ANIMAL UTIL COMO MODELO EXPERIMENTAL DE UNA INFECCION DEL VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA (VFA), SU PROCEDIMIENTO DE OBTENCION Y SUS APLICACIONES.

Animal útil como modelo experimental de una infección del virus de la fiebre aftosa (VFA),

su procedimiento de obtención y sus aplicaciones.

El virus de la fiebre aftosa (VFA) es el agente causante de una enfermedad muy contagiosa y económicamente devastadora que afecta a animales de pezuña hendida y del que no existen modelos animales de fácil manejo. Un objeto de la invención lo constituye un animal útil como modelo experimental de una infección del VFA caracterizado porque es un roedor adulto que contiene una cantidad adecuada del VFA para provocar un proceso infeccioso sistémico y letal.

Otro objeto lo constituye el uso del animal modelo y su procedimiento de obtención en estudios de la patología del VFA, por ejemplo, para estudiar diferencias en la virulencia entre distintas variantes de VFA y los determinantes de dicha virulencia, así como evaluar nuevas vacunas y antivirales efectivos contra el VFA

Animal útil como modelo experimental de una infección del virus de la fiebre aftosa (VFA), su procedimiento de obtención y sus aplicaciones.

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un animal modelo de fiebre aftosa (FA), su procedimiento de obtención y sus aplicaciones en el estudio de la virulencia de dicho virus y en el desarrollo de aplicaciones terapéuticas frente a dicha enfermedad. Por lo tanto, se refiere a una invención del Sector Veterinario.

Estado de la técnica

El virus de la fiebre aftosa (VFA) es un miembro de la familia Picornaviridae, género Aphthovirus, agente causante de una enfermedad muy contagiosa y económicamente devastadora que afecta a animales de pezuña hendida, caracterizada por la aparición de vesículas en las patas y el hocico (Bachrach, H. L. 1978. Foot-and-Mouth disease: world-wide impact and control measures, p. 299-310. In E. K. a. K. Maramorosch (ed.), Viruses and environment. Academic Press, Inc., New York, N.Y.; Rowlands, D. J. 2003. Foot-and-mouth disease. Virus Res 91: 1-161; Sobrino, F., and E. Domingo. 2004. Foot-and-mouth disease. Horizon Press, London). El impacto social y económico de FA puede ser catastrófico cuando un brote aparece en países libre de VFA con animales inmunológicamente naive. Este fue el caso del brote de FA en Taiwan en 1997 y el del Reino Unido en 2001, en el que millones de animales infectados y en contacto fueron sacrificados con un coste directo e indirecto de billones de Euros (Gibbens, J. C., C. E. Sharpe, J. W. Wilesmith, L. M. Mansley, E. Michalopoulou, J. B. Ryan, and M. Hudson. 2001. Descriptive epidemiology of the 2001 foot-and-mouth disease epidemic in Great Britain: the first five months. Vet Rec 149: 729-43; Knowles, N. J., A. R. Samuel, P . R. Davies, R. P. Kitching, and A. I. Donaldson. 2001. Outbreak of foot-and-mouth disease virus serotype O in the UK caused by a pandemic strain. Vet Rec 148: 258-9; Yang, P. C., R. M. Chu, W. B. Chung, and H. T. Sung. 1999. Epidemiological characteristics and financial costs of the 1997 foot-and-mouth disease epidemic in Taiwan. Vet Rec 145: 731-4).

Similar a otros virus RNA, las poblaciones virales de VFA siguen una distribución dinámica de poblaciones en cuasiespecies como resultado de la alta tasa de mutaciones que ocurre durante la replicación de su genoma (revisado en Domingo, E., C. Biebricher, M. Eigen, and J. J. Holland. 2001. Quasispecies and RNA virus evolution: principles and consquences. Landes Bioscience, Austin, TX). Este heterogeneidad genética y diversificación se ve reflejada en la gran diversidad serológica que presenta, con siete serotipos antigénicamente distintos, O, A, C, South African Territories (SAT) 1, SAT 2, SAT3 y Asia 1 (Pereira, H. G. 1981. Foot-and-Mouth disease virus, p. 333-363. In G. RPG (ed.), Virus diseases of food animals, vol. 2. Academic Press, New York, N.Y.). La inmunidad protectora frente a un serotipo no protege frente a otros serotipos lo que complica el diseño de vacunas. Asimismo, existen muchos subtipos dentro de un mismo serotipo. Por comparación de reactividad con anticuerpos monoclonales se ha demostrado que las poblaciones de VFA están compuestas por un continuo de variantes antigénicos, con sustituciones de amino ácidos que afectan varios sitios antigénicos dentro de la partícula viral (Mateu, M. G. 1995. Antibody recognition of picornaviruses and escape from neutralization: a structural view. Virus Res 38:1-24). El diseño de vacunas efectivas se hace más difícil debido a la heterogeneidad antigénica dado que las vacunas deben acomodarse a las propiedades antigénicas de los virus circulantes.

Los mecanismos de patogenicidad y los determinantes de una inmunidad protectora a VFA no están bien caracterizados. Un entendimiento básico de estos mecanismos son necesarios para el diseño de vacunas que confieran protección completa. Los estudios que se pueden hacer con el hospedador natural son limitados debido a la complejidad del sistema y la falta de reactivos para definir los distintos componentes del sistema inmune que gobiernan dicha respuesta protectora. Inclusive el uso de cobayas está bastante limitado debido a la falta del conocimiento de factores genéticos y de reactivos para caracterizar la respuesta inmune (Balamurugan, V., R. Renji, S. N. Saha, G. R. Reddy, S. Gopalakrishna, and V. V. Suryanarayana. 2003. Protective immune response of the capsid precursor polypeptide (P1) of foot and mouth disease virus type "O" produced in Pichia pastoris. Virus Res 92: 141-9; Bittle, J. L., R. A. Houghten, H. Alexander, T. M. Shinnick, J. G. Sutcliffe, R. A. Lerner, D. J. Rowlands, and F. Brown. 1982. Protection against foot-and-mouth disease by immunization with a chemically synthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence. Nature 298: 30-3; Dunn, C. S., A. R. Samuel, L. A. Pullen, and J. Anderson. 1998. The biological relevance of virus neutralisation sites for virulence and vaccine protection in the guinea pig model of foot-and-mouth disease. Virology 247: 51-61; Huang, H., Z. Yang, Q. Xu, Z. Sheng, Y. Xie, W. Yan, Y. You, L. Sun, and Z. Zheng. 1999. Recombinant fusion protein and DNA vaccines against foot and mouth disease virus infection in guinea pig and swine. Viral Immunol 12: 1-8; Knudsen, R. C., C. M. Groocock, and A. A. Andersen. 1979. Immunity to foot-and-mouth disease virus in guinea pigs: clinical and immune responses. Infect Immun 24: 787-92; Nunez, J. I., E. Baranowski, N. Molina, C. M. Ruiz-Jarabo, C. Sanchez, E. Domingo, and F. Sobrino. 2001. A single amino acid substitution in nonstructural protein 3A can mediate adaptation of foot-and-mouth disease virus to the guinea pig. J Virol 75:3977-83). Para evitar alguno de estos problemas, un sistema adecuado podría ser el uso de ratones adultos en el que se conoce su genética y es un sistema manejable. El uso de ratones como sistema modelo se ha utilizado para el estudio de muchas enfermedades víricas tales como es el caso del virus de Ebola (Bray, M., K. Davis, T. Geisbert, C. Schmaljohn, and J. Huggins. 1998. A mouse model for evaluation of prophylaxis and therapy of Ebola hemorrhagic fever. J Infect Dis 178: 651-61), Hantaviruses (Wichmann, D., H. J. Grone, M. Frese, J. Pavlovic, B. Anheier, O. Haller, H. D. Klenk, and H. Feldmann. 2002. Hantaan virus infection causes an acute neurological disease that is fatal in adult laboratory mice. J Virol 76: 8890-9), el virus de Dengue (Huang, K. J., S. Y. Li, S. C. Chen, H. S. Liu, Y. S. Lin, T. M. Yeh, C. C. Liu, and H. Y. Lei. 2000. Manifestation of thrombocytopenia in dengue-2-virus-infected mice. J Gen Virol 81: 2177-82), el virus de la encefalitis equina venezolana (Gleiser, C. A., W. S. Gochenour, Jr., T. O. Berge, and W. D. Tigertt. 1961. Studies on the virus of Venezuelan equine encephalomyelitis. I. Modification by cortisone of the response of the central nervous system of Macaca mulatta. J Immunol 87: 504-8; Jackson, A. C., S. K. SenGupta, and J. F. Smith. 1991. Pathogenesis of Venezuelan equine encephalitis virus infection in mice and hamsters. Vet Pathol 28: 410-8) y el virus de Herpes simple (Hayashi, K., Y. Iwasaki, and K. Yanagi. 1986. Herpes simplex virus type 1-induced hydrocephalus in mice. J Virol 57: 942-51), entre otros. El uso de estos modelos murinos ha ayudado a elucidar muchos mecanismos de patogenia de los diferentes virus que hubiera sido muy difícil de obtener usando los hospedadores naturales.

Skinner (Skinner, H. 1951. One week old white mice as test animals in FMD research. Proc. Roy. Soc. Med. 44: 1041-1044) ya demostró que ratones recién nacidos podían ser infectados por vía peritoneal con distintos serotipos de VFA. Desde entonces, el modelo de ratones lactantes ha sido usado extensivamente por muchos laboratorios para la detección y titulación de virus y para tests de neutralización (Heatley, W., H. H. Skinner, and H. Surak-Sharpe. 1960. Influence of route of inoculation and strain of mouse on infectivity titrations of the virus of foot-and-mouth diseases. Nature 186: 909-11; Skinner, H. H., W. M. Henderson, and J. B. Brooksby. 1952. Use of unweaned white mice in foot-and-mouth disease research. Nature 169: 794-5; Subak-Sharpe, H. 1961. The effect of passage history, route of inoculation, virus strain and host strain on the susceptibility of adult mice to the virus of foot-and-mouth disease. Arch Gesamte Virusforsch 11: 373-99). VFA induce una rápida y fatal infección en estos ratones caracterizado por parálisis muscular de las patas traseras, mostrando cambios severos degenerativos en los músculos de las patas y en músculo esquelético y miocardio (Platt, H. 1956. A study of the pathological changes produced in young mice by the virus of foot-and-mouth disease. J Pathol Bacteriol 72: 299-312). Sin embargo, esta susceptibilidad...

1. Animal útil como modelo experimental de una infección del virus de la fiebre aftosa (VFA) caracterizado porque es un roedor adulto que contiene una cantidad adecuada del VFA para provocar un proceso infeccioso sistémico y letal.

2. Animal según la reivindicación 1 caracterizado porque es un ratón adulto.

3. Animal según la reivindicación 2 caracterizado porque es un ratón C57BL/6.

4. Animal según la reivindicación 2 caracterizado porque es un ratón BALB/C.

5. Animal según la reivindicación 2 caracterizado porque es un ratón Swiss.

6. Animal según la reivindicación 1 caracterizado porque el VFA es un virus perteneciente a cualquiera de los serotipos antigénicamente identificados: O, A, C, South African Territories (SAT) 1, SAT 2, SAT3 y Asia 1, sus subtipos, sus variantes antigénicas o sus subespecies.

7. Procedimiento de obtención del animal según las reivindicaciones 1 a la 6 caracterizado porque consiste en la inoculación del VFA en un roedor adulto, preferentemente un ratón adulto, en una localización que impide la intervención del sistema inmune, preferentemente por vía subcutánea (sc) en la almohadilla plantar de la pata del animal o intraperitoneal (ip), y en una cantidad adecuada de VFA para inducir un proceso de infección sistémico y letal.

8. Procedimiento de obtención del animal según la reivindicación 7 caracterizado porque la inoculación se realiza por vía subcutánea (sc) en la almohadilla plantar de la pata del ratón.

9. Procedimiento de obtención del animal según la reivindicación 7 caracterizado porque la inoculación se realiza por vía intraperitoneal (ip).

10. Procedimiento de obtención del animal según las reivindicaciones 7 a la 9 caracterizado porque el VFA es seleccionado entre los pertenecientes a cualquiera de los serotipos antigénicamente identificados: O, A, C, South African Territories (SAT) 1, SAT 2, SAT3 y Asia 1, sus subtipos, sus variantes antigénicas o sus subespecies.

11. Procedimiento de obtención del animal según la reivindicación 10 caracterizado porque el VFA se selecciona entre los pertenecientes al siguiente grupo: A22, SAT-1, CS8c-1, O, CS8c1p100 y MARL3.

12. Procedimiento de obtención del animal según la reivindicación 7 caracterizado porque la dosis adecuada de VFA se encuentra entre 10 y 10⁷ UFPs de VFA y, más preferentemente, entre 10³ y 10⁶ UFPs de VFA.

13. Procedimiento de obtención del animal según la reivindicación 12 caracterizado porque la dosis adecuada de VFA se encuentra entre 10³ y 10⁶ UFPs de VFA.

14. Procedimiento de obtención del animal según la reivindicación 7 caracterizado porque el animal es un ratón adulto C57BL/6 y la dosis adecuada de VFA utilizada es de 10⁴ UFPs.

15. Procedimiento de obtención del animal según la reivindicación 7 caracterizado porque el animal es un ratón adulto BALB/C y la dosis adecuada de VFA utilizada es de 10⁵ UFPs.

16. Uso del procedimiento de obtención según las reivindicaciones 7 a la 15 para la obtención del animal según las reivindicaciones 1 a la 6.

17. Uso del animal según las reivindicaciones 1 a la 6 y del procedimiento de obtención según las reivindicaciones 7 a la 15 para realizar estudios de la patología del VFA, para estudiar diferencias en la virulencia entre distintas variantes de VFA, para estudiar los determinantes de dicha virulencia, así como para evaluar vacunas y antivirales efectivos contra el VFA.

18. Uso del animal según la reivindicación 17 caracterizado porque consiste en la evaluación de la eficacia de una vacuna frente al virus de la fiebre aftosa que comprende los siguientes pasos:

        a) vacunación de un roedor adulto con una cantidad adecuada de la vacuna a evaluar,

        b) determinación del estado de inmunización del animal,

        c) desafío o infección del animal de b) con una cantidad adecuada del VFA, y

        d) determinación de la eficacia de la vacuna de acuerdo a los niveles de mortalidad entre los animales vacunados y el grupo control (no vacunado).

19. Uso según la reivindicación 18 caracterizado porque la vacuna evaluada es una vacuna de VFA inactiva químicamente.

20. Uso según la reivindicación 18 caracterizado porque la vacuna evaluada es una vacuna atenuada de VFA.