de células no diana capturadas o unidas en forma no específica, preferentemente mediante el ajuste de las condiciones de unión que evitan las interacciones físicas. Demel et al. (J. Exp. Clin. Cancer Res., 23(3): 465-468, 2004) emplea una mezcla lista para usar de anticuerpos unidos a cuentas inmunomagnéticas ("AdnaTestBreastCancerSelect" por AdnaGen) para la purificación de células tumorales de una muestra sanguínea. Las cuentas se lavaron dos veces con PBS y finalmente con tampón de lavado/lisado de (Dynal, Noruega). Se concluye que los ensayos relevantes para células tumorales en sangre se necesitan en forma urgente para superar los problemas de especificidad ya que las consecuencias diagnósticas y aún terapéuticas dependen de ensayos confiables. Zieglschmid et al. (Anticancer Res., 25: 1803-1810, 2005) emplea cuentas inmunomagnéticas acopladas a cinco diferentes anticuerpos monoclonales para el enriquecimiento de células tumorales de una muestra sanguínea. Las cuentas se lavaron con PBS y después se lavaron con tampón de lavado en conformidad con el protocolo de Dynal (Noruega). Es objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento mejorado de aislamiento y/o enriquecimiento en base a tecnología en fase sólida, que elimine exitosamente o reduzca células no diana capturadas o unidas en forma no específica durante la captura en fase sólida. Este objeto se soluciona mediante el procedimiento aislamiento en fase sólida y/o enriquecimiento utilizando ligandos, receptores, antígenos o anticuerpos inmobilizados en una superficie sólida en conformidad con la reivindicación 1. Las mejoras del procedimiento inventivo se proporcionan en las reivindicaciones 2... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento en fase sólida para aislar y/o enriquecer células predeterminadas de una muestra que contiene dichas células predeterminadas mediante la unión de las células predeterminadas a una superficie sólida, en el que los ligandos, receptores, antígenos o anticuerpos son inmobilizados en la superficie sólida, que son capaces de unirse específicamente a las células predeterminadas y en el que la muestra entra en contacto con la superficie sólida y después es retirada de la superficie sólida en una etapa de lavado, caracterizado porque la muestra contiene un poliol al menos durante una etapa de contacto la muestra con la superficie sólida y de lavado. 2. El procedimiento en conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado porque antes o durante el contacto de la muestra con la superficie sólida, se añade un poliol a la muestra. 3. El procedimiento en conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se utiliza un tampón de lavado, que contiene un poliol, para lavar la superficie sólida en la etapa de lavado después de contactar la muestra con la superficie sólida. 4. El procedimiento en conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el poliol se añade a la muestra o está contenido en el tampón de lavado en una concentración final (P/V o V/V) de al menos 1 %, preferentemente al menos 10%, preferentemente al menos 20 %, preferentemente al menos 30%, preferentemente al menos 50%, preferentemente al menos 60% de poliol. 5. El procedimiento en conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque como poliol, al menos se añade uno de los polioles en el grupo de polioles que comprende sorbitol, sacarosa, trehalosa, manitol, fructosa, maltit, lactitol, xilitol y glicerol a la muestra. 6. El procedimiento en conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la superficie sólida es al menos una del grupo que comprende una superficie de gel, superficie de sefarosa, superficie de vidrio, superficie de látex, superficie de cerámica, superficie de metal y superficie de plástico. 7. El procedimiento en conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la superficie sólida es la superficie de cuentas magnéticas. 8. El uso de un procedimiento en conformidad con una de las reivindicaciones precedentes para el aislamiento o enriquecimiento de células predeterminadas contenidas en una muestra. 9. El uso en conformidad con la reivindicación precedente para el aislamiento o enriquecimiento de células raras de una muestra. 10. EL uso en conformidad con la reivindicación 8 para el aislamiento o enriquecimiento de células fetales de una muestra de sangre periférica materna. 11. El uso en conformidad con la reivindicación 8 para el aislamiento o enriquecimiento de células tumorales de suspensiones celulares incluyendo al menos una del grupo que comprende sangre periférica, médula ósea, orina, ascitis, esputo y similares de un paciente. 12. El uso en conformidad con la reivindicación 8 para el aislamiento o enriquecimiento de células madre de una muestra de fluido corporal y/o de una muestra tisular y/o similar de un ser humano. 13. El uso en conformidad con la reivindicación 8 para el aislamiento o enriquecimiento de células madre tumorales y/o células EMT de una muestra de fluido corporal y/o de una muestra tisular y/o similar. 6   7   8   9     11   12   13   14