PROCEDIMIENTO DE AMPLIA APLICACION PARA IDENTIFICAR MODULADORES DE RECEPTORES ACOPLADOS A LA PROTEINA G.

Procedimiento para la identificación de un compuesto químico que modifica la acción de al menos una vía de transducción de señales dependiente del receptor acoplado a la proteína G (GPCR) de un organismo biológico,

en donde dicho procedimiento contiene las siguientes etapas de procedimiento:

a) preparación de al menos una célula que contiene al menos una vía de transducción de señales dependiente de un GPCR, en donde se prepara una o más de una proteína G;

b) preparación de al menos un compuesto químico por ensayar;

c) puesta en contacto de una célula de acuerdo con a) con un compuesto químico por ensayar de acuerdo con b);

d) determinación del efecto cuantitativo o cualitativo de un compuesto químico por ensayar de b) sobre la vía de transducción de señales de una célula de a) por medio de una señal medible dependiente de la vía de transducción de señales,

caracterizado porque al menos una proteína G está seleccionada de -6qi4myr o -6qs5myr, en donde "-6qi4" significa que la subunidad a de la proteína G de la clase Gaq lleva una deleción N-terminal de 6 aminoácidos y presenta en el término C una secuencia ai, y en donde "6qs5" significa que la subunidad a de la proteína G de la clase Gas lleva una deleción N-terminal de 6 aminoácidos y que presenta en el término C una secuencia as, y "myr" significa que la correspondiente proteína G en el término amino presenta una secuencia de reconocimiento de miristoilación/palmitoilación MGCC en lugar de la secuencia específica de Gaq MACC

Procedimiento de amplia aplicación para identificar moduladores de receptores acoplados a la proteína G.

La invención se refiere a un procedimiento de amplia aplicación para identificar compuestos químicos que modulan la proteína G de receptores acoplados, por medio de nuevas proteínas híbridas G con una especificidad de receptores muy amplia, así como a compuestos químicos que se pueden identificar por medio de tal procedimiento.

Los receptores acoplados a la proteína G (GPCR, por sus siglas en inglés) juegan un papel importante en una pluralidad de procesos fisiológicos. Representan una de las familias de proteínas más importantes conocidas hasta ahora y se supone que en el genoma humano aproximadamente 1000 genes codifican esta clase de receptores. Los GPCR tienen una estructura característica: Se trata de cadenas peptídicas que se enrollan siete veces en forma de hélices a a través de la capa doble de fosfolípido de la membrana celular, disponiéndose en forma circular. Se estima que aproximadamente el 60% de los medicamentos con venta bajo receta, actualmente disponibles, se unen con los GPCR. Esto destaca el papel importante de esta clase de receptores para la industria investigadora de medicamentos.

Todos los receptores acoplados a la proteína G funcionan según un modelo básico común: La unión de un ligando extracelular lleva a una modificación de la conformación de la proteína del receptor de modo que puede tomar contacto con una proteína G. Las proteínas G ubicadas del lado citoplasmático de la membrana plasmática son los mediadores de la señal extracelular en el interior de la célula y allí pueden provocar diversas reacciones.

Los GPCR representan las proteínas blanco terapéuticas hasta ahora más significativas. Estimativamente, el 40% de los medicamentos prescriptos por el médico actúan como agonistas o antagonistas de los GPCR. En virtud del tamaño y la importancia de la familia de proteínas y en vista al hecho de que para muchos GPCR aún no se conocen pares de unión químicos (GPCR huérfanos), se ha de partir del hecho de que esta clase de receptores será en un futuro uno de los reservorios más importantes para proteínas blanco apropiadas en la búsqueda de nuevos medicamentos.

Los GPCR son proteínas de membrana integrales. Transmiten una señal mediada por una sustancia de señal mayormente hidrofílica que se une en el lado exterior de la célula a través de una familia de proteínas de unión a guanina-nucleótido, llamadas proteínas G, hacia el interior de la célula. En este caso, se desencadenan, en función de la especificidad del receptor y de las proteínas G activadas de esta manera, diversas vías de transducción de señales. Según el tipo de receptor, se producen diversos efectos que tienen como consecuencia la formación de "second messengers". De esta manera, se puede elevar el nivel de cAMP intracelular a través de la activación de una adenilato-ciclasa en posición de membrana o bien se puede reducir en caso de una inhibición. La estimulación de una fosfodiesterasa específica de cGMP puede llevar a la reducción del nivel de cGMP. Por otra parte, la proteína G activada a través de la unión con un canal iónico puede llevar, por ejemplo, al aumento de iones Ca²⁺ o K⁺. Además, a través de una proteína G activada puede producir la activación de una fosfolipasa y, así, la formación de inositol-1,4,5-trisfosfato y diacilglicerol. A su vez, llevan al aumento de Ca²⁺ o a la activación de una proteína quinasa C, con otros efectos en ambos casos. Los second messengers son moléculas mensajeras intracelulares como, por ejemplo, cAMP, cGMP, Ca²⁺ u otras, que desencadenan reacciones en la célula a través de la activación o desactivación de proteínas intracelulares.

Las proteínas G heterotrímeras se encuentran en la cara interna de la membrana plasmática. Están compuestas por las tres subunidades a, ß y ?. Un receptor activado entra en contacto con el heterotrímero de la proteína G que, consiguientemente, lo disocia en una subunidad alfa y un complejo beta-gamma. Tanto la subunidad alfa activada como el complejo beta-gamma pueden influir sobre las proteínas efectoras intracelulares. La familia de la subunidad a de la proteína G se clasifica actualmente en cuatro clases diferentes (clase Gas, Gai, Gaq y Ga12). Los GPCR se clasifican según la proteína G incorporada en la transducción de señales.

Es decir, los GPCR de la clase Gs median, a través de la activación de Gas, la estimulación de la adenilciclasa y elevan la concentración intracelular de AMPc.

Los GPCR de la clase Gi median a través de la activación de Gai una inhibición de la clase de adenilato y reducen los GPCR de cAMP intracelular de la clase Gq que median a través de una activación de Gaq una estimulación de distintas isoformas de PLCß y llevan a una hidrólisis de fosfatidil-inositol-4.5-bisfosfato en posición de membrana en diacilglicerol y trifosfato de inositol (IP3). IP3 libera Ca²⁺ a partir de los depósitos intracelulares.

La mayoría de los GPCRs puede entrar en contacto solamente con una subunidad alfa de la proteína G, es decir, poseen selectividad para una vía determinada de transducción de señales. A los fines de desarrollar un procedimiento con cuya ayuda se han de identificar compuestos químicos que modulan las vías de transducción de señales dependientes de GPCR, esta estrecha especificidad es muy embarazosa. Más allá de ello, tales vías de transducción de señales proporcionan sólo una señal apropiada que se puede aprovechar en un tipo de ensayo con alto rendimiento de muestras (= High Throughput Screening = HTS)), en las que, por ejemplo, la activación de la proteína G lleva al aumento del nivel intracelular de Ca²⁺.

Es posible construir estas proteínas G con especificidad modificada para los receptores y diferente fijación a una vía de transducción de señales mediante la unión de componentes de distintas proteínas G a proteínas G híbridas, a través de métodos de biología molecular y bioquímica.

Las proteínas G híbridas son construcciones de fusión, que unen en el interior de una proteína secuencias de diferentes subunidades Ga. De esta forma, por ejemplo, se puede fabricar un híbrido Gaq/i a través de la fusión de la región de reconocimiento del receptor de Gai con la región de activación del efector de Gaq, capaz de captar señales de receptores acoplados a Gi, pero que conecte la vía de transducción de la señal de Gaq-PLCß. Conklin et al., Nature 363, 274276 (1993) describieron por primera vez un híbrido de este tipo, en el que los 5-aminoácidos C-terminales de Gaq habían sido sustituidos por la correspondiente secuencia Gai (Gaiq5).

Este "reacoplamiento" de receptores tiene la ventaja de que se puede acceder de manera más sencilla al parámetro final del ensayo (elevación de la concentración intracelular de Ca²⁺, comparada con la inhibición de la adenilato-ciclasa) mediante procedimientos técnicos de medición, y se puede utilizar en la Exploración de Alto Rendimiento.

Sin embargo, es desventajoso en estos constructos de fusión Gaq/Gai que algunos GPCR como, pj, el receptor SSTR1 no puedan activar qi5 (Conklin et al., Mol. Pharmacol. 50, 885-890 (1996)).

Asimismo, se describieron constructos de fusión entre Gaq y Gas. También ellos poseen la desventaja de que no todos los receptores acoplados a Gs como, por ejemplo, el receptor adrenérgico ß2 o el receptor de dopamina D1 se pueden unir con la vía de transducción de señales de PLCß.

Además de las modificaciones C-terminales para la modificación de la unión de receptores a determinadas vías de transducción de señales, se describió una modificación N-terminal de Gaq que lleva a una promiscuidad de receptores. Por promiscuidad de receptores, se ha de entender en este caso la capacidad de una proteína G de poder captar y transmitir señales de distintos receptores. Se trata de una proteína Gaq en la que se suprimió la región que comprende 6aa N-terminal altamente conservada; (Kostenis et al., J. Biol. Chem. 272, 19107-19110 (1997)). Esta supresión permite a Gq resultante (también denominado -6q) recibir no sólo señales de Gq, sino también de receptores acoplados con Gs o Gi/o y de transmitirlas a PLCß.

Esta subunidad Ga comprende ahora también receptores como el receptor de SSTR1-somatostatina, el receptor de dopamina D1 y el receptor adrenérgico ß2. Sin embargo, el receptor edg5 también puede no estar comprendido por esta proteína...

1. Procedimiento para la identificación de un compuesto químico que modifica la acción de al menos una vía de transducción de señales dependiente del receptor acoplado a la proteína G (GPCR) de un organismo biológico, en donde dicho procedimiento contiene las siguientes etapas de procedimiento:

caracterizado porque al menos una proteína G está seleccionada de -6qi4myr o -6qs5myr, en donde "-6qi4" significa que la subunidad a de la proteína G de la clase Gaq lleva una deleción N-terminal de 6 aminoácidos y presenta en el término C una secuencia ai, y en donde "6qs5" significa que la subunidad a de la proteína G de la clase Gas lleva una deleción N-terminal de 6 aminoácidos y que presenta en el término C una secuencia as, y "myr" significa que la correspondiente proteína G en el término amino presenta una secuencia de reconocimiento de miristoilación/palmitoilación MGCC en lugar de la secuencia específica de Gaq MACC.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que en la célula, que se pone a disposición según a), se preparan al menos dos proteínas G.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que en la célula, que se pone a disposición según a), se preparan al menos dos proteínas G seleccionadas de -6qi4myr, 6qs5myr, -6qi4, -6qs5 o Galpha16.

4. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula según a) es la célula de una especie de vertebrados, una especie de insectos, una C. elegans o una levadura.

5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la célula es una célula de HeLa, 293, COS, CHO o una célula de Saccharomyces cerevisiae.

6. Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, en el que para determinar el efecto cuantitativo o cualitativo de un compuesto químico por ensayar por medio de una señal medible en función de la vía de transducción de señales de acuerdo con la reivindicación 1 d) se usa la concentración intracelular de Ca²⁺.

7. Procedimiento para la identificación de un medicamento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones 1 a 6.