Método para identificación de inhibidores contra el virus del dengue.

Método para identificación de inhibidores contra los serotipos 1, 2, 3 ó 4 del virus del dengue por cribado de compuestos químicos o bibliotecas de compuestos químicos que comprende:

a) poner aproximadamente 1000 a 2000 células Vero o células Huh 7.5 en contacto con un compuesto químico,

b) añadir virus del dengue a dichas células y compuesto químico del paso a),

c) incubar dichas células, compuesto químico y virus del paso b) a 37ºC hasta que el efecto citopático viral

(CPE) en el control de virus alcanza aproximadamente 100%,

d) añadir enzima luciferasa y sustrato de luciferasa a las células, compuesto, virus,

e) medir la luminiscencia y calcular el valor CE50 que es una medida de la actividad inhibidora del compuesto contra el virus del dengue.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2010/056483.

Solicitante: Janssen R&D Ireland.

Nacionalidad solicitante: Irlanda.

Dirección: Eastgate Village Eastgate, Little Island, County Cork IRLANDA.

Inventor/es: KRAUS,GUENTER, GONG,EDWIN YUNHAO, IVENS,TANIA PAULINE EDUARD, CLYNHENS,MARLEEN, LORY,PEDRO MIGUEL JALES.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/58 (en los que intervienen sustancias marcadas (G01N 33/53 tiene prioridad))
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/50 (Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/66 (en los que interviene una luciferasa)

PDF original: ES-2456365_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Método para identificación de inhibidores contra el virus del dengue.

La presente invención se refiere a un método para identificación de inhibidores contra el virus del dengue, subtipos 1, 2, 3 ó 4 y su uso en un modo de alta capacidad.

La familia Flaviviridae incluye aproximadamente 60 virus de RNA envueltos de cadena positiva, la mayor parte de los cuales son transmitidos por un insecto vector. Muchos miembros de esta familia causan problemas importantes de salud pública en diferentes regiones del mundo. Los genomas de todos los flavivirus secuenciados hasta ahora tienen el mismo orden de genes: 5'-C-preM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3', en los cuales los tres primeros genes codifican las proteínas estructurales de la cápsida (C) , el precursor de la proteína de membrana (prM) y la proteína de la envoltura (E) .

El dengue es una enfermedad viral transmitida por un mosquito que existe en regiones tropicales y subtropicales de todo el mundo. El dengue se caracteriza por fiebre, erupción, dolor de cabeza severo y dolor en las articulaciones. Su tasa de mortalidad es baja. Sin embargo, a largo de las últimas décadas se ha observado una forma más grave del dengue, caracterizada por hemorragia y shock (fiebre hemorrágica del dengue/síndrome del shock del dengue:

DHF/DSS) con frecuencia creciente en niños y adultos jóvenes. El DHF/DSS aparece muy frecuentemente durante la infección por el virus del dengue en individuos infectados previamente con otro serotipo del virus del dengue. Esto ha conducido a la sugerencia de que la mejora inmune de la replicación viral juega un papel en la patogénesis de la forma más grave de la enfermedad.

Las epidemias de dengue son un problema importante de salud pública en muchas áreas tropicales y subtropicales en las que las especies del mosquito vector son abundantes. El control de la fiebre del dengue y del DHF/DSS es una preocupación de salud pública importante. Por esta razón, la WHO ha designado los virus del dengue como una diana de alta prioridad para investigación y desarrollo de vacunas acelerada. A pesar de 40 años de investigación intensiva, no están disponibles vacunas seguras y eficaces para la enfermedad del virus del dengue.

Poco después de su aislamiento en 1944, los virus del dengue se sometieron repetidamente a pasos en cerebro de ratón, dando como resultado la selección de mutantes neurovirulentos en el ratón. Es interesante que estudios realizados en individuos voluntarios demostraron que los mutantes neurovirulentos adaptados al cerebro del ratón de tres cepas de virus del dengue tipo 1 o tipo 2 estaban atenuados, pero eran todavía inmunógenos para los humanos. Sin embargo, los mutantes no fueron desarrollados ulteriormente como cepas de vacunas candidato debido a la preocupación por antígenos del cerebro de ratón en las preparaciones de vacuna. Desde entonces, virus mutantes que: (i) exhibían el fenotipo de tamaño de placa pequeño, y/o (ii) eran sensibles a la temperatura, y/o (iii) estaban adaptados a cultivos celulares derivados de un hospedador no natural (es decir, mutantes de rango del hospedador) han sido seleccionados y evaluados como candidatos para inclusión en una vacuna de virus vivo atenuado. No obstante, a pesar de 25 años de tales esfuerzos, no están disponibles todavía vacunas del dengue seguras y eficaces para uso general. Se ha demostrado que las vacunas completas del virus del dengue desactivado son insuficientemente inmunógenas. Las vacunas de virus vivos atenuados por pasadas seriadas en cultivo de células han adolecido de inestabilidad genética bajo atenuación o inmunogenicidad deficiente.

Los cuatro serotipos de virus del dengue (tipo 1 a tipo 4) pueden distinguirse por neutralización por reducción de placas utilizando anticuerpos monoclonales específicos de serotipo y por tests menos específicos que utilizan sueros policlonales. La existencia de serotipos se descubrió por primera vez durante los primeros estudios en voluntarios humanos, que demostraron que la infección con un serotipo del dengue inducía inmunidad homotípica duradera, mientras que la inmunidad heterotípica duraba sólo 3 a 5 meses. Una vacuna eficaz del dengue que contenga los 4 serotipos a fin de inducir inmunidad general a los virus del dengue en general ayudaría a excluir la aparición del DHF/DSS.

Las secuencias de nucleótidos completas han sido determinadas para los cuatro serotipos del virus del dengue (Ma

ckow, E. et al. (1987) Virology 159:217-228; Zhao, B. et al. (1986) Virology 155:77-88; Osatomi, K. & Sumiyoshi, H. (1990) Virology 176:643-647; lrie, A. et al. (1989) Gene 75:197-211; Mason, P.W. et al. (1987) Virology 161:262-267; Hahn, Y. S. et al. (1988) Virology 162:167-180) . Los resultados de estos estudios indican que los cuatro serotipos del virus del dengue comparten una organización de genoma común. Se encontró que el genoma de la cepa 814.669 del Caribe del dengue tipo 4, contiene 10646 nucleótidos (Mackow, E. et al (1987) Virology

159:217-228; Zhao, B. et al. (1986) Virology 155:77-88) .

Los 101 primeros nucleótidos en el extremo 5' y los 384 últimos en el extremo 3' son regiones no codificantes. La secuencia restante codifica una poliproteína de 3386 aminoácidos que incluye las tres proteínas estructurales, a saber, cápsida (C) , premembrana (prM) , y envoltura (E) , en su término N, seguidas por siete proteínas no estructurales en el orden, arriba proporcionado, que es consistente con todos los genomas de Flavivirus identificados hasta ahora. La poliproteína se procesa para generar 11 o más proteínas virales por peptidasa (s) celulares de señal y por proteasas virales (Markoff, L. (1989) J. Virol, 63:3345-3352; Falgout, B. et al. (1989) J. Virol, 63:1852-1860; Falgout, B. et al. (1991) J. Virol. 65:2467-2476; Hori, H. & Lai, C. J. (1990) J. Virol. 64:4573-4577) .

Debido a la carencia de una vacuna para combatir el virus del dengue y su propagación e infección ulteriores en 5 toda la población mundial, existe una gran necesidad médica de disponer de moléculas químicas pequeñas, tales como compuestos químicos, que pudieran inhibir los serotipos 1-4 del virus del dengue.

Con objeto de poder encontrar tales moléculas químicas pequeñas, es evidentemente necesario un esfuerzo de cribado para testar varios millares y millones de moléculas químicas presentes en una biblioteca de compuestos en cuanto a su aplicación potencial en la inhibición de la replicación y expresión del virus del dengue.

MULIAWAN SYLVIA Y ET Al: "lnhibitor y potential of Quercus lusitanica extract on dengue virus type 2 replication", SOUTHEAST ASIAN JOURNAL OF TROPICAL MEDICINE ANO PUBLIC HEALTH, vol. 37, Supl. 3, enero 2006, p.132-135, dan a conocer un ensayo que implica células C6/36. El efecto inhibidor se determinó por electroforesis en gel 2D.

NOAH ET Al: "A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals", ANTIVIRAL RESEARCH, vol. 73, no. 1, Epub 28.07.2006, p. 50-59, dan a conocer un ensayo en el cual se utilizaron células MDCK.

GONG E ET Al :"Development of robust antiviral assays for profiling compounds against a panel of positive-strand RNA viruses using ATP/Iuminescence readouf”, JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS, vol. 151, no. 1, Epub 22.04.2008, p.121-125, dan a conocer ensayos basados en células que implican células Vero y Vero E6.

Un esfuerzo de cribado puede realizarse únicamente con un ensayo de cribado satisfactorio, rápido y fiable de alta capacidad en el que puedan testarse y analizarse un número muy grande de compuestos químicos en un módulo de alta velocidad.

La presente invención se refiere a un método para identificación de inhibidores contra los serotipos... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para identificación de inhibidores contra los serotipos 1, 2, 3 ó 4 del virus del dengue por cribado de compuestos químicos o bibliotecas de compuestos químicos que comprende: a) poner aproximadamente 1000 a 2000 células Vero o células Huh 7.5 en contacto con un compuesto químico, b) añadir virus del dengue a dichas células y compuesto químico del paso a) , c) incubar dichas células, compuesto químico y virus del paso b) a 37ºC hasta que el efecto citopático viral (CPE) en el control de virus alcanza aproximadamente 100%, d) añadir enzima luciferasa y sustrato de luciferasa a las células, compuesto, virus,

e) medir la luminiscencia y calcular el valor CE50 que es una medida de la actividad inhibidora del compuesto contra el virus del dengue.

2. Método según la reivindicación 1, en donde el virus del dengue es Virus del dengue subtipo 2 y las células son aproximadamente 1500 células Vero.

3. Método según la reivindicación 1, en donde el virus del dengue es Virus del dengue subtipo 1, 3 ó 4 y las 15 células son células Huh 7.5.

4. Método según la reivindicación 1 ó 2, en donde el virus del dengue tiene una multiplicidad de infección (MOI) de 0, 1, 0, 5 o 1, 0, preferiblemente 0, 1.

5. Método según la reivindicación 1 ó 3, en donde el virus del dengue tiene una multiplicidad de infección (MOI) entre 1, 0 y 10, 0, preferiblemente 1, 0 ó 5, 0.

6. Método según la reivindicación 1-5, en donde el paso c) es aproximadamente 5 ó 6 días.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el sustrato de luciferasa es D-luciferina.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el método se realiza en un modo de alta capacidad.