CELULASA DE T. REESEI CON TERMOESTABILIDAD MEJORADA.

Una celulosa mejorada que comprende una secuencia de aminoácido que se ha modificado a partir de una secuencia precursora de aminoácidos que tiene la secuencia de la celulasa EGIII de T.

reesei que se muestra en la Figura 11, comprendiendo dicha modificación una sustitución P201C, numerándose dicho aminoácido como en la Figura 11; en la que la celulasa mejorada tiene una termoestabilidad mejorada en comparación con una celulasa que tiene la secuencia precursora de aminoácidos

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2000/033878.

Solicitante: GENENCOR INTERNATIONAL INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 925 PAGE MILL ROAD PALO ALTO, CALIFORNIA 94304 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: MITCHINSON, COLIN, SHAW, ANDREW, DAY,Anthony,G. .

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 14 de Diciembre de 2000.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N9/00 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas.
  • C12N9/28 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › alfa-amilasa de origen microbiano, p. ej. amilasa bacteriana.
  • C12N9/42 C12N 9/00 […] › actúan sobre los enlaces beta-glucosídicos-1,4, p. ej. celulasa.

Clasificación PCT:

  • C12Q1/00 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones.
  • C12Q1/34 C12Q […] › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una hidrolasa.
  • C12Q1/37 C12Q 1/00 […] › peptidasa o proteinasa.
  • C12Q1/40 C12Q 1/00 […] › amilasa.
  • G01N33/68 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.

Clasificación antigua:

  • C07K14/00 C […] › C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados.

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.


Fragmento de la descripción:

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiera a proteínas mejoradas, y particularmente enzimas, que tienen características de estabilidad alteradas a través del reclutamiento de restos de una proteína homóloga o relacionada. También se describe un potente procedimiento que permite el desarrollo de 5 dichas proteínas mejoradas con gran precisión.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se han practicado de forma extensa procedimientos para mejorar las características funcionales de las proteínas con el fin de mejorar la utilidad de las proteínas en diversas solicitudes. A menudo, dichas técnicas implican el uso de la ingeniería de proteínas y la mutagénesis específica de 10 sitio para aislar y seleccionar restos de aminoácidos específicos que, en base a las propiedades de de los aminoácidos específicos y/o la estructura de la proteína, parecen ser especialmente relevantes o se demuestra que son relevantes a través de evidencias experimentales. Por ejemplo, Estell y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.760.025, sugieren la modificación de enzimas oxidativamente inestables que confieren estabilidad aumentada alterando los restos que son particularmente susceptibles a oxidación, 15 es decir, metionina, lisina, triptófano y cisteína, entre otros. Koths y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.752.585, sugieren un método para mejorar la estabilidad de oxidación de una proteína terapéutica haciendo una sustitución aminoacídica conservativa para cada resto de metionilo susceptible a oxidación con cloramina T. Barr y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.732.973, sugieren sustituir la metionina del sitio activo de 1-antitripsina con un aminoácido oxidativamente estable. 20

Las técnicas adicionales que se han sugerido incluyen modelación por homología de proteínas frente a proteínas evolutivamente cerradas para proporcionar una base para la ingeniería de proteínas. Siezen y col., Protein Engineering, vol. 4, Nº 7, págs. 719-737 (1991) describen una estrategia para mejorar las propiedades de las proteasas usadas en procedimientos industriales incorporando o duplicando características de enzimas más estables en una diana. Además, estas técnicas requieren 25 que se imparta una propiedad de una proteína más deseable a una proteína menos deseable. Sin embargo, en la práctica, la proteína más deseable es la diana para la que se desea desarrollar las características mejoradas. Por lo tanto, no es posible alinear una proteína de este tipo con una más deseable. Esto da pie a los investigadores a buscar técnicas no basadas en el conocimiento para obtener una mejora. 30

Las estrategias de mutación no basadas en el conocimiento se vuelven necesarias cuando hay un falta de información sobre la proteína de interés o cuando fallan las técnicas basadas en el conocimiento. Las técnicas no basadas en el conocimiento típicas comprenden métodos bien conocidos, incluyendo mutagénesis aleatoria, PCR propenso a error y técnicas de transposición en el patrón de PCR, así como desarrollos más recientes, tales como la transposición descrita en Steamer y col., 35 Patente de Estados Unidos Nº 5.605.793. La mutagénesis aleatoria se ha usado durante muchos años con diversos niveles de éxito divulgados a lo largo de la bibliografía. Sin embargo, la mutagénesis aleatoria es una estrategia de acierto o fallo debido al gran número de mutantes posibles. Por ejemplo, una proteína de 300 aminoácidos tiene un número posible de mutantes aleatorios del orden de 30020. Preparar, expresar y detectar un gran número de mutantes de este tipo, incluso usando las técnicas de 40 detección actuales, es imposible. Las técnicas de evolución dirigida, tales como "transposición génica" como se describe por Stemmer u otras técnicas de desarrollo molecular se limitan por las combinaciones de mutantes disponibles. Sin embargo, las combinaciones de mutantes deben producirse de forma natural o usando mutagénesis aleatoria si el conocimiento sobre la proteína es insuficiente. Sin embargo, esta combinación de variantes se incluye potencialmente para proporcionar una combinación 45 centrada de forma óptima de diversos organismos necesarios para un grado de éxito razonable.

Ha habido un esfuerzo considerable en el campo de la ingeniería de proteínas para producir enzimas más estables. No obstante, dado el inmenso contenido de información presente en muchas proteínas importantes, deben desarrollarse procedimientos mejorados para enfocar de forma inteligente un conjunto de moléculas mutantes hacia un efecto específico para aprovechar al máximo la 50 gama de diversidad biológica. Según se describe a continuación, los inventores de la presente invención han desarrollado una nueva técnica de mutagénesis basada en el conocimiento que prevé excelentes probabilidades con relación a la producción de nuevas proteínas que tienen un rendimiento mejorado, es

decir, características funcionales. Gracias a la práctica de la técnica de la presente invención, es posible para un investigador desarrollar un conjunto centrado de mutantes a partir de los cuales se facilita la selección de una proteína "ganadora" deseable.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Al hacer frente el problema de mejorar el rendimiento de las proteínas con respecto a una 5 propiedad funcional específica, los investigadores a menudo se enfrentan a obstáculos significativos en cuanto a la determinación de las mutaciones apropiadas para hacer en una proteína. La falta de estructuras cristalinas de muchas proteínas y la incertidumbre involucrada en alineamientos de baja homología con respecto a una proteína comparativa para la que las estructuras cristalinas se conocen, son impedimentos significativos para las estrategias de mutación basadas en el conocimiento. Además, 10 las técnicas de mutagénesis aleatoria u otras estrategias de mutación no basadas en el conocimiento, tales como caldo molecular, a menudo aciertan o fallan proposiciones que requieren la exploración de números masivos de mutantes que incluso no garantizan que ocurra la mutagénesis óptica. Sin embargo, a menudo el investigador que busca mejorar una cierta característica de una proteína tiene a mano una familia de estructuras primarias relacionadas, la mayor parte de las cuales son inferiores en 15 rendimiento con respecto a la proteína que se busca mejorar. Esto surge naturalmente del hecho de que la mejor proteína a menudo se selecciona como la diana principal. Sin embargo, esta "mejor proteína" tiene fallos significativos, cuya mejora tendría grandes beneficios comerciales o industriales. Por lo tanto, el investigador se queda con el problema de determinar cómo modificar la proteína de forma que no afecte a las propiedades deseables de la proteína diana, pero mejorando otras propiedades. En este 20 contexto, los científicos en este documento determinaron que usando alineamientos con proteínas menos deseables, es decir, enzimas menos estables o menos activas, es posible deducir modificaciones de aminoácidos que tendrán una gran posibilidad de éxito en función de ser aceptadas por la "mejor proteína" y sin trastornar en absoluto las buenas propiedades de la misma. De hecho, a menudo de forma natural ya se ha determinado que la modificación seleccionada trabajará en el procedimiento para 25 el que se destina, la probabilidad de éxito es mucho mayor.

En este documento se describe un procedimiento para obtener proteínas que tienen características funcionales mejoradas, incluyendo, por ejemplo, estabilidad alcalina elevada, estabilidad del pH, estabilidad térmica, estabilidad oxidativa aumentada, actividad catalítica aumentada y unión al sustrato o diana mejorada. 30

Es un objeto de la presente invención proporcionar una proteína, por ejemplo, una enzima, que tiene estabilidad alcalina elevada, estabilidad del pH, estabilidad térmica, estabilidad oxidativa aumentada, actividad catalítica aumentada y unión al sustrato o diana mejorada.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona una celulasa mejorada que comprende una secuencia de aminoácidos que se ha modificado a partir de una secuencia de 35 aminoácidos precursores que tiene la secuencia de la celulasa EGIII de T. reesei mostrada en la Figura 11, comprendiendo dicha modificación una sustitución P201C, numerándose dicho aminoácido como en la Figura 11; en la que la celulasa mejorada tiene termoestabilidad aumentada en comparación con una celulasa que tiene...

 


Reivindicaciones:

1. Una celulosa mejorada que comprende una secuencia de aminoácido que se ha modificado a partir de una secuencia precursora de aminoácidos que tiene la secuencia de la celulasa EGIII de T. reesei que se muestra en la Figura 11, comprendiendo dicha modificación una sustitución P201C, numerándose dicho aminoácido como en la Figura 11; en la que la celulasa mejorada tiene una 5 termoestabilidad mejorada en comparación con una celulasa que tiene la secuencia precursora de aminoácidos.

2. Una secuencia de ADN que codifica una celulasa de acuerdo con la reivindicación 1.

3. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 2. 10

4. Una célula huésped que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 2 o un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 3.

5. Un procedimiento para producir una celulasa de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

(a) modificar una secuencia de ADN que codifica la secuencia precursora de aminoácidos para 15 producir una secuencia de ADN a modificada como se ha definido en la reivindicación 2 que codifica la celulasa mejorada;

(b) expresar la secuencia de ADN modificada en una célula huésped; y

(c) purificar la proteína de celulasa expresada.

6. Uso de una celulasa de acuerdo con la reivindicación 1 en la reducción de una biomasa, 20 productos de limpieza o composiciones para el tratamiento textil.


 

Patentes similares o relacionadas:

PRODUCCIÓN BIOTECNOLÓGICA DE D-DIBOA Y SUS DERIVADOS CLORADOS A PARTIR DE SUS PRECURSORES NITROFENOXIDO-ACETATO, del 7 de Julio de 2020, de UNIVERSIDAD DE CADIZ: Producción biotecnológica de D-Diboa y sus derivados clorados a partir de sus precursores nitrofenoxido-acetato. El área científica al que corresponde la invención es la […]

Agrupación de genes de biosíntesis de carrimicina, del 27 de Mayo de 2020, de Shenyang Fuyang Pharmaceutical Technology Co., Ltd: Agrupación de genes de biosíntesis de carrimicina, que consiste en 44 genes que comprende: 1) cinco genes de policétido sintasa, incluyendo los residuos […]

Microorganismo modificado para la producción optimizada de 2,4-dihidroxibutirato con eflujo de 2,4- dihidroxibutirato aumentado, del 27 de Mayo de 2020, de METABOLIC EXPLORER: Microorganismo Escherichia coli modificado genéticamente para producir 2,4-dihidroxibutirato por fermentación, en el que dicho microorganismo se […]

Transformante, procedimiento de producción del mismo y procedimiento de producción de ácido dicarboxílico C4, del 13 de Mayo de 2020, de JMTC Enzyme Corporation: Un transformante que comprende uno o más genes extraños de uno o más tipos seleccionados del grupo que consiste en un gen de fosfoenolpiruvato carboxiquinasa y un gen de piruvato […]

Variantes de polimerasa, del 6 de Mayo de 2020, de F. HOFFMANN-LA ROCHE AG: Una ADN polimerasa modificada que tiene una actividad ADN polimerasa que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de […]

Fitasa, del 6 de Mayo de 2020, de BASF Enzymes LLC: Un ácido nucleico aislado, recombinante o sintético que codifica un polipéptido que tiene actividad fitasa, en donde el ácido nucleico se selecciona del grupo que […]

Método de amplificación de ADN circular, del 22 de Abril de 2020, de OriCiro Genomics, Inc: Un método para amplificar exponencialmente ADN circular mediante la repetición de ciclos de replicación, que comprende una etapa de: formar una […]

Péptidos UBE2T y vacunas que los contienen, del 19 de Febrero de 2020, de ONCOTHERAPY SCIENCE, INC.: Un péptido aislado de menos de 15 aminoácidos capaz de inducir linfocitos T citotóxicos (CTLs), en donde el péptido comprende una secuencia de aminoácidos […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .