15603, UN MIEMBRO DE LA FAMILIA DE CANALES IONICOS HUMANOS.

Un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico,

que comprende:

i) poner en contacto un compuesto candidato con la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1; y

ii) ensayar la capacidad del compuesto de inhibir la expresión de la molécula de ácido nucleico, identificando de esta manera un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico

15603, un miembro de la familia de canales iónicos humanos.

Muchos acontecimientos intercelulares e intracelulares dependen de la regulación de la concentración de ciertos iones tales como calcio, sodio, potasio y cloro dentro de la célula. Se han descubierto canales iónicos que regulan el flujo de aniones o cationes a través de una membrana basándose en el voltaje, pH, fosforilación y unión a ligandos. Típicamente, un canal iónico consiste en múltiples dominios transmembrana que forman un canal a través del cual los iones pasan desde un lado de la membrana al otro. Estos canales iónicos pueden jugar papeles importantes en cómo una célula responde a hormonas o neurotransmisores con un aumento de la actividad de enzimas tales como la fosfolipasa C y una elevación posterior en la concentración de calcio libre intracelular (Ca⁺²). El aumento en la concentración de calcio intracelular puede producirse como resultado de la liberación del calcio desde reservas intracelulares así como por una entrada de calcio a través de la membrana plasmática.

Se cree que las proteínas de potencial receptor transitorio (TRP) de Drosophila y algunos homólogos de mamíferos (proteínas TRPC) median la entrada capacitiva de Ca⁺² (Hofmann et al., Nature 397:259-263 (1999)). Se han clonado y caracterizado siete genes homólogos de mamífero (TRPC 1 a TRPC 7). TRPC6, junto con TRPC 3 se han identificado como los primeros miembros de una nueva familia funcional de canales catiónicos que funcionan con segundo mensajero, que se activan por diacilglicerol independientemente de la proteína quinasa C (Hofmann et al., supra). Recientemente se ha demostrado que, probablemente, TRPC6 es el componente esencial del canal catiónico no selectivo activado por el adrenoceptor a1 (a1-AR-NSCC), que puede servir como ruta de entrada de Ca²⁺ independiente de agotamiento de reservas durante el aumento de la actividad simpática. El receptor de andrógenos a1 (a1-AR) se expresa de forma generalizada en el sistema vascular. La estimulación de a1-AR conduce a la activación de la fosfolipasa Cß acoplada a la proteína G, que cataliza la formación a partir del fosfoinosítido de 1, 4, 5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol, que conduce a la liberación del Ca²⁺ almacenado y a la entrada sostenida de Ca²⁺. La presente invención se refiere a una proteína TRP6 humana, 15603.

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de un nuevo miembro de la familia de los canales iónicos, denominado en la presente memoria "15603". La secuencia de nucleótidos que codifica 15603 se muestra en la SEC ID Nº: 1, y la secuencia de aminoácidos de un polipéptido 15603 se muestra en la SEC ID Nº: 2. Además, la secuencia de nucleótidos de la región codificante se representa en la SEC ID Nº: 3.

La invención proporciona métodos para explorar compuestos que modulan la expresión o actividad de los polipéptidos o ácidos nucleicos de 15603.

En un aspecto, la invención proporciona un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico, que comprende: i) poner en contacto un compuesto candidato con la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1; y ii) ensayar la capacidad del compuesto de inhibir la expresión de la molécula de ácido nucleico, identificando de esta manera un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico.

En un aspecto alternativo, la invención proporciona un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico, que comprende: i) poner en contacto un compuesto candidato con un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1 o una célula que expresa el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1; y ii) ensayar la capacidad del compuesto de inhibir la actividad de canal iónico del polipéptido, identificando de esta manera un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico. En una realización, dicho ensayo es un ensayo basado en células y dicho compuesto candidato se pone en contacto con una célula que expresa dicha polipéptido. En realizaciones alternativas, dicho ensayo es un ensayo sin células. En una realización, dicho polipéptido se proporciona como un canal iónico en una membrana plasmática. En una realización, dicho ensayo de la capacidad del compuesto de inhibir la actividad del polipéptido comprende medir el flujo de iones a través de dicho canal iónico. En otra realización, el flujo de iones a través de dicho canal iónico se mide por registro de pinzamiento zonal.

En una realización, los métodos mencionados anteriormente para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico comprenden confirmar la capacidad de un compuesto de ensayo de inhibir la expresión de la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1 o de inhibir el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1 en un modelo animal.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa una secuencia de ADNc (SEC ID Nº: 1) y la secuencia de aminoácidos prevista (SEC ID Nº: 2) de la proteína 15603 humana. También se muestra la fase de lectura abierta iniciada por metionina de la proteína 15603 humana (sin las regiones no traducidas 5' y 3' de la SEC ID Nº: 1) como secuencia codificante, SEC ID Nº: 3.

La Figura 2 representa un gráfico de hidropatía de la proteína 15603 humana. Los restos relativamente hidrófobos se muestran encima de la línea horizontal de trazos, y los restos relativamente hidrófilos están debajo de la línea horizontal de trazos. Los restos de cisteína (cys) se indican por líneas cortas verticales justo por debajo del gráfico de hidropatía. Se indican los números correspondientes a la secuencia de aminoácidos de la proteína 15603 humana - Los polipéptidos de la invención incluyen fragmentos que incluyen: todo o parte de una secuencia hidrófoba, por ejemplo, una secuencia por encima de la línea de trazos, por ejemplo, la secuencia desde aproximadamente el aminoácido 162 al 172, desde aproximadamente el aminoácido 215 al 225, desde aproximadamente el aminoácido 325 al 335, desde aproximadamente el aminoácido 401 al 431, desde aproximadamente el aminoácido 441 al 461, desde aproximadamente el aminoácido 486 al 506, desde aproximadamente el aminoácido 521 al 551, desde aproximadamente el aminoácido 591 al 616, desde aproximadamente el aminoácido 631 al 656, desde aproximadamente el aminoácido 665 al 675, desde aproximadamente el aminoácido 701 al 731, y desde aproximadamente el aminoácido 770 a 780 de la SEC ID Nº: 2; todo o parte de una secuencia hidrófila, por ejemplo, una secuencia por debajo de la línea de trazos, por ejemplo, la secuencia desde aproximadamente el aminoácido 20 al 32, desde aproximadamente el aminoácido 55 al 85, desde aproximadamente el aminoácido 181 al 221, desde aproximadamente el aminoácido 241 al 281, desde aproximadamente el aminoácido 306 al 321, desde aproximadamente el aminoácido 331 al 340, desde aproximadamente el aminoácido 461 al 486, desde aproximadamente el aminoácido 780 al 805, desde aproximadamente el aminoácido 810 al 841, desde aproximadamente el aminoácido 841 al 851, desde aproximadamente el aminoácido 865 al 890, desde aproximadamente el aminoácido 895 al 905, y desde aproximadamente el aminoácido 915 a 931 de la SEC ID Nº: 2; y una secuencia que incluye una Cys, o un sitio de glicosilación.

La Figura 3 representa un alineamiento de la proteína de transporte iónico y dominios de repetición de ank de la proteína 15603 humana con una secuencia de aminoácidos consenso procedente de un modelo oculto de Markov (HMM) a partir de PFAM. La secuencia superior es la secuencia de aminoácidos consenso (SEC ID Nº: 4,5,6) para un dominio de repetición de ank, mientras que la secuencia de aminoácidos inferior corresponde a los aminoácidos 97 a 131, 132 a 163 y 218 a 250 de la SEC ID Nº: 2. También se muestra la secuencia de aminoácidos consenso (SEC ID Nº: 7) para un dominio de proteína de transporte iónico alineada con los aminoácidos 493 a 727 de la SEC ID Nº: 2.

La Figura 4 representa un alineamiento BLAST del dominio del canal iónico de la proteína 15603 humana con una secuencia de aminoácidos consenso de un dominio derivado de la base de datos...

1. Un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico, que comprende:

i) poner en contacto un compuesto candidato con la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1; y

ii) ensayar la capacidad del compuesto de inhibir la expresión de la molécula de ácido nucleico,

identificando de esta manera un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico.

2. Un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico, que comprende:

i) poner en contacto un compuesto candidato con un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1 o una célula que expresa el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1; y

ii) ensayar la capacidad del compuesto de inhibir la actividad de canal iónico del polipéptido,

identificando de esta manera un compuesto capaz de tratar un trastorno angiogénico.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho ensayo es un ensayo basado en células y dicho compuesto candidato se pone en contacto con una célula que expresa dicho polipéptido.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho ensayo es un ensayo sin células.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho polipéptido se proporciona como un canal iónico en una membrana plasmática.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho ensayo de la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de canal iónico del polipéptido comprende medir el flujo de iones a través de dicho canal iónico.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el flujo de iones de través de dicho canal iónico se mide por pinzamiento zonal.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además confirmar la capacidad de un compuesto de ensayo para inhibir la expresión de la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1 o inhibir el polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº: 3 como se muestra en la figura 1 en un modelo animal.