Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España en los últimos 80 años. Clasificación Internacional de Patentes CIP 2013.

VACUNAS CONTRA EL VIRUS NIPAH.

Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen: Vector de expresión de avipox que comprende un polinucleótido que codifica una glicoproteína del virus Nipah; en el que el vector de expresión de avipox es un vector de canarypox.

Solicitante: MERIAL LTD..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 3239 SATELLITE BLVD.,DULUTH, GA 30096.

Inventor/es: AUDONNET, JEAN-CHRISTOPHE FRANCIS.

Fecha de Publicación de la Concesión: 27 de Julio de 2010.

Fecha Concesión Europea: 24 de Marzo de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes: A61K39/155 (..Paramyxoviridae, p. ej. virus de la parainfluenza [3]).

Clasificación PCT: A61K39/155 (..Paramyxoviridae, p. ej. virus de la parainfluenza [3]).

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Descripción:

Vacunas contra el virus Nipah.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a vacunas recombinantes contra el virus Nipah y a la administración de tales vacunas.

Antecedentes de la invención

El virus Nipah es un miembro de la familia de los Paramyxoviridae y está relacionado con el virus Hendra (anteriormente llamado el morbilivirus equino). El virus Nipah se aisló inicialmente en 1999 tras el examen de muestras de un brote de encefalitis y enfermedad respiratoria entre hombres adultos en Malasia y Singapur (véase, por ejemplo, Chua y col., Lancet. 9 de octubre de 1999; 354(9186):1257-9 y Paton y col., Lancet. 9 de octubre de 1999; 354(9186):1253-6). El huésped para el virus Nipah todavía es desconocido, pero se sospecha que los zorros voladores (murciélagos del género Pteropus) son el huésped natural.

Debido a cambios en las condiciones ecológicas, los zorros voladores se están poniendo cada vez más en contacto con seres humanos y animales domesticados. Por tanto, es imaginable que los virus en zorros voladores pueden infectar animales domesticados y seres humanos, lo que podría producir una enfermedad más virulenta, posiblemente fatal. El virus Nipah causó una enfermedad relativamente leve en cerdos en Malasia y Singapur y el virus se transmitió a seres humanos, gatos y perros mediante un contacto íntimo con cerdos infectados.

La infección por el virus Nipah en seres humanos se ha asociado a una encefalitis caracterizada por fiebre y somnolencia y enfermedad del sistema nervioso central más grave tal como coma, convulsiones e incapacidad para mantener la respiración (véase, por ejemplo, Lee y col., Ann Neurol. Septiembre de 1999; 46(3):428-32). La enfermedad por el virus Nipah empieza con 3-14 días de fiebre y cefalea, seguida de somnolencia y desorientación caracterizada por confusión mental. Estos signos y síntomas pueden progresar hasta el coma en el plazo de 24-48 horas. Algunos pacientes tuvieron una enfermedad respiratoria al principio de sus infecciones. La enfermedad nerviosa grave por la encefalitis por el virus Nipah se ha marcado por algunas secuelas tales como convulsiones persistentes y cambios de personalidad. Durante el brote de enfermedad por el virus Nipah en 1998-1999, aproximadamente el 40% de los pacientes con enfermedad nerviosa grave que ingresaron en los hospitales murieron de la enfermedad (véase, por ejemplo, Lam & Chua, Clin Infect Dis. 1 de mayo de 2002; 34 supl. 2:S48-51).

Por consiguiente, un objetivo de la salud animal es la mejora de la salud humana previniendo la transmisión de enfermedades entre animales y/o seres humanos.

La infección por el virus Nipah puede prevenirse evitando animales que se sabe que están infectados y usando dispositivos de equipamiento protector personal apropiados cuando sea necesario ponerse en contacto con animales posiblemente infectados. Se ha mostrado que el fármaco ribavirina es eficaz contra el virus Nipah in vitro, sin embargo, no se han realizado investigaciones controladas de fármacos y la utilidad clínica es incierta.

Si va a desarrollarse un programa eficaz para prevenir o tratar la infección por el virus Nipah será necesario definir los antígenos virales que son importantes en la inducción de respuestas protectoras y para formular posibles tratamientos inmunoprofilácticos. Las glicoproteínas de unión (G) y de fusión (F) del virus Nipah participan como antígenos virales (véase, por ejemplo, Bossart y col., J Virol. Nov de 2002; 76(22):11186-98 y Guillaume y col., J Virol. Enero de 2004; 78(2):834-40). Las glicoproteínas del virus Nipah (G y F) cuando se expresan como recombinantes del virus de la variolovacuna han inducido una respuesta inmunitaria en hámsteres que se protegieron de una exposición letal al virus Nipah (véase, por ejemplo, Guillaume y col., J Virol. Enero de 2004; 78(2):834-40). Sin embargo, se observó que en la inmunización tanto activa como pasiva la respuesta de anticuerpos al virus Nipah estaba fuertemente estimulada, sugiriendo que la eficacia de la inmunización está relacionada con la capacidad de replicación del vector.

Por consiguiente, existe la necesidad en la técnica de una vacuna eficaz y fidedigna contra el virus Nipah en la que proteínas heterólogas se expresan con replicación limitada o no productora.

La mención o identificación de cualquier documento en esta solicitud no es una admisión de que tal documento está disponible como técnica anterior a la presente invención.

Resumen de la invención

La invención se basa, en parte, en el desarrollo de una vacuna recombinante eficaz que inmunice cerdos contra el virus Nipah con un vector de canarypox atenuado que codifica una glicoproteína del virus Nipah de forma que pueda haber expresión de las proteínas heterólogas con replicación limitada o no productora.

La invención se refiere a un vector de expresión del virus canarypox que engloba un polinucleótido que codifica una glicoproteína del virus Nipah. En una realización, la glicoproteína del virus Nipah puede ser la proteína de unión (G). Ventajosamente, el polinucleótido puede comprender la secuencia base de nucleótidos del nucleótido 8943 al nucleótido 10751 de SEQ ID NO: 1 o el polinucleótido codifica el péptido de SEQ ID NO: 8. En otra realización, la glicoproteína del virus Nipah puede ser la proteína de fusión (F). Ventajosamente, el polinucleótido puede comprender la secuencia base de nucleótidos del nucleótido 6654 al nucleótido 8294 de SEQ ID NO: 1 o el polinucleótido codifica el péptido de SEQ ID NO: 7. En todavía otra realización, la glicoproteína del virus Nipah puede ser la proteína de unión (G) y la proteína de fusión (F). Ventajosamente, el polinucleótido puede comprender la secuencia base de nucleótidos del nucleótido 6654 al nucleótido 8294 y la secuencia base de nucleótidos del nucleótido 8943 al nucleótido 10751 de SEQ ID NO: 1 o el polinucleótido codifica el péptido de SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.

El vector de expresión es un vector de canarypox. Ventajosamente, el vector de canarypox puede ser ALVAC.

La invención engloba una formulación para la administración y expresión de una glicoproteína del virus Nipah en la que la formulación puede comprender uno cualquiera de los vectores descritos anteriormente y un soporte, vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable. En una realización, el soporte, vehículo o excipiente puede facilitar la infección y/o mejora la conservación del vector. Se desvela un procedimiento de administración de una glicoproteína del virus Nipah a un animal que comprende administrar una formulación anterior a un animal. Ventajosamente, el animal es un cerdo.

Se desvela un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria en un animal que puede comprender administrar una composición que puede comprender uno cualquiera de los vectores descritos anteriormente en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria. Se desvela un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria en un animal que puede comprender administrar una composición que puede comprender una célula, en el que la célula puede comprender uno cualquiera de los vectores descritos anteriormente en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria. Ventajosamente, el animal es un cerdo.

Se desvela un procedimiento de inducción de una respuesta inmunológica o protectora en un animal que puede comprender administrar una composición que puede comprender uno cualquiera de los vectores descritos anteriormente en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria. Se desvela un procedimiento de inducción de una respuesta inmunológica o protectora en un animal que puede comprender administrar una composición que puede comprender una célula, en el que la célula puede comprender uno cualquiera de los vectores descritos anteriormente en una cantidad eficaz para provocar una respuesta inmunitaria. Ventajosamente, el animal es un cerdo.

También se desvela un kit para realizar cualquiera de los procedimientos anteriormente descritos que comprende cualquiera de las composiciones anteriormente descritas y opcionalmente instrucciones para realizar el procedimiento.

Se observa que en esta divulgación y particularmente en las reivindicaciones y/o párrafos términos tales como "comprende", "comprendía", "que comprende" y similares pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye" y similares; y que términos tales como "que está constituido esencialmente por" y "está constituido esencialmente por" tienen en cuenta elementos enumerados explícitamente.

Breve descripción del dibujo

La siguiente descripción detallada facilitada a modo de ejemplo, pero que no pretende limitar la invención únicamente a las realizaciones específicas descritas, puede entenderse mejor conjuntamente con los dibujos adjuntos, particularmente hasta el punto que tales dibujos se refieren a la presente invención como se define en las reivindicaciones:

La Fig. 1 ilustra secuencias de nucleótidos (Fig. 1A) y de aminoácidos (Fig. 1B) del virus Nipah. Véanse, por ejemplo, nº de registro de GenBank NC_002728, Chua y col., Science. 26 de mayo de 2000; 288(5470):1432-5; Harcourt y col., Virology. 15 de agosto de 2001; 287(1):192-201; Chan y col., J Gen Virol. Sept de 2001; 82(Pt 9):2151-5 y Chua y col., Microbes Infect. Feb de 2002; 4(2):145-51, cuyas divulgaciones se incorporan por referencia en su totalidad.

La Fig. 2 ilustra la construcción del plásmido pSL-6802-1-4. La Fig. 2A es un mapa de las regiones codificantes del virus Nipah. La Fig. 2B ilustra los oligonucleótidos de PCR para la amplificación del gen de Nipah G. La Fig. 2C ilustra la construcción de pSL-6802-1-4. La Fig. 2D es la secuencia de nucleótidos de los brazos izquierdo y derecho y el casete de expresión con traducción del gen del virus Nipah G.

La Fig. 3 ilustra la construcción del plásmido pSL-6802-2-5. La Fig. 3A ilustra los oligonucleótidos de PCR para la amplificación del gen de Nipah G. La Fig. 3B ilustra la construcción de pSL-6802-2-5. La Fig. 3C es la secuencia de nucleótidos de los brazos izquierdo y derecho y el casete de expresión con traducción del gen del virus Nipah G.

La Fig. 4 ilustra la construcción del plásmido pSL-6839-1. La Fig. 4A es un mapa del virus Nipah y el antígeno de vacuna. La Fig. 4B ilustra los oligonucleótidos de PCR para la amplificación del gen de Nipah F. La Fig. 4C ilustra la construcción de pSL-6839-1. La Fig. 4D es la secuencia de nucleótidos de los brazos izquierdo y derecho y el casete de expresión con traducción del gen del virus Nipah F.

La Fig. 5 ilustra la construcción del plásmido pSL-6851-29. La Fig. 5A ilustra los oligonucleótidos de PCR para la amplificación del gen de Nipah F. La Fig. 5B es un diagrama de plásmidos de pSL-6851-29. La Fig. 5C es la secuencia de nucleótidos de los brazos izquierdo y derecho y el casete de expresión con traducción del gen del virus Nipah F.

La Fig. 6 ilustra una transferencia de Western de Nipah G. El carril 1 era el sobrenadante de ALVAC, el carril 2 era el sobrenadante de vCP2199 (Nipah G de ALVAC), el carril 3 era el sobrenadante de vCP2199 (Nipah G de ALVAC), el carril 4 era el sobrenadante de viruela aviar, el carril 5 era el sobrenadante de vFP2200 (Nipah G de viruela aviar), el carril 6 era el sobrenadante de vFP2200 (Nipah G de viruela aviar), el carril 7 era los marcadores (177,6, 113,9, 81,2, 60,7, 47,4, 36,1, 25,3, 19,0, 14,7, 6,1 kDa), el carril 8 era el sedimento de ALVAC, el carril 9 era el sedimento de vCP2199, el carril 10 era el sedimento de vCP2199, el carril 11 era el sedimento de viruela aviar, el carril 12 era el sedimento de vFP2200 y el carril 13 era el sedimento de vFP2200.

La Fig. 7 ilustra una inmunotransferencia de Nipah F. La Fig. 7A se transfirió con antisuero de cobaya. La Fig. 7B se transfirió con antisuero porcino. El gel nº 1 era los recombinantes de Nipah F (sólo sedimentos). El carril 1 era un espacio, el carril 2 era viruela aviar, el carril 3 era vFP2207, el carril 4 era vFP2207, el carril 5 era un espacio, el carril 6 era ALVAC, el carril 7 era cvCP2208, el carril 8 era un marcador de 170, 130, 100, 72, 55, 40, 33, 24 kDa y los carriles 9 y 10 eran espacios. El gel nº 2 era los recombinantes de Nipah F (sólo sobrenadante). El carril 1 era un espacio, el carril 2 era viruela aviar, el carril 3 era vFP2207, el carril 4 era vFP2207, el carril 5 era un marcador de 170, 130, 100, 72, 55, 40, 33, 24 kDa, el carril 6 era un espacio, el carril 7 era ALVAC, el carril 8 era un espacio, el carril 9 era vCP2208 y el carril 10 era un espacio.

Descripción detallada

La invención se basa, en parte, en el desarrollo de una vacuna recombinante eficaz contra el virus Nipah. La invención se refiere a una vacuna contra el virus Nipah.

Un gen del virus Nipah se codifica en un vector de expresión, el gen del virus Nipah codifica una glicoproteína. En una realización particularmente ventajosa, el gen del virus Nipah codifica la glicoproteína de unión (G). En otra realización particularmente ventajosa, el gen del virus Nipah codifica la glicoproteína de fusión (F).

El vector de expresión es un vector de canarypox. En una realización particularmente ventajosa, el vector es un vector de canarypox atenuado. Ventajosamente, el vector de canarypox atenuado es ALVAC.

La proteína del virus Nipah codificada por el vector de expresión es una glicoproteína. En una realización particularmente ventajosa, la proteína del virus Nipah es la glicoproteína de unión (G), ventajosamente con la secuencia de SEQ ID NO: 8. En otra realización particularmente ventajosa, la proteína del virus Nipah es la glicoproteína de fusión (F), ventajosamente con la secuencia de SEQ ID NO: 7.

En una realización particularmente ventajosa de la invención, los constructos recombinantes son el constructo de ALVAC que expresa Nipah G denominado vCP2199, el constructo de ALVAC que expresa Nipah F denominado vCP2208.

Las proteínas del virus Nipah incluyen en general proteína de nucleocápside (ventajosamente SEQ ID NO.: 2), fosfoproteína (ventajosamente SEQ ID NO: 3), proteína V (ventajosamente SEQ ID NO: 4), proteína C (ventajosamente SEQ ID NO: 5), proteína de matriz (ventajosamente SEQ ID NO: 6) o polimerasa (ventajosamente SEQ ID NO: 9).

Los términos "proteína", "péptido", "polipéptido" y "fragmento de polipéptido" se usan indistintamente en este documento para referirse a polímeros de residuos de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados o análogos de aminoácidos, y puede estar interrumpido por restos químicos distintos de aminoácidos. Los términos también engloban un polímero de aminoácido que ha sido modificado naturalmente o mediante intervención; por ejemplo, formación de enlaces de disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación tal como conjugación con un componente de marcado o bioactivo.

El gen del virus Nipah usado en la invención codifica una glicoproteína. En una realización particularmente ventajosa, el gen del virus Nipah codifica la glicoproteína de unión (G), ventajosamente los nucleótidos 8943 a 10751 de SEQ ID NO: 1. En otra realización particularmente ventajosa, el gen del virus Nipah codifica la glicoproteína de fusión (F), ventajosamente los nucleótidos 6654 a 8294 de SEQ ID NO: 1.

Los genes del virus Nipah incluyen en general proteína de nucleocápside (ventajosamente los nucleótidos 113 a 1711 de SEQ ID NO: 1), fosfoproteína (ventajosamente los nucleótidos 2406 a 4535 de SEQ ID NO: 1), proteína V (ventajosamente los nucleótidos 2406 a 3775 de SEQ ID NO: 1), proteína C (ventajosamente los nucleótidos 2428 a 2928 de SEQ ID NO: 1), proteína de matriz (ventajosamente los nucleótidos 5108 a 6166 de SEQ ID NO: 1) o polimerasa (ventajosamente los nucleótidos 11259 a 18213 de SEQ ID NO: 1).

Un "polinucleótido" es una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud que contiene desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y análogos en cualquier combinación. Los polinucleótidos pueden tener estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. El término "polinucleótido" incluye moléculas bicatenarias, monocatenarias y helicoidales triples. A menos que se especifique o se requiera lo contrario, cualquier realización de la invención descrita en este documento que sea un polinucleótido engloba tanto la forma bicatenaria como cada una de las dos formas complementarias conocidas o predichas para preparar la forma bicatenaria de cualquiera de ADN, ARN o molécula híbrida.

A continuación se dan ejemplos no limitantes de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas y cebadores de ácidos nucleicos. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de unión tales como fluororibosa y tiolato, y ramas de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos pueden modificarse adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación, con un componente de marcado. Otros tipos de modificaciones incluidas en esta definición son fundas, sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen naturalmente con un análogo e introducción de medios para unir el polinucleótido a proteínas, iones metálicos, componentes de marcado, otros polinucleótidos o soporte sólido.

Un polinucleótido o polipéptido "aislado" es uno que está sustancialmente libre de los materiales con los que está asociado en su entorno nativo. Por sustancialmente libre se indica que al menos el 50%, ventajosamente al menos el 70%, más ventajosamente al menos el 80% e incluso más ventajosamente al menos el 90% está libre de estos materiales.

La invención comprende además una hebra complementaria a un polinucleótido de la glicoproteína del virus Nipah.

La hebra complementaria puede ser polimérica y de cualquier longitud y puede contener desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y análogos en cualquier combinación.

Las reacciones de hibridación pueden realizarse en condiciones de diferentes "rigurosidad". Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son muy conocidas. Véase por ejemplos, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook y col. 1989). Ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden de rigurosidad creciente): temperaturas de incubación de 25ºC, 37ºC, 50ºC y 68ºC; concentraciones de tampón de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC (en las que SSC es NaCl 0,15 M y tampón de citrato 15 mM) y su equivalente usando otros sistemas de tampón; concentraciones de formamida del 0%, 25%, 50% y 75%; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 o más etapas de lavado; tiempos de lavado de 1, 2 ó 15 minutos; y disoluciones de lavado de 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC, o agua desionizada.

La invención engloba adicionalmente polinucleótidos que codifican variantes y derivados funcionalmente equivalentes de glicoproteínas del virus Nipah y fragmentos funcionalmente equivalentes de los mismos que pueden potenciar, disminuir o no afectar significativamente las propiedades de los polipéptidos así codificados. Estas variantes, derivados y fragmentos funcionalmente equivalentes muestran la capacidad de conservar la actividad de una glicoproteína del virus Nipah. Por ejemplo, cambios en una secuencia de ADN que no cambian la secuencia de aminoácidos codificada, además de aquellos que dan como resultado sustituciones conservativas de residuos de aminoácidos, una o algunas deleciones o adiciones de aminoácidos y sustitución de residuos de aminoácidos por análogos de aminoácidos son los que no afectarán significativamente las propiedades del polipéptido codificado. Las sustituciones conservativas de aminoácidos son glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutámico; serina/treonina/metionina; lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina/triptófano.

Para los fines de la presente invención, la identidad u homología de secuencias se determina comparando las secuencias cuando se alinean de manera que se maximice el solapamiento y la identidad a la vez que se minimizan los huecos de secuencias. En particular, la identidad de secuencias puede determinarse usando cualquiera de varios algoritmos matemáticos. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matemático usado para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990; 87: 2264-2268, modificado como en Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90: 5873-5877.

Otro ejemplo de un algoritmo matemático usado para comparar secuencias es el algoritmo de Myers & Miller, CABIOS 1988; 4: 11-17. Un algoritmo tal se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de software de alineamiento de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos puede usarse una tabla de pesos de residuos PAM120, una penalización de longitud por hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Todavía otro algoritmo útil para identificar regiones de similitud y alineamiento de secuencias locales es el algoritmo FASTA como se describe en Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988; 85: 2444-2448.

Ventajoso para uso según la presente invención es el software WU-BLAST (Washington University BLAST) versión 2.0. Los programas ejecutables de versión 2.0 de WU-BLAST para varias plataformas UNIX pueden descargarse de ftp://blast.wustl.edu/blast/executables. Este programa se basa en la versión 1.4 de WU-BLAST que a su vez se basa en la versión 1.4 de NCBI-BLAST de dominio público (Altschul & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed., Methods in Enzymology 266: 460, 480; Altschul y col., Journal of Molecular Biology 1990; 215: 403-410; Gish & States, 1993; Nature Genetics 3: 266-272; Karlin & Altschul, 1993; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877; incorporándose todos por referencia en este documento).

En general, la comparación de secuencias de aminoácidos se lleva a cabo alineando una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de una estructura conocida con la secuencia de aminoácidos del polipéptido de estructura desconocida. Entonces se comparan los aminoácidos en las secuencias y se agrupan juntos los grupos de aminoácidos que son homólogos. Este procedimiento detecta regiones conservadas de los polipéptidos y representa inserciones y deleciones de aminoácidos. La homología entre secuencias de aminoácidos puede determinarse usando algoritmos comercialmente disponibles (véase también la descripción de homología anteriormente). Además de aquellos mencionados de otro modo en este documento, también se hace mención a los programas BLAST, BLAST con huecos, BLASTN, BLASTP y PSI-BLAST proporcionados por el Centro nacional de información biotecnológica. Estos programas se usan ampliamente en la técnica para este fin y pueden alinear regiones homólogas de dos secuencias de aminoácidos.

En todos los programas de búsqueda en el conjunto, las rutinas de alineamiento con huecos son esenciales para la propia búsqueda en la base de datos. Los huecos pueden desconectarse si se desea. La penalización por defecto (Q) para un hueco de longitud uno es Q = 9 para proteínas y BLASTP y Q = 10 para BLASTN, pero puede cambiarse a cualquier número entero. La penalización por residuo por defecto para extender un hueco (R) es R = 2 para proteínas y BLASTP y R = 10 para BLASTN, pero puede cambiarse a cualquier número entero. Puede usarse cualquier combinación de valores para Q y R con el fin de alinear secuencias de manera que se maximice el solapamiento y la identidad a la vez que se minimizan los huecos por secuencia. La matriz de comparación de aminoácidos por defecto es BLOSUM62, pero pueden utilizarse otras matrices de comparación de aminoácidos tales como PAM.

Alternativa o adicionalmente, el término "homología" o "identidad", por ejemplo, con respecto al nucleótido o secuencia de aminoácidos, puede indicar una medición cuantitativa de homología entre dos secuencias. La homología de secuencias en porcentaje puede calcularse como (Nref - Ndif)*100/Nref, en la que Ndif es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y en la que Nref es el número de residuos en una de las secuencias. Por tanto, la secuencia de ADN AGTCAGTC tendrá una identidad de secuencias del 75% con la secuencia AATCAATC (Nref = 8; Ndif = 2).

Alternativa o adicionalmente, "homología" o "identidad" con respecto a secuencias puede referirse al número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido entre el número de nucleótidos o aminoácidos en la secuencia más corta de las dos secuencias pudiendo determinarse el alineamiento de las dos secuencias según el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 1983;80:726, incorporado en este documento por referencia), por ejemplo, usando un tamaño de ventana de 20 nucleótidos, una longitud de palabra de 4 nucleótidos y una penalización por hueco de 4, y el análisis asistido por ordenador y la interpretación de los datos de secuencias que incluye el alineamiento pueden realizarse convenientemente usando programas comercialmente disponibles (por ejemplo, IntelligeneticsTM Suite, Intelligenetics Inc. CA). Cuando se dice que las secuencias de ARN son similares o tienen un grado de identidad de secuencias u homología con las secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual al uracilo (U) en la secuencia de ARN. Por tanto, las secuencias de ARN están dentro del alcance de la invención y pueden derivarse de secuencias de ADN considerándose la timidina (T) en la secuencia de ADN igual al uracilo (U) en las secuencias de ARN.

Y, sin demasiada experimentación, el experto puede consultar muchos otros programas o referencias para determinar la homología en porcentaje.

La invención engloba adicionalmente una glicoproteína del virus Nipah contenida en la molécula de vector o vector de expresión de la invención y operativamente ligada a un elemento potenciador y/o promotor si es necesario. En una realización ventajosa, el promotor es un promotor de citomegalovirus (CMV). En otra realización, los potenciadores y/o promotores incluyen diversos promotores específicos de células o tejidos, diversos promotores y potenciadores virales y diversas secuencias de ADN del virus Nipah isogénicamente específicas para cada especie animal.

Un "vector" se refiere a un ADN recombinante o plásmido de ARN o virus que comprende un polinucleótido heterólogo que va a administrarse a una célula diana, tanto in vitro como in vivo. El polinucleótido heterólogo puede comprender una secuencia de interés para los fines de terapia y opcionalmente puede estar en forma de un casete de expresión. Un vector no necesita poder replicarse en la célula o sujeto diana definitivo. El término incluye vectores de clonación para la traducción de una secuencia codificadora de polinucleótidos. También se incluyen vectores virales.

El término "recombinante" significa un polinucleótido de ADNc genómico, semisintético, o de origen sintético que o bien no se produce en la naturaleza o bien está ligado a otro polinucleótido en una disposición no encontrada en la naturaleza.

"Heterólogo" significa derivado de una entidad genéticamente distinta del resto de la entidad con la que está comparándose. Por ejemplo, un polinucleótido puede colocarse mediante técnicas de ingeniería genética en un plásmido o vector derivado de una fuente diferente, y es un polinucleótido heterólogo. Un promotor eliminado de su secuencia codificante nativa y operativamente ligado a una secuencia codificante distinta de la secuencia nativa es un promotor heterólogo.

Los polinucleótidos de la invención pueden comprender secuencias adicionales tales como secuencias codificantes adicionales dentro de la misma unidad de transcripción, elementos de control tales como promotores, potenciador, sitios de unión de ribosomas, sitios de poliadenilación, terminador de la transcripción, unidades de transcripción adicionales bajo el control del mismo promotor o uno diferente, secuencias que permiten la clonación, expresión, recombinación homóloga y transformación de una célula huésped, y cualquier constructo tal que pueda desearse para proporcionar realizaciones de esta invención.

Elementos para la expresión de la glicoproteína del virus Nipah están ventajosamente presentes en un vector inventivo. De una manera mínima, esto comprende, está constituido esencialmente por o está constituido por un codón de iniciación (ATG), un codón de terminación y un promotor, y opcionalmente también una secuencia de poliadenilación para ciertos vectores tales como vectores de plásmido y ciertos vectores virales, por ejemplo, vectores virales distintos del virus de la viruela y un terminador de la transcripción para virus de la viruela. Cuando el polinucleótido codifica un fragmento de poliproteína, por ejemplo, una proteína del virus Nipah, ventajosamente, en el vector está colocado un ATG en 5' del marco de lectura y un codón de terminación está colocado en 3'. Pueden estar presentes otros elementos para controlar la expresión tales como secuencias de potenciadores, secuencias estabilizadoras y secuencias señal que permiten la secreción de la proteína.

Los procedimientos para preparar y/o administrar un vector o recombinantes o plásmido para la expresión de productos génicos de genes de la invención tanto in vivo como in vitro pueden ser cualquier procedimiento deseado, por ejemplo, un procedimiento que es por o análogo a los procedimientos desvelados en o desvelados en documentos citados en: las patentes de EE.UU. nº 4.603.112; 4.769.330; 4.394.448; 4.722.848; 4.745.051; 4.769.331; 4.945.050; 5.494.807; 5.514.375; 5.744.140; 5.744.141; 5.756.103; 5.762.938; 5.766.599; 5.990.091; 5.174.993; 5.505.941; 5.338.683; 5.494.807; 5.591.639; 5.589.466; 5.677.178; 5.591.439; 5.552.143; 5.580.859; 6.130.066; 6.004.777; 6.130.066; 6.497.883; 6.464.984; 6.451.770; 6.391.314; 6.387.376; 6.376.473; 6.368.603; 6.348.196; 6.306.400; 6.228.846; 6.221.362; 6.217.883; 6.207.166; 6.207.165; 6.159.477; 6.153.199; 6.090.393; 6.074.649; 6.045.803; 6.033.670; 6.485.729; 6.103.526; 6.224.882; 6.312.682; 6.348.450 y 6.312.683; la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 920.197 presentada el 16 de octubre de 1986; los documentos WO 90/01543; W091/11525; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 98/33510; EP 265785; EP 0 370 573; Andreansky y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:11313-11318; Ballay y col., EMBO J. 1993; 4:3861-65; Felgner y col., J. Biol. Chem. 1994; 269:2550-2561; Frolov y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:11371-11377; Graham, Tibtech 1990; 8:85-87; Grunhaus y col., Sem. Virol. 1992; 3:237-52; Ju y col., Diabetologia 1998; 41:736-739; Kitson y col., J. Virol. 1991; 65:3068-3075; McClements y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:11414-11420; Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:11341-11348; Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:11349-11353; Pennock y col., Mol. Cell. Biol. 1984; 4:399-406; Richardson (Ed), Methods in Molecular Biology 1995; 39, "Baculovirus Expression Protocols", Humana Press Inc.; Smith y col. (1983) Mol. Cell. Biol. 1983; 3:2156-2165; Robertson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:11334-11340; Robinson y col., Sem. Immunol. 1997; 9:271; y Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93:11307-11312. El vector en la invención es un vector del virus canarypox. Las proteínas del virus no Nipah o fragmentos de las mismas, citocinas, etc., pueden expresarse mediante un vector o vectores en o incluidos en las composiciones de la invención.

La citocina o citocinas pueden estar en forma de proteína en la composición inmunogénica o de vacuna o pueden coexpresarse en el huésped con el inmunógeno o inmunógenos o epítope(s) de la misma. Se da preferencia a la coexpresión de la citocina o citocinas tanto por el mismo vector que expresa el inmunógeno o inmunógenos o epítope(s) de la(s) misma(s) como por un vector separado de la misma.

La(s) citocina(s) puede(n) elegirse de: interleucina 18 (IL-18), interleucina 12 (IL-12), interleucina 15 (IL-15), MIP-1a (proteína inflamatoria de macrófagos 1a; Marshall E. y col., Br. J. Cancer, 1997, 75 (12), 1715-1720), GM-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos). Preferentemente se hace uso de citocinas de las especies que van a vacunarse; es decir, ventajosamente, la citocina se aparea con las especies diana o huésped y obsérvese, por ejemplo, GM-CSF porcino (S. Inumaru y col. Immunol. Cell Biol. 1995, 73(5), 474-476), GM-CSF canino (ejemplo 8 del documento WO00/77043), GM-CSF felino (ejemplo 9 del documento WO00/77043).

El documento WO00/77210 proporciona la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos que se corresponden con GM-CSF equino permitiendo la producción de GM-CSF in vitro y la construcción de vectores (por ejemplo, plásmidos y vectores virales) la expresión de GM-CSF equino in vivo.

La presente invención también se refiere a preparaciones de los vectores de la invención. Las preparaciones pueden comprender, estar constituidas esencialmente por o están constituidas por uno o más vectores, por ejemplo, vectores de expresión tales como vectores de expresión in vivo que comprenden, están constituidos esencialmente o están constituidos por (y que expresan ventajosamente) uno o más de polinucleótidos del virus Nipah y ventajosamente el vector contiene y expresa un polinucleótido que incluye, está constituido esencialmente por o está constituido por una región codificante que codifica una proteína del virus Nipah, ventajosamente una glicoproteína del virus Nipah en un soporte, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable. Por tanto, según una realización de la invención, el otro vector o vectores en la preparación comprende, está constituido esencialmente por o está constituido por un polinucleótido que codifica, y bajo circunstancias apropiadas el vector expresa una o varias proteínas de una glicoproteína del virus Nipah o un fragmento de la mismas.

Según otra realización, el vector o vectores en la preparación comprende o está constituido esencialmente por o está constituido por polinucleótido(s) que codifica(n) una o más proteínas o fragmento(s) de las mismas de una proteína del virus Nipah, ventajosamente una glicoproteína del virus Nipah. La preparación inventiva comprende ventajosamente, está constituida esencialmente por o está constituida por al menos dos vectores que comprenden, están constituidos esencialmente por o están constituidos por y que ventajosamente también expresan ventajosamente in vivo bajo condiciones apropiadas o condiciones adecuadas o en una célula huésped adecuada polinucleótidos de diferentes cepas aisladas de virus Nipah que codifican las mismas proteínas y/o proteínas diferentes, pero ventajosamente las mismas proteínas. En cuanto a las preparaciones que contienen uno o más vectores que contienen, están constituidos esencialmente por o están constituidos por polinucleótidos que codifican y que ventajosamente expresan ventajosamente in vivo una proteína del virus Nipah, ventajosamente una glicoproteína del virus Nipah, o un epítope de la misma, es ventajoso que los productos de expresión sean de dos, tres o más cepas aisladas de virus Nipah diferentes, ventajosamente cepas. La invención también se refiere a mezclas de vectores que contienen, están constituidas esencialmente por o están constituidas por la codificación y expresan diferentes proteínas del virus Nipah.

El vector de la invención es un vector de avipox que contiene una glicoproteína del gen del virus Nipah siendo el vector de avipox un vector de canarypox, ventajosamente un vector de canarypox atenuado tal como ALVAC. Los virus canarypox atenuados se describen en la patente de EE.UU. nº 5.756.103 (ALVAC) y el documento WO01/05934.

Según la invención, el vector de poxvirus es un vector del virus canarypox, ventajosamente un virus canarypox atenuado. A este respecto, el canarypox está disponible de la ATCC bajo el número de registro VR-111. Los virus canarypox atenuados se describen en la patente de EE.UU. nº 5.756.103 (ALVAC) y el documento WO01/05934.

Para información sobre el procedimiento para generar recombinantes del mismo y cómo administrar recombinantes del mismo, el experto puede referirse al documento WO90/12882 y a la patente de EE.UU. nº 5.756.103, entre otros.

En el caso de canarypox, ventajosamente el sitio o sitios de inserción son el (los) ORF C3, C5 y/o C6; véanse también los documentos citados en este documento.

Ventajosamente, el polinucleótido que va a expresarse se introduce bajo el control de un promotor de poxvirus específico; aquél puede incluir el promotor de la variolovacuna de 7,5 kDa (Cochran y col., J. Virology, 1985, 54, 30-35), el promotor de la variolovacuna I3L (Riviere y col., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434), el promotor de la variolovacuna HA (Shida, Virology, 1986, 150, 451-457), el promotor de la viruela vacuna ATI (Funahashi y col., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47), el promotor de la variolovacuna H6 (Tailor J. y col., Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. y col. J. Virol., 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. y col., J. Virol., 1989, 63, 3829-3836), entre otros.

Para la vacunación de mamíferos, el vector de expresión es un canarypox. De esta forma puede haber expresión de las proteínas heterólogas con replicación limitada o no productora.

En términos más generales, el promotor tiene o bien un origen viral o uno celular. Un promotor viral fuerte distinto de CMV-IE que puede emplearse útilmente en la práctica de la invención es el promotor temprano/tardío del virus SV40 o el promotor de LTR del virus del sarcoma de Rous. Un promotor celular fuerte que puede emplearse útilmente en la práctica de la invención es el promotor de un gen del citoesqueleto tal como, por ejemplo, el promotor de desmina (Kwissa M. y col., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344) o el promotor de actina (Miyazaki J. y col., Gene, 1989, 79, 269-277).

En la práctica de la invención pueden usarse subfragmentos funcionales de estos promotores, es decir, porciones de estos promotores que mantienen una actividad promotora adecuada, por ejemplo, promotores de CMV-IE truncados según la solicitud PCT nº WO98/00166 o la patente de EE.UU. nº 6.156.567. Por consiguiente, un promotor usado en la práctica de la invención incluye derivados y subfragmentos de un promotor de longitud completa que mantienen una actividad promotora adecuada y por tanto la función como promotor, preferentemente actividad promotora sustancialmente similar a la del promotor real o de longitud completa del que se deriva el derivado o subfragmento, por ejemplo, con respecto a la actividad de los promotores de CMV-IE truncados de la patente de EE.UU. nº 6.156.567 respecto a la actividad de promotores de CMV-IE de longitud completa. Por tanto, un promotor de CMV-IE usado en la práctica de la invención puede comprender o está constituido esencialmente por o está constituido por la porción de promotor del promotor de longitud completa y/o la porción de potenciador del promotor de longitud completa, además de derivados y subfragmentos.

Según otra realización de la invención, los vectores de expresión son vectores de expresión usados para la expresión in vitro de proteínas en un sistema de células apropiado. La producción de proteínas puede tener lugar por la transfección de células de mamífero mediante replicación o expresión sin replicación productora de vectores virales en células de mamífero o células aviares, o por replicación de baculovirus (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.745.051; Vialard J. y col., J. Virol., 1990 64 (1), 37-50; Verne A., Virology, 1988,167,56-71), por ejemplo, virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica AcNPV, en células de insecto (por ejemplo, células Sf9 de Spodoptera frugiperda, ATCC CRL 1711; véanse también las patentes de EE.UU. nº 6.228.846, 6.103.526). Las células de mamífero que pueden usarse son ventajosamente células de hámster (por ejemplo, CHO o BHK-21) o células de mono (por ejemplo, COS o VERO). Las proteínas expresadas pueden recogerse en o del sobrenadante de cultivo después, o no después de la secreción (si no hay secreción normalmente se produce o se realiza una lisis de células), opcionalmente concentrarse por procedimientos de concentración tales como ultrafiltración y/o purificarse por medios de purificación tales como procedimientos de cromatografía de afinidad, de intercambio iónico o de tipo filtración en gel.

Un experto en la materia entiende que las condiciones para cultivar una célula huésped varían según el gen particular y que a veces se necesita experimentación rutinaria para determinar las condiciones óptimas para cultivar una glicoproteína del virus Nipah dependiendo de la célula huésped. Una "célula huésped" denota una célula procariota o eucariota que ha sido modificada genéticamente o que puede modificarse genéticamente mediante la administración de un polinucleótido exógeno tal como un vector recombinante. Cuando se hace referencia a células genéticamente modificadas, el término se refiere tanto a la célula originalmente modificada como a la progenie de la misma.

Los polinucleótidos que comprenden una secuencia deseada pueden introducirse en un vector de clonación o de expresión adecuado y el vector puede introducirse a su vez en una célula huésped adecuada para la replicación y amplificación. Los polinucleótidos pueden introducirse en general en células huésped mediante cualquier medio conocido en la técnica. Los vectores que contienen polinucleótidos de interés pueden introducirse en la célula huésped mediante cualquiera de varios medios apropiados que incluyen captación directa, endocitosis, transacción, apareamiento de f, electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAR-dextrano u otras sustancias; bombardeo con microproyectiles; lipofección; e infección (cuando el vector es infeccioso, por ejemplo, un vector retroviral). La elección de introducir vectores o polinucleótidos dependerá frecuentemente de las características de la célula huésped.

Va a llevarse a cabo la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una formulación de la invención para la administración y expresión de una glicoproteína del virus Nipah a una célula diana. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz es experimentación rutinaria para un experto en la materia. La formulación comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que expresa una glicoproteína del virus Nipah y un soporte, vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable. En una realización ventajosa, el soporte, vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable facilita la transfección y/o mejora la conservación del vector o proteína.

Los soportes o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables son muy conocidos para un experto en la materia. Por ejemplo, un soporte o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una disolución al 0,9% de NaCl (por ejemplo, solución salina) o un tampón de fosfato. Otros soportes o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables que pueden usarse para los procedimientos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, poli-(L-glutamato) o polivinilpirrolidona. Los soportes o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables pueden ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que facilitan la administración del vector (o proteína expresada de un vector inventivo in vitro); ventajosamente, el soporte, vehículo o excipiente puede facilitar la transfección y/o mejorar la conservación del vector (o proteína). Las dosis y los volúmenes de dosis se tratan en este documento en la descripción general y también pueden ser determinadas sin demasiada experimentación por un experto a partir de esta divulgación leída conjuntamente con el conocimiento en la técnica.

Los lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario son ventajosamente, pero no exclusivamente, adecuados para uso con plásmidos, son ventajosamente aquellos que tienen la siguiente fórmula:


en la que R1 es un radical alifático de cadena lineal saturado o insaturado que tiene 12 a 18 átomos de carbono, R2 es otro radical alifático que contiene 2 ó 3 átomos de carbono y X es una amina o grupo hidroxilo, por ejemplo DMRIE. En otra realización, el lípido catiónico puede asociarse a un lípido neutro, por ejemplo, DOPE.

Entre estos lípidos catiónicos se da preferencia a DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradeciloxi)-1-propanoamonio; documento WO96/34109) ventajosamente asociado a un lípido neutro, ventajosamente DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina; Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389) para formar DMRIE-DOPE.

Si está presente DOPE, la relación molar de DMRIE:DOPE es ventajosamente aproximadamente 95: aproximadamente 5 a aproximadamente 5: aproximadamente 95, más ventajosamente aproximadamente 1: aproximadamente 1, por ejemplo, 1:1.

La relación en peso de adyuvante de DMRIE o DMRIE-DOPE:plásmido puede estar entre aproximadamente 50: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 10, tal como aproximadamente 10: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 5, y ventajosamente aproximadamente 1: aproximadamente 1 y aproximadamente 1: aproximadamente 2, por ejemplo, 1:1 y 1:2.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse directamente in vivo y el producto codificado expresarse por el vector en el huésped. Los procedimientos de administración in vivo del vector que codifica la glicoproteína del virus Nipah (véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 6.423.693; publicaciones de patente EP 1052286, EP 1205551, publicación de patente de EE.UU. 20040057941, documento WO 9905300 y Draghia-Akli y col., Mol Ther. 2002 Dec; 6(6):830-6) pueden modificarse para administrar una glicoproteína del virus Nipah de la presente invención. Un experto en la materia puede llevar a cabo la administración in vivo de un vector que codifica una glicoproteína del virus Nipah descrito en este documento.

Ventajosamente, las composiciones y/o formulaciones farmacéuticas y/o terapéuticas según la invención comprenden o están constituidas esencialmente por o están constituidas por una cantidad eficaz para provocar una respuesta terapéutica de uno o más de los vectores de expresión de la invención; una cantidad eficaz puede determinarse sin demasiada experimentación a partir de esta divulgación y el conocimiento en la técnica.

Las composiciones y vacunas inmunogénicas según la invención pueden comprender uno o más adyuvantes. Los adyuvantes particularmente adecuados para uso en la práctica de la presente invención son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, anhídrido maleico y polímeros de derivados de alquenilo, (2) secuencias inmunoestimulantes (ISS) tales como secuencias de oligodesoxirribonucleótidos que tienen una o más unidades de CpG no metiladas (Klinman D. M. y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1996, 93, 2879-2883; WO98/16247), (3) una emulsión de aceite en agua tal como la emulsión SPT descrita en la pág. 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la pág. 183 de la misma obra, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, (5) citocinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio u (7) otros adyuvantes tratados en cualquier documento citado e incorporado por referencia en la presente solicitud, o (8) cualquier combinación o mezcla de los mismos.

La emulsión de aceite en agua (3) que es especialmente apropiada para vectores virales puede basarse en:

- aceite de parafina líquida ligera (tipo farmacopea europea).
- aceite de isoprenoide tal como escualano, escualeno,
- aceite resultante de la oligomerización de alquenos, por ejemplo, isobuteno o deceno,
- ésteres de ácidos o alcoholes que tienen un grupo alquilo de cadena lineal tales como aceites vegetales, oleato de etilo, propilenglicol, di(caprilato/caprato), tri(caprilato/caprato) de glicerol y dioleato de propilenglicol, o
- ésteres de alcoholes o ácidos grasos ramificados, especialmente ésteres de ácido isoesteárico.

El aceite se usa en combinación con emulsionantes para formar una emulsión. Los emulsionantes pueden ser tensioactivos no iónicos tales como:

- ésteres de, por una parte, sorbitano, manida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), glicerol, poliglicerol o propilenglicol y, por otra parte, ácidos oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, estando dichos ésteres opcionalmente etoxilados,
- bloques de copolímeros de polioxipropileno-polioxietileno tales como Pluronic, por ejemplo, L121.

Entre los polímeros de adyuvante de tipo (1) se da preferencia a polímeros de ácido acrílico o metacrílico reticulado, especialmente reticulados por éteres de polialquenilo de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos se conocen por el nombre carbómero (Pharmeuropa, vol. 8, nº 2, junio de 1996). Un experto en la materia también puede referirse a la patente de EE.UU. nº 2.909.462 que proporciona tales polímeros acrílicos reticulados por un compuesto polihidroxílico que tiene al menos tres grupos hidroxilo, preferentemente no más de ocho de tales grupos, estando los átomos de hidrógeno de al menos tres grupos hidroxilo sustituidos con radicales alifáticos insaturados que tienen al menos dos átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados también pueden contener otros sustituyentes tales como metilo. Son especialmente adecuados los productos comercializados con el nombre Carbopol (BF Goodrich, Ohio, EE.UU.). Están reticulados por alilsacarosa o por alilpentaeritritol. Entre ellos se hace referencia a Carbopol 974P, 934P y 971 P.

En cuanto a los copolímeros de anhídrido maleico- derivados de alquenilo se da preferencia a EMA (Monsanto), que son copolímeros de etileno-anhídrido maleico de cadena lineal o reticulados y, por ejemplo, están reticulados por éter divinílico. También se hace referencia


a J. Fields y col., Nature 186: 778-780, 4 de junio de 1960.

Con respecto a la estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y EMA están preferentemente formados por unidad básicas que tienen la siguiente fórmula:

en la que:

- R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, representan H o CH3
- x = 0 ó 1, preferentemente x = 1
- y = 1 ó 2, con x + y = 2.

Para EMA, x = 0 y y = 2 y para carbómeros x = y = 1.

Estos polímeros son solubles en agua o disolución salina fisiológica (20 g/l de NaCl) y el pH puede ajustarse a 7,3 a 7,4, por ejemplo, mediante sosa (NaOH) para proporcionar la disolución de adyuvante en la que puede incorporarse el (los) vector(es) de expresión. La concentración de polímero en la composición de vacuna final puede oscilar entre el 0,01 y el 1,5% en peso/volumen, ventajosamente del 0,05 al 1% en peso/volumen y preferentemente del 0,1 al 0,4% en peso/volumen.

En una realización ventajosa, las composiciones y/o formulaciones farmacéuticas y/o terapéuticas según la invención se administran mediante inyección tal como, pero no se limita a, inyección intramuscular (IM), intradérmica (ID) o subcutánea (SC).

Por tanto, a propósito de una composición terapéutica tal, de la divulgación en este documento y del conocimiento en la técnica el experto puede determinar sin demasiada experimentación el número de administraciones, la vía de administración y la dosis que va a usarse para cada protocolo de inyección.

En una realización ventajoso, la vacuna recombinante puede administrarse a un cerdo o infectar o transfectarse en células en una cantidad de aproximadamente al menos 103 ufp; más preferentemente aproximadamente 104 ufp a aproximadamente 1010 ufp, por ejemplo, aproximadamente 105 ufp a aproximadamente 109 ufp, por ejemplo aproximadamente 106 ufp a aproximadamente 108 ufp, por dosis, por ejemplo, por 2 ml de dosis. En una realización particularmente ventajosa, la dosis es aproximadamente 108 ufp por dosis.

El procedimiento incluye al menos una administración a un animal de una cantidad eficaz de la composición terapéutica de la invención. El animal puede ser macho, hembra, hembra embarazada y recién nacido. Esta administración puede hacerse particularmente por inyección intramuscular (IM), intradérmica (ID) o subcutánea (SC) o mediante administración intranasal o por vía oral. En una realización ventajosa, la composición terapéutica según la invención puede administrarse mediante una jeringa o un aparato sin aguja (como, por ejemplo Pigjet, Biojector o Vitajet (Bioject, Oregon, EE.UU.)). Otra solución para administrar el plásmido es usar electroporación, véanse, por ejemplo S. Tollefsen y col. Vaccine, 2002, 20, 3370-3378; S. Tollefsen y col. Scand. J. Immunol., 2003, 57, 229-238; S. Babiuk y col., Vaccine, 2002, 20, 3399-3408; solicitud PCT nº WO99/01158.

La invención se refiere a composiciones farmacéuticas para uso en la vacunación de animales contra la infección por el virus Nipah. En una realización particular, las composiciones farmacéuticas que comprenden Nipah F y Nipah G según la presente invención se usan para vacunar animales contra infecciones producidas por virus Nipah. En una realización ventajosa, el animal es un cerdo. En otras realizaciones ventajosas, el animal es un gato, perro, caballo o ser humano.

También se desvela un procedimiento para prevenir la transmisión del virus Nipah entre un primer animal y un segundo animal que comprende inmunizar o provocar una respuesta inmunitaria en un primer animal usando cualquiera de los procedimientos descritos en este documento para evitar la transmisión de la enfermedad al segundo animal. En una realización particular, las composiciones farmacéuticas que comprenden Nipah F y Nipah G según la presente invención se usan para vacunar dichos primeros animales contra infecciones producidas por virus Nipah. En una realización ventajosa, el primer animal es un cerdo. El segundo animal es un gato, un perro o un caballo, ventajosamente un ser humano.

También se proporciona un kit para realizar cualquiera de los procedimientos anteriormente descritos que comprende cualquiera de las composiciones de la invención y opcionalmente instrucciones para realizar el procedimiento.

La invención se describirá ahora adicionalmente a modo de ejemplo. Tales pueden tomarse como ilustrativos de la presente invención en tanto que estén relacionado con vectores del virus canarypox que codifican una glicoproteína del virus Nipah. Otra materia de los ejemplos se proporciona sólo para información.

Ejemplos

Ejemplo 1

Constructos

Construcción del plásmido pSL-6802-1-4. pSL-6802-1-4 comprende las secuencias flanqueantes del locus C5, el promotor de la variolovacuna H6 y el gen del virus Nipah G para generar VCP2199. El virus Nipah se aisló de CSF humano. El gen de Nipah G se amplificó por PCR y se insertó en el plásmido pTM1 generando Nipah G de pTM1. El fin era construir un plásmido donante de Nipah G de pC5 H6p para la generación de un recombinante de virus canarypox de ALVAC que expresa Nipah G. El nombre del plásmido era Nipah G de pC5 H6p, pSL-6802-1-4. El esqueleto del plásmido era pCXL-148-2, comprendiendo pC5 H6p el promotor de la variolovacuna H6, correspondiéndose los brazos izquierdo y derecho al locus C5 de inserción. El plásmido pCXL-148-2 se deriva del plásmido pNVQH6C5LSP-18 mediante una única mutación de base de T a C en el brazo derecho de C5. El plásmido pNVQH6C5LSP-18 se describe en S. Loosmore y col., documento US2005/0031641.

El gen de Nipah G se amplificó por PCR usando Nipah G de pTM1 como molde y los cebadores 11470.SL y 11471.SL (Fig. 2B). El fragmento de PCR de ~1,8 kb se clonó en pCR2.1 generando el clon pSL-6771-1-1 (Nipah G de pCR2.1 H6p) que se confirmó por análisis de secuencias (Fig. 2C). El fragmento de Nipah G de Nru I-Xho I H6p de ~1,8 kb de pSL-6771-1-1 se clonó en pCXL-148-2 (pC5 H6p) generando pSL-6802-1-4 (Nipah G de pC5 H6p) que se confirmó por análisis de secuencias (FIGS. 2C y 2D).

Construcción del plásmido pSL-6802-2-5. pSL-6802-2-5 comprende las secuencias flanqueantes del locus F8, el promotor de la variolovacuna H6 y el gen del virus Nipah G para generar VFP2200. El virus Nipah se aisló de CSF humano. El gen de Nipah G se amplificó por PCR y se insertó en el plásmido pTM1 generando Nipah G de pTM1. El fin era construir un plásmido donante de Nipah G de pF8 H6p para la generación de un recombinante de viruela aviar que expresa Nipah G. El nombre del plásmido era Nipah G de pF8 H6p, pSL-6802-2-5. El esqueleto del plásmido era pSL-6427-2-1, comprendiendo pF8 H6p el promotor de H6, los brazos izquierdo y derecho del locus F8 de inserción. El plásmido pSL-6427-2-1 se deriva del plásmido pSL-5440-5-1 mediante una única mutación de base de C a T en el brazo izquierdo de F8. El plásmido pSL-5440-5-1 se describe en S. Loosmore y col., documento US2005/0031641.

El gen de Nipah G se amplificó por PCR usando Nipah G de pTM1 como molde y los cebadores 11470.SL y 11471.SL (Fig. 3A). El fragmento de PCR de ~1,8 kb se clonó en pCR2.1 generando el clon pSL-6771-1-1 (Nipah G de pCR2.1 H6p) que se confirmó por análisis de secuencias (Fig. 3 B). El fragmento de Nipah G de Nru I-Xho I H6p de ~1,8 kb de pSL-6771-1-1 se clonó en pSL-6427-2-1 (pF8 H6p) generando pSL-6802-2-5 (Nipah G de pF8 H6p) que se confirmó por análisis de secuencias (FIGS. 3B y 3C).

Construcción del plásmido pSL-6839-1. pSL-6839-1 comprende las secuencias flanqueantes del locus F8, el promotor de la variolovacuna H6 y el gen del virus Nipah F para generar VFP2207. El virus Nipah se aisló de CSF humano. El gen de Nipah F se amplificó por PCR y se insertó en el plásmido pTM1 generando Nipah F de pTM1. El fin era construir un plásmido donante de Nipah F de pF8 H6p para la generación de un recombinante de viruela aviar que expresa Nipah F. Nombre del plásmido: Nipah F de pF8 H6p, pSL-6839-1. El esqueleto del plásmido era pSL-6427-2-1, comprendiendo pF8 H6p el promotor de la variolovacuna H6, los brazos izquierdo y derecho del locus F8 de inserción.

Hubo una secuencia de T5NT interna en Nipah F que se eliminó por mutagénesis dirigida al sitio. Se amplificó por PCR un fragmento que codificaba el extremo 3' del promotor de H6 y el extremo 5' del gen de Nipah F usando los cebadores 11457.SL y 11458.SL. En el fragmento amplificado se eliminó la secuencia de T5NT y se introdujo un sitio Apa I para fines de clonación (Fig. 4B). El fragmento se clonó en pCR2.1 generando pSL-6797-3-1 (Nipah F en 5' de pCR2.1 H6p, no T5NT) que se confirmó por análisis de secuencias (Fig. 4C). El fragmento de Nipah F en 3' se amplificó por PCR usando los cebadores 11456.SL y 11459.SL. En el fragmento amplificado se eliminó la secuencia de T5NT y se introdujo un sitio Apa I para fines de clonación (Fig. 4B). El fragmento se clonó en pCR2.1 generando pSL-6797-4-1 (Nipah F en 3' de pCR2.1, no T5NT) que se confirmó por análisis de secuencias (FIGS. 4C). El fragmento Nipah F en 5' de Nru I-BamH I H6p de ~0,7kb de pSL-6797-3-1 se introdujo en pSL-6427-2-1 (pF8 H6p) generando pSL-6830-1 (Nipah F en 5' de pF8 H6p). El fragmento Nipah F en 3' de Apa I-BamH I de ~1,0 kb de pSL-6797-4-1 se introdujo entre Apa I y Bam H I de pSL-6830-1 generando pSL-6839-1 (Nipah F de pF8 H6p) que se confirmó por análisis de secuencias (FIGS. 4C y 4D).

Construcción del plásmido pSL-6851-29. pSL-6851-29 comprende las secuencias flanqueantes del locus C5, el promotor de la variolovacuna H6 y el gen del virus Nipah F para generar VCP2208. El virus Nipah se aisló de CSF humano. El gen de Nipah F se amplificó por PCR y se insertó en el plásmido pTM1 generando Nipah F de pTM1. El fin era construir un plásmido donante de Nipah F de pC5 H6p para generar un recombinante del virus canarypox de ALVAC que expresa Nipah F. El nombre del plásmido era pSL-6851-29, Nipah F de pC5 H6p. El esqueleto del plásmido era pCXL-148-2, comprendiendo pC5 H6p el promotor de la variolovacuna H6, el brazo izquierdo y el brazo derecho del locus C5 de inserción.

Hubo una secuencia de T5NT interna en Nipah F que se eliminó por mutagénesis dirigida al sitio. Un fragmento que codifica el extremo 3' del promotor de H6 y el extremo 5' del gen de Nipah F se amplificó por PCR usando los cebadores 11457.SL y 11458.SL. En el fragmento amplificado se eliminó la secuencia de T5NT y se introdujo un sitio Apa I para fines de clonación (Fig. 5A). El fragmento se clonó en pCR2.1 generando pSL-6797-3-1 (Nipah F en 5' de pCR2.1 H6p, no T5NT), que se confirmó por análisis de secuencias (Fig. 5B). El fragmento de Nipah F en 3' se amplificó por PCR usando los cebadores 11456.SL y 11459.SL. En el fragmento amplificado se eliminó la secuencia de T5NT y se introdujo un sitio Apa I para fines de clonación (Fig. 5A). El fragmento se clonó en pCR2.1 generando

Reivindicaciones:

1. Vector de expresión de avipox que comprende un polinucleótido que codifica una glicoproteína del virus Nipah; en el que el vector de expresión de avipox es un vector de canarypox.

2. Vector de expresión de avipox de la reivindicación 1, en el que la glicoproteína del virus Nipah es la proteína de unión (G).

3. Vector de expresión de avipox de la reivindicación 1, en el que la glicoproteína del virus Nipah es la proteína de fusión (F).

4. Vector de expresión de avipox de la reivindicación 1, en el que la glicoproteína del virus Nipah es la proteína de unión (G) y la proteína de fusión (F).

5. Vector de expresión de avipox de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el vector de expresión de avipox es un vector de expresión de avipox atenuado.

6. Vector de canarypox de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el vector de canarypox es ALVAC.

7. Vector de expresión de la reivindicación 1, en el que el vector de expresión es vCP2199.

8. Vector de expresión de la reivindicación 1, en el que el vector de expresión es vCP2208.

9. Formulación para la administración y expresión de una glicoproteína del virus Nipah, en la que la formulación comprende el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un soporte, vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable.

10. Formulación de la reivindicación 9, en la que el soporte, vehículo o excipiente facilita la transfección y/o mejora la conservación del vector.






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