Método de producción de alta secreción de proteínas.

Célula huésped de levadura transformada que comprende un ADNc que codifica para la proteína HAC1 activada de levadura y un gen de RRBP1 de humano o perro

, en la que la célula huésped transformada comprende un gen que codifica para una proteína heteromultimérica foránea, en la que la proteína heteromultimérica es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2007/060478.

Solicitante: DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED.

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 3-5-1, Nihonbashi Honcho, Chuo-ku Toyko 103-8426 JAPON.

Inventor/es: SUZUKI, TAKESHI, KOBAYASHI, KAZUO, ICHIKAWA,KIMIHISA, CHIBA,YASUNORI, JIGAMI,YOSHIFUMI, KURODA,KOSUKE, NONAKA,KOICHI.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/10 (Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/28 (contra receptores, antígenos celulares de superficie o determinantes celulares de superficie)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K16/00 (Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/19 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/02 (que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/21 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/15 (modificados por la introducción de material genético extraño)
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Texto extraído del PDF original:

DESCRIPCIÓN

Método de producción de alta secreción de proteínas

Campo técnico

La presente invención se refiere a una célula huésped de levadura transformada y a métodos para producirla, así como a usos de la misma para la producción de proteínas.

Técnica anterior

Hasta la fecha, la producción de proteínas para aplicaciones farmacéuticas por medio de técnicas de recombinación de genes ha implicado principalmente el uso de células animales o células de E. coli como huéspedes. Las células de E. coli permiten la producción de proteínas diana a bajo coste; sin embargo, las células de E. coli no pueden experimentar una modificación tipificada por la modificación de cadenas de azúcar y se producen proteínas inactivas en los cuerpos de inclusión. Esto requiere un proceso de solubilización y, por tanto, las células de E. coli no son adecuadas para procedimientos complicados para la producción de proteínas. Por el contrario, las células animales permiten la producción de proteínas diana como proteínas activas. Sin embargo, de manera desventajosa, el uso de células animales aumentaría extraordinariamente los costes de producción en cuanto a los costes de equipos y de material, debido a operaciones de producción y cultivo de células animales que requieren mucho tiempo.

Entre las proteínas, se han usado anticuerpos como productos farmacéuticos durante mucho tiempo. Dado que derivaban de fuentes distintas a los humanos, se producían de nuevo anticuerpos frente a los anticuerpos administrados. Por tanto, tales anticuerpos no podían administrarse más de una vez y el uso de los mismos era restringido. En los últimos años se ha hecho posible la producción de un anticuerpo humanizado en el que una secuencia de aminoácidos distinta del sitio de unión a antígeno se ha sustituido por una secuencia derivada de un anticuerpo humano. Además, se ha hecho posible la producción de un ratón productor de anticuerpo humano en el que se ha introducido un gen de anticuerpo humano. Por tanto, la aplicación de anticuerpos como productos farmacéuticos pasó a ser extensa. En la actualidad, tales anticuerpos se producen mediante células cultivadas, tales como células CHO, en las que se han introducido genes que codifican para hibridomas o anticuerpos. Sin embargo, tal producción es problemática en cuanto al coste, la productividad, la seguridad y similares.

En los últimos años, se ha intentado la producción de proteínas para aplicaciones farmacéuticas con el uso de levadura, con el propósito de complementar los inconvenientes descritos anteriormente. Sin embargo, básicamente ninguno de tales intentos se ha llevado al uso práctico. En lo que respecta a anticuerpos que tienen estructuras complicadas, en particular, hay ejemplos de expresión de Fab, un anticuerpo de cadena sencilla (ScFv) o similares (Biosci. Biotechnol. Biochem., 64: 2138-2144, 2000). Sin embargo, la productividad es muy baja en cuanto a un anticuerpo de longitud completa (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 8678-8682, 1988). Recientemente se notificó un ejemplo de producción de anticuerpos con el uso de levadura (Pichia pastoris) que produce una cadena de azúcar de unión a N de mamífero (Nature Biotechnology, 24: 210-215, 2006), aunque este informe no hace referencia al rendimiento. Por tanto, la producción de alto nivel de anticuerpos en levadura es difícil. Se considera que las causas de esto son la capacidad de secreción insuficiente de la levadura, la degradación provocada por proteasas, o similares.

Como medios para resolver tales problemas, se propuso un método que implica el uso de una cepa deficiente en proteasa (Enzyme and Microbial Technology, 26: 671-677, 2000; Protein Expr. Purif., 20: 485-491, 2000, Biosci. Biotechnol. Biochem., 66: 628-631, 2002). Los inventores también han desarrollado un método de uso de una proteasa, que es una proteasa A (PEP4), proteasa B (PRB1), o cepa deficiente en gen de yapsina (YPS1), para inhibir la degradación de un anticuerpo (documento WO 2003/091431). Como método para mejorar la productividad de proteínas por medio de la introducción de genes, se notificó un método para mejorar la productividad de ScFv permitiendo la coexpresión de partes de chaperonas moleculares que ayudan en la formación de estructuras tridimensionales de proteínas en el retículo endoplásmico, tal como BiP (KAR2)/PDI (Nat. Biotechnol. 16: 773-777, 1998), aunque este método simplemente produce un fragmento de un anticuerpo de cadena sencilla.

Además se han desarrollado y se han usado muchos promotores inducibles o constitutivos para producir proteínas foráneas. Sin embargo, cuando se permite la expresión a altos niveles de genes que codifican para proteínas foráneas con el uso de promotores potentes en células o cuando se producen proteínas que tienen menor probabilidad de plegarse, se produce agregación en el retículo endoplásmico (ER) y las proteínas resultantes pueden acumularse en ocasiones en las células. Además, las proteínas secretoras y proteínas de membrana se traducen en proteínas, se incorporan al retículo endoplásmico inmediatamente después, se someten a una modificación dada, y luego se transfieren al aparato de Golgi. En tal caso, en ocasiones pueden acumularse proteínas desplegadas en el retículo endoplásmico por algún motivo. Esto se denomina “estrés del retículo endoplásmico”. Los ejemplos de causas para estrés del retículo endoplásmico de este tipo incluyen alteración en la modificación (por ejemplo, adición de una cadena de azúcar o un enlace disulfuro) que se produce en el retículo endoplásmico y transporte deteriorado desde el retículo endoplásmico. Las células de mamífero tienen un mecanismo de “respuesta de proteínas desplegadas (UPR)” como medio para reaccionar frente a tal estrés del retículo endoplásmico. Por ejemplo, las proteínas acumuladas en el retículo endoplásmico se protegen mediante la inhibición de la transcripción, la aceleración del plegamiento inducida mediante chaperonas moleculares, la degradación de proteínas desnaturalizadas o la muerte celular por medio de apoptosis.

Como genes que regulan la UPR, se conocen genes de células animales IRE1-XBP1, PERK-eIF-2 y ATF6. En el caso de la levadura, Ire1p-Hac1p es el único gen que se conoce como gen de este tipo, y el gen Ire1p-Hac1p está asociado con la UPR mediante el mecanismo mostrado a continuación (véase la figura 1). En primer lugar, Ire1p se une generalmente a una proteína de unión a cadena pesada de anticuerpo (BiP). Sin embargo, cuando se produce una proteína desplegada (UFP), BiP se une a tal UFP. Ire1p disociada de BiP se activa por medio de autofosforilación o dimerización, y presenta actividad endonucleasa. Aunque el gen HAC1 está generalmente en un estado inactivado, Ire1p que tiene actividad endonucleasa somete el ARNm transcrito del gen HAC1 a corte y empalme y produce Hac1p activa (Cell, 87: 405-413, 1996; Cell, 90: 1031-1039, 1997; the EMBO Journal, 18: 3119- 3132, 1999). Tal Hac1p activa migra al núcleo, actúa como factor de transcripción y promueve la expresión de genes que codifican para diversas proteínas asociadas con una serie de reacciones denominadas UPR, por ejemplo, la adición de cadena de azúcar asociada, el plegamiento de proteínas, la degradación de proteínas (degradación asociada a ER: ERAD), la separación de proteínas, el metabolismo de lípidos, o similares (Cell, 101: 249-258, 2000).

En lo que respecta a un intento por mejorar la productividad de proteínas foráneas utilizando Hac1p activada, existe un ejemplo en el que el gen que codifica para Hac1p activada de una bacteria filamentosa, es decir, Trichoderma

reesei, se introduce en S. cerevisiae para mejorar la secreción de una proteína heterogénea, -amilasa, y una proteína endógena, es decir, invertasa, (Appl. Environ. Microbiol. 69: 2065-2072, 2003). Sin embargo, un única proteína, -amilasa o invertasa, se ha conocido como proteína que se secreta fácilmente, y la mejora en la cantidad de producción es de tan sólo aproximadamente dos veces la cantidad de producción antes de la mejora. En los últimos años, se ha notificado que un fragmento de anticuerpo, Fab, se produjo usando Pichia pastoris en una cepa en la que se había introducido únicamente el gen HAC1 activado (Biotechnology and Bioengineering, 94: 353-361). La mejora de la productividad por medio de la introducción del gen HAC1 activado es de tan sólo aproximadamente 1,3 veces.

Al mismo tiempo, se conoce un ejemplo en el que únicamente se introduce el gen de RRBP1 (proteína de unión al ribosoma 1, receptor del ribosoma, proteína p180) derivada de mamífero en una cepa de levadura, de modo que se quintuplica la cantidad de proteínas (inhibidor de tripsina pancreática bovina (BPTI)) secretadas (The Journal of Cell Biology, 146: 273-284, 1999). En primer lugar se aisló el gen de RRBP1 de un perro como gen que codifica para una proteína que se une al ribosoma (Nature, 346: 540-544, 1990). RRBP1 tiene un peso molecular de 180 kDa y una estructura especial tal, que una secuencia que comprende 10 residuos de aminoácido en el lado N-terminal se repite 54 veces y esta región se une a un ribosoma. Se sabe que RRBP1 está implicada en el aumento de la estructura de membrana y en la estabilización de ARNm (the Journal of Cell Biology, 130: 29-39, 1995; the Journal of Cell Biology, 156: 993-1001, 2002). Un ejemplo satisfactorio en el BPTI mencionado anteriormente tiene un peso molecular de 6.500, lo que representa un péptido muy pequeño. Tales resultados no pueden aplicarse siempre a otras proteínas de alto peso molecular o agregados de proteínas compuestos por diferentes proteínas tales como la cadena ligera o cadena pesada de anticuerpos.

Se sabe que el gen de proteína O-manosiltransferasa (PMT) está asociado con la formación de cadenas de O- azúcar que son inherentes a levaduras o mohos. El producto génico de PMT se localiza en la membrana del ER y tiene actividad de añadir manosa a un residuo hidroxilo de serina (Ser) o treonina (Thr) de una proteína secretora (a continuación en el presente documento, tal actividad se denominará actividad PMT). Algunas proteínas a las que se les han añadido cadenas de azúcar mediante PMT sirven como componentes primarios de la pared de cepa de levadura como manoproteínas. Se sabe que, cuando disminuye extremadamente la actividad PMT, la pared celular se vuelve frágil y el crecimiento de las células se ve afectado.

En lo que respecta a los genes de PMT, se conoce la existencia de siete genes, es decir, PMT1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7, en Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) (Biochim. Biophys. Acta., 1426: 297-307, 1999). El gen de PMT se clasifica en tres tipos; es decir, la familia PMT1, la familia PMT2 y la familia PMT4. Se sabe que PMT1p y PMT2p presentan actividad con la formación de heterodímeros y que PMT4p presenta actividad con la formación de homodímeros. Debido a la homología de secuencia de aminoácidos y similares, se dice que PMT5p es complementaria a PMT1p, y que PMT3p es complementaria a PMT2p. PMT6p es altamente homóloga a PMT2p y PMT3p, aunque no se conoce el tipo de compuesto que presenta actividad. Además, se sabe que cada proteína PMT tiene selectividad para una proteína sustrato.

Como genes de PMT de otros tipos de levadura de gemación, se han descubierto cinco genes altamente homólogos a los genes de PMT1, 2, 4, 5 y 6 de S. cerevisiae en el caso de Candida albicans (Mol. Microbiol., 55: 546-560, 2005), un gen altamente homólogo a al menos el gen de PMT4 de S. cerevisiae en el caso de Cryptococcus neoformans (Eukaryot. Cell, 6: 222-234, 2007) y tres genes (oma1, 2 y 4) altamente homólogos a los genes de PMT1, 2 y 4 en el caso de levadura de fisión, es decir, Schizosaccharomyces pombe (Mol. Microbiol., 57: 156-170, 2005). Además, se observó la existencia de cinco genes que son altamente homólogos a los genes de PMT1, 2, 4, 5 y 6 genes de S. cerevisiae en una levadura asimiladora de metanol, Ogataea minuta (O. minuta).

También se encontró el gen de PMT en moho. El gen de PmtA y otros dos genes se encuentran en Aspergillus nidulans, y el gen de Pmt1, que es altamente homólogo al gen de PMT2 de S. cerevisiae, se encuentra en Trichoderma reesei (Curr. Genet., 43: 11-16, 2003).

Se dice que la actividad PMT tiene los efectos de actuar sobre una región hidrófoba de péptidos, potenciando la hidrofilicidad de péptidos e inhibiendo la agregación de péptidos en la cavidad del ER. Sin embargo, cuando se producen proteínas foráneas, la actividad PMT añade ocasionalmente una cadena de O-azúcar innecesaria, lo que puede dar como resultado una formación insuficiente de compuestos de proteína, una actividad reducida, o similares. Para proteínas multiméricas, tales como anticuerpos, en particular, puede inhibirse la formación de agregados de las mismas (que se refiere a la formación de agregados de cadena ligera y de cadena pesada, en el caso de anticuerpos).

La patente JP n.º 3630424 y la publicación de patente JP (kohyo) n.º H08-509867 (A) (1996) proponen un método para producir una proteína recombinante por medio de la inhibición de la adición de cadena de O-azúcar que resulta de la modificación del gen de PMT. Sin embargo, estos documentos de patente no describen la formación de agregados de una cadena ligera y una cadena pesada de anticuerpo.

Un ejemplo en el que se usan cepas deficientes en gen de PMT1 y PMT2 asociadas con formación de cadenas de O-azúcar para inhibir la adición de cadenas de O-azúcar para fomentar la agregación de moléculas de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo aproximadamente 1,5 veces se proporciona en el documento WO 2002/046437. Este dato es el resultado de un experimento de marcaje de pulso usando un aminoácido marcado con RI, pero no es el resultado de observar todo el proceso de cultivo. Además, se reduce adicionalmente el grado de inhibición de la adición de cadena de azúcar y se deteriora la productividad de anticuerpos.

Aunque el gen HAC1 induce UPR, se sabe que algunos de los genes inducibles por UPR son genes de PMT que añaden cadenas de O-azúcar específicas de levadura (Cell, 101: 249-258, 2000). Por consiguiente, la introducción del gen HAC1 puede no ser suficiente para producir proteínas multiméricas de alta calidad, tales como anticuerpos.

Tal como se describió anteriormente, se han propuesto una variedad de métodos como métodos para la producción secretora de alto nivel de proteínas en levadura. Sin embargo, sustancialmente ningún método es suficiente a nivel práctico. Aún no se ha descubierto un método para producir de manera eficaz proteínas, en particular, proteínas de alto peso molecular o agregados de proteínas, incluyendo anticuerpos. Cuando se introduce un rasgo en una célula por medio de introducción de genes, destrucción de genes, o similares, en general, la célula experimentará una cierta clase de estrés. Por tanto, puede proporcionarse otra modificación o producirse una acción opuesta. Cuando se pretende expresión de proteínas de alto nivel, por ejemplo, se activa la UPR, lo que da como resultado un elemento negativo, tal como una modificación de cadena de azúcar, una degradación mediante un proteasoma o una degradación asociada a ER (ERAD). Por consiguiente, la producción secretora de alto nivel de proteínas que tienen estructuras complicadas, tales como anticuerpos, no se consigue mediante un único proceso, tal como introducción de un único gen. Además, la mera combinación de varios métodos convencionales no siempre dará efectos sinérgicos.

Por consiguiente, la presente invención pretende proporcionar un método para la producción secretora de alto nivel de proteínas y, más particularmente, proteínas que tienen estructuras complicadas, tales como anticuerpos, en levadura u otras células huésped.

Descripción de la invención

Los presentes inventores han realizado estudios concentrados con el fin de alcanzar el objeto anterior. Como resultado, descubrieron que genes asociados con la producción secretora de alto nivel de proteínas, es decir, el gen HAC1 activado (la proteína Hac1, que es un factor de transcripción inducido mediante el corte y empalme de ARNm mediante Ire1p tras la aplicación de estrés del retículo endoplásmico) y el gen de RRBP1 (proteína de unión al ribosoma 1, receptor del ribosoma, proteína p180), se coexpresan en una levadura asimiladora de metanol, Ogataea minuta, y que puede aumentarse la cantidad de producción secretora de anticuerpos aproximadamente 10 veces. Además, descubrieron que puede inhibirse la actividad de la proteína O-manosiltransferasa (PMT) asociada con la adición de cadena de O-azúcar a una proteína específica de levadura, que inhibe la agregación de heteromultímeros tales como anticuerpos, para mejorar adicionalmente la productividad.

Además, descubrieron que puede expresarse el gen asociado con producción secretora de alto nivel de una proteína, es decir, el gen HAC1 activado, y que puede inhibirse la actividad de proteína O-manosiltransferasa (PMT) asociada con adición de cadena de O-azúcar a una proteína específica de levadura, que inhibe la agregación de heteromultímeros tales como anticuerpos, para realizar una mejora sinérgica en la productividad.

La presente invención se ha completado con tales hallazgos (véase la figura 2).

Específicamente, la presente invención incluye lo siguiente: [1] Una célula huésped de levadura transformada que comprende un ADNc que codifica para la proteína HAC1 activada de levadura y un gen de RRBP1 de humano o perro, en la que la célula huésped transformada comprende un gen que codifica para una proteína heteromultimérica foránea, en la que la proteína heteromultimérica es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.

[2] La célula huésped transformada según [1], que comprende dicho ADNc que codifica para la proteína HAC1 activada de levadura seleccionado de (a) o (b) a continuación: (a) un gen que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23; (b) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23 mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene la función de activar la respuesta de proteínas desplegadas (UPR), en la que varios aminoácidos son 20 o menos, preferiblemente 10 o menos, más preferiblemente 7 o menos, y más preferiblemente 5 o menos.

[3] La célula transformada según [1] que comprende dicho ADNc que codifica para la proteína HAC1 activada de levadura seleccionado de (i) o (j) a continuación: (i) un gen que codifica para la proteína HAC1 activada de Saccharomyces cerevisiae o Trichoderma reesei,

(j) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la proteína HAC1 activada de Saccharomyces cerevisiae o Trichoderma

reesei mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene la función de activar la UPR, en la que varios aminoácidos son 20 o menos, preferiblemente 10 o menos, más preferiblemente 7 o menos, y más preferiblemente 5 o menos.

[4] La célula huésped transformada según [1] que comprende dicho ADNc que codifica para la proteína HAC1 activada de levadura seleccionado de (m) o (n) a continuación: (m) un gen que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 70; (n) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 70 mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene la función de activar la UPR, en la que varios aminoácidos son 20 o menos, preferiblemente 10 o menos, más preferiblemente 7 o menos, y más preferiblemente 5 o menos.

[5] La célula huésped transformada según uno cualquiera de [1]-[4], en la que la levadura es una levadura asimiladora de metanol.

[6] La célula huésped transformada según [5], en la que la levadura asimiladora de metanol es Ogataea minuta.

[7] La célula huésped transformada según uno cualquiera de [1]-[4], en la que la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

[8] La célula huésped transformada según uno cualquiera de [1]-[7], en la que el gen de PMT (proteína O- manosiltransferasa) está inactivado mediante inserción.

[9] Un método para producir una proteína que comprende cultivar la célula huésped transformada según uno cualquiera de [1] a [8] en un medio y tomar una muestra de la proteína heteromultimérica del producto de cultivo.

[10] El método según [9], en el que cultivo se lleva a cabo en condiciones en las que se inhibe la actividad proteína O-manosiltransferasa (PMT).

[11] El método según [10], en el que se inhibe la actividad proteína O-manosiltransferasa (PMT) con la adición de un inhibidor de la actividad PMT al medio.

[12] El método según [10], en el que se inhibe la actividad proteína O-manosiltransferasa (PMT) inactivando mediante inserción el gen de PMT en la célula huésped.

[13] El método para producir una proteína según [10], en el que se inhibe la síntesis de cadena de O-azúcar inactivando mediante inserción el gen de PMT y añadiendo el inhibidor de la actividad PMT al medio.

[14] El método para producir una proteína según [11] o [13], en el que el inhibidor de la actividad PMT es ácido 5- [[3,4-(1-fenilmetoxi)fenil]metilen]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolidinacético o ácido {(5Z)-4-oxo-5-3-(1-feniletoxi)-4-(2- feniletoxi)benciliden]-2-tioxo-1,3-tiazolidin-3-il}acético.

[15] Un método para producir una célula huésped de levadura transformada que comprende las etapas de: (A) introducir un ADNc que codifica para la proteína HAC1 activada de levadura en una célula huésped de levadura; y (B) introducir el gen de RRBP1 en una célula huésped de levadura, en el que dicho ADNc que codifica para la proteína HAC1 activada de levadura es cualquiera de los siguientes genes (1), (2) o (3): (1) el gen seleccionado de (a) o (b) a continuación: (a) un gen que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23; (b) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23 mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene la función de activar la UPR, en el que varios aminoácidos son 20 o menos, preferiblemente 10 o menos, más preferiblemente 7 o menos, y más preferiblemente 5 o menos; (2) un gen que codifica para la proteína HAC1 activada de Saccharomyces cerevisiae o Trichoderma reesei; (3) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la proteína HAC1 activada de Saccharomyces cerevisiae o Trichoderma reesei mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene la función de activar la UPR, en el que varios aminoácidos son 20 o menos, preferiblemente 10 o menos, más preferiblemente 7 o menos, y más preferiblemente 5 o menos; y en el que el gen de RRBP1 es un gen que codifica para la RRBP1 de humano o perro, y en el que la célula huésped transformada comprende un gen que codifica para una proteína heteromultimérica foránea introducido en la misma, en el que la proteína heteromultimérica es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.

[16] El método según [15], en el que la levadura es una levadura asimiladora de metanol.

[17] El método según [16], en el que la levadura asimiladora de metanol es Ogataea minuta.

[18] El método según [15], en el que la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

También se divulgan en el presente documento: [1] Una célula huésped transformada que comprende el gen HAC1 activado y el gen de RRBP1.

[2] La célula huésped transformada según [1], que comprende el gen HAC1 activado (1) y el gen de RRBP1 (2) a continuación: (1) el gen HAC1 activado seleccionado de entre (a) y (d) a continuación: (a) un gen que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23; (b) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23 y tiene la función de activar la respuesta de proteínas desplegadas (UPR); (c) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23 mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene la función de activar la UPR; y (d) un gen que se hibrida en condiciones rigurosas con un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 22 o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma y codifica para una proteína que tiene la función de activar la UPR; y (2) el gen de RRBP1 seleccionado de entre (e) y (h) a continuación: (e) un gen que codifica para RRBP1 derivada de humano o perro; (f) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos de RRBP1 derivada de humano o perro y tiene actividad de unión al ribosoma; (g) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de RRBP1 derivada de humano o perro mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene actividad de unión al ribosoma; y (h) un gen que se hibrida en condiciones rigurosas con un gen que consiste en una secuencia de nucleótidos del gen de RRBP1 derivada de humano o perro o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma y codifica para una proteína que tiene actividad de unión al ribosoma.

[3] La célula transformada según [1] que comprende el gen HAC1 activado (1) y el gen de RRBP1 (2) a continuación: (1) el gen HAC1 activado seleccionado de entre (i) y (l) a continuación: (i) un gen que codifica para la proteína HAC1 activada de Saccharomyces cerevisiae, Trichoderma reesei o Aspergillus nidulans; (j) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos de la proteína HAC1 activada de

Saccharomyces cerevisiae, Trichoderma reesei o Aspergillus nidulans y tiene la función de activar la UPR; (k) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la proteína HAC1 activada de Saccharomyces cerevisiae,

Trichoderma reesei o Aspergillus nidulans mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene la función de activar la UPR; y (l) un gen que se hibrida en condiciones rigurosas con un gen que consiste en una secuencia de nucleótidos del gen que codifica para la proteína HAC1 activada de Saccharomyces cerevisiae,

Trichoderma reesei o Aspergillus nidulans o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma y codifica para una proteína que tiene la función de activar la UPR; y (2) el gen de RRBP1 seleccionado de entre (e) y (h) a continuación: (e) un gen que codifica para RRBP1 derivada de humano o perro; (f) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos de RRBP1 derivada de humano o perro y tiene actividad de unión al ribosoma; (g) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de RRBP1 derivada de humano o perro mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene actividad de unión al ribosoma; y (h) un gen que se hibrida en condiciones rigurosas con un gen que consiste en una secuencia de nucleótidos del gen de RRBP1 derivada de humano o perro o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma y codifica para una proteína que tiene actividad de unión al ribosoma.

[4] La célula huésped transformada según cualquiera de [1] a [3], en la que la célula huésped es una célula eucariota.

[5] La célula huésped transformada según [4], en la que la célula eucariota es de levadura.

[6] La célula huésped transformada según [5], en la que la levadura es una levadura asimiladora de metanol.

[7] La célula huésped transformada según [6], en la que la levadura asimiladora de metanol es Ogataea minuta.

[8] La célula huésped transformada según [5], en la que la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

[9] La célula huésped transformada según cualquiera de [1] a [8], que comprende un gen que codifica para una proteína foránea introducido en la misma.

[10] La célula huésped transformada según [9], en la que la proteína foránea es una proteína multimérica.

[11] La célula huésped transformada según [10], en la que la proteína multimérica es un heteromultímero.

[12] La célula huésped transformada según [11], en la que el heteromultímero es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.

[13] Un método para producir una proteína que comprende cultivar la célula huésped transformada según cualquiera de [9] a [12] en un medio y tomar una muestra de una proteína diana del producto de cultivo.

[14] El método según [13], en el que cultivo se lleva a cabo en condiciones en las que se inhibe la actividad proteína O-manosiltransferasa (PMT).

[15] El método según [14], en el que se inhibe la actividad proteína O-manosiltransferasa (PMT) con la adición de un inhibidor de la actividad PMT al medio.

[16] Un gen que codifica para la proteína HAC1 activada de una levadura asimiladora de metanol.

[17] Un gen seleccionado de entre (a) y (d) a continuación: (a) un gen que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23; (b) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23 y tiene la función de activar la respuesta de proteínas desplegadas (UPR); (c) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23 mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene la función de activar la UPR; y (d) un gen que se hibrida en condiciones rigurosas con un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 22 o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma y codifica para una proteína que tiene la función de activar la UPR.

[18] Un vector de expresión que comprende el gen según [17].

[19] El vector de expresión según [18], que es pOMexPGHy/Hac1.

[20] Un vector de expresión que comprende el gen HAC1 activado y el gen de RRBP1.

[21] El vector de expresión según [20], en el que el gen HAC1 activado es el gen según [17].

[22] El vector de expresión según [20], en el que el gen HAC1 activado es un gen que codifica para la proteína HAC1 activada de Saccharomyces cerevisiae, Trichoderma reesei o Aspergillus nidulans o un gen homólogo del mismo.

[23] El vector según [20], que es YEp351GAP-II-aHAC1/p180.

[24] El vector de expresión según [20], en el que el gen de RRBP1 es el gen de RRBP1 derivada de humano o perro o un gen homólogo del mismo.

[25] Una célula huésped transformada en la que se ha introducido el vector de expresión según cualquiera de [18] a [24].

[26] Una célula huésped transformada en la que se ha introducido un vector de expresión que comprende el gen HAC1 activado y un vector de expresión que comprende el gen de RRBP1.

[27] La célula huésped transformada según [26], en la que el vector de expresión que comprende el gen HAC1 activado es el vector de expresión según [18] o [19].

[28] La célula huésped transformada según [26], en la que el gen HAC1 activado es un gen que codifica para la proteína HAC1 activada de Saccharomyces cerevisiae, Trichoderma reesei o Aspergillus nidulans o un gen homólogo del mismo.

[29] La célula transformada según [26], en la que el gen de RRBP1 es el gen de RRBP1 derivada de humano o perro o un gen homólogo del mismo.

[30] Un método para producir una célula huésped transformada que comprende las etapas de: (A) introducir el gen HAC1 activado en una célula huésped; y (B) introducir el gen de RRBP1 en una célula huésped.

[31] El método según [30], en el que el gen HAC1 activado es cualquiera de los siguientes genes: (1) el gen según [17]; (2) un gen que codifica para la proteína HAC1 activada de Saccharomyces cerevisiae, Trichoderma reesei o Aspergillus nidulans; (3) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos de la proteína HAC1 activada de Saccharomyces cerevisiae, Trichoderma reesei o Aspergillus nidulans y tiene la función de activar la UPR; (4) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la proteína HAC1 activada de Saccharomyces cerevisiae, Trichoderma reesei o Aspergillus nidulans mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene la función de activar la UPR; y (5) un gen que se hibrida en condiciones rigurosas con un gen que consiste en una secuencia de nucleótidos de un gen que codifica para la proteína HAC1 activada de Saccharomyces cerevisiae, Trichoderma reesei o Aspergillus nidulans o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma y codifica para una proteína que tiene la función de activar la UPR.

[32] El método según [30], en el que el gen de RRBP1 es cualquiera de los siguientes genes: (1) un gen que codifica para la RRBP1 derivada de humano o perro; (2) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos de RRBP1 derivada de humano o perro y tiene actividad de unión al ribosoma; (3) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de RRBP1 derivada de humano o perro mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene actividad de unión al ribosoma; y (4) un gen que se hibrida en condiciones rigurosas con un gen que consiste en una secuencia de nucleótidos del gen de RRBP1 derivada de humano o perro o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma y codifica para una proteína que tiene actividad de unión al ribosoma.

[33] El método según cualquiera de [30] a [32], en el que la célula huésped es una célula eucariota.

[34] El método según [33], en el que la célula eucariota es de levadura.

[35] El método según [34], en el que la levadura es una levadura asimiladora de metanol.

[36] El método según [35], en el que la levadura asimiladora de metanol es Ogataea minuta.

[37] El método según [34], en el que la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

[38] Un gen seleccionado de entre (a) y (d) a continuación: (a) un gen que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 70; (b) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 70 y tiene la función de activar la respuesta de proteínas desplegadas (UPR); (c) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 70 mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene la función de activar la UPR; y (d) un gen que se hibrida en condiciones rigurosas con un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 69 o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma y codifica para una proteína que tiene la función de activar la UPR.

[39] Un vector de expresión que comprende el gen según [38].

[40] El vector de expresión según [39], que es pOMexPGHy/PpHac1.

[41] Un método para producir una proteína que comprende cultivar una célula transformada en la que se han introducido el gen HAC1 activado y/o el gen de RRBP1 y un gen que codifica para una proteína foránea en un medio en condiciones en las que se inhibe la síntesis de cadena de O-azúcar y tomar una muestra de una proteína diana del producto de cultivo.

[42] El método para producir una proteína según [41], en el que se inhibe la síntesis de cadena de O-azúcar inactivando mediante inserción el gen de PMT.

[43] El método para producir una proteína según [41], en el que se inhibe la síntesis de cadena de O-azúcar añadiendo el inhibidor de la actividad PMT al medio.

[44] El método para producir una proteína según [41], en el que se inhibe la síntesis de cadena de O-azúcar inactivando mediante inserción el gen de PMT y añadiendo el inhibidor de la actividad PMT al medio.

[45] El método para producir una proteína según [43] o [44], en el que el inhibidor de la actividad PMT es ácido 5- [[3,4-(1-fenilmetoxi)fenil]metilen]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolidinacético o ácido {(5Z)-4-oxo-5-[3-(1-feniletoxi)-4-(2- feniletoxi)benciliden]-2-tioxo-1,3-tiazolidin-3-il}acético.

[46] Una célula huésped transformada con el gen de PMT inactivado mediante inserción y con el gen HAC1 activado introducido en la misma.

[47] La célula transformada según [46], en la que la célula huésped es Ogataea minuta.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un método para obtener el gen HAC1 activado de O. minuta y la estructura del mismo.

La figura 2 muestra esquemáticamente el alcance técnico de la presente divulgación.

La figura 3 muestra las estructuras de un vector de expresión para el gen HAC1 activado de O. minuta (pOMexPGHy/Hac1), un vector de expresión para el gen de RRBP1 de humano (pOMexGP1A/p180) y un vector de expresión para el gen de anticuerpo humano (pOMexGAT-G/Ab).

La figura 4 muestra los resultados del análisis de tipo Western de anticuerpos secretados en el sobrenadante de cultivo de una cepa de levadura productora de anticuerpos en la que se han introducido el gen HAC1 activado de O. minuta y el gen de RRBP1 de humano.

La figura 5 muestra un gráfico que muestra los resultados de medir la cantidad de anticuerpos secretados de una cepa de levadura productora de anticuerpos en la que se han introducido el gen HAC1 activado de O. minuta y el gen de RRBP1 de humano.

La figura 6 muestra los resultados del análisis de tipo Western de anticuerpos secretados en el sobrenadante de cultivo de una cepa de levadura productora de anticuerpos en la que se han introducido el gen HAC1 activado de O. minuta y el gen de RRBP1 de humano, que se han cultivado en condiciones en las que se inhibe la formación de cadena de O-azúcar.

La figura 7 muestra un vector de expresión para HAC1 activo de S. cerevisiae (YEp351GAP-II-aHAC1), un vector de expresión para el gen de RRBP1 de humano (YEp351GAP-II-p180), un vector de expresión para el gen de anticuerpo humano (YEp352 GAP-II-alfHc/alfLc) y un vector de coexpresión para el gen HAC1 activado y el gen de RRBP1 (YEp351GAPII-aHAC1/p180).

La figura 8A muestra un gráfico que muestra los resultados de una comparación de las capacidades para la producción secretora de anticuerpos de cepas de levadura productoras de anticuerpos en las que se han introducido un vector de expresión para el gen HAC1 activado de S. cerevisiae y un vector de expresión para el gen de RRBP1 de humano. La figura 8B muestra un gráfico que muestra los resultados de una comparación de las capacidades para la producción secretora de anticuerpos de cepas de levadura productoras de anticuerpos en las que se han introducido un vector de expresión para el gen HAC1 activado de S. cerevisiae y un vector de expresión para el gen de RRBP1 de humano en condiciones en las que se inhibe la formación de cadena de O-azúcar. La figura 8C muestra un gráfico que muestra los resultados de una comparación de las capacidades para la producción secretora de anticuerpos (valores absolutos) de cepas de levadura productoras de anticuerpos en las que se han introducido un vector de expresión para el gen HAC1 activado de S. cerevisiae y un vector de expresión para el gen de RRBP1 de humano con o sin la adición de un inhibidor de PMT.

La figura 9 muestra los resultados del análisis de tipo Western de producción de anticuerpos en cepas productoras de anticuerpos en las que se ha introducido un gen de anticuerpo sintético, en el que se han sustituido codones.

La figura 10 muestra los resultados del análisis de tipo Western de sobrenadantes de cultivo de cepas productoras de anticuerpos en las que se han introducido los genes HAC1 activados derivados de cepas de levadura.

La figura 11 muestra la cantidad de producción secretora de anticuerpos de cepas productoras de anticuerpos en las que se han introducido los genes HAC1 activados derivados de cepas de levadura.

La figura 12 muestra los resultados del análisis de tipo Western de sobrenadantes de cultivo de cepas productoras de anticuerpos con el gen de PMT1 o gen de PMT2 inactivado mediante inserción y aquéllas de las cepas productoras de anticuerpos en las que se han introducido los genes HAC1 activados.

La figura 13 muestra la cantidad de producción secretora de anticuerpos de cepas productoras de anticuerpos con el gen de PMT1 o gen de PMT2 inactivado mediante inserción y aquéllas de las cepas productoras de anticuerpos en las que se han introducido los genes HAC1 activados.

La figura 14 muestra los resultados del análisis de tipo Western de sobrenadantes de cultivo de cepas productoras de anticuerpos con el gen de PMT4 inactivado mediante inserción y aquéllas de las cepas productoras de anticuerpos en las que se han introducido los genes HAC1 activados.

La figura 15 muestra la cantidad de producción secretora de anticuerpos de cepas productoras de anticuerpos con el gen de PMT4 inactivado mediante inserción y cepas productoras de anticuerpos en las que se han introducido los genes HAC1 activados.

La figura 16A muestra los resultados del análisis de tipo Western de sobrenadantes de cultivo de las cepas productoras de anticuerpos deficientes en gen de PMT5 o gen de PMT6. La figura 16B muestra la cantidad de producción secretora de anticuerpos de las cepas productoras de anticuerpos deficientes en gen de PMT5 o gen de PMT6.

La figura 17 muestra los resultados del análisis de tipo Western de sobrenadantes de cultivo obtenidos cultivando cepas productoras de anticuerpos con el gen de PMT2 o PMT4 inactivado mediante inserción y con el gen HAC1 activado introducido en la misma con la adición de un inhibidor de PMT (1c).

La figura 18A muestra la cantidad de producción secretora de anticuerpos en sobrenadantes de cultivo obtenidos cultivando cepas productoras de anticuerpos con el gen de PMT2 inactivado mediante inserción y con el gen HAC1 activado introducido en la misma con la adición de un inhibidor de PMT (1c). La figura 18B muestra la cantidad de producción secretora de anticuerpos en un sobrenadante de cultivo obtenido cultivando cepas productoras de anticuerpos con el gen de PMT4 inactivado mediante inserción y con el gen HAC1 activado introducido en la misma con la adición de un inhibidor de PMT (1c).

La figura 19 muestra los resultados del análisis de tipo Western de sobrenadantes de cultivo, que se han cultivado con la adición de una variedad de inhibidores de PMT (derivados de ácido rodanin-3-acético).

La figura 20 muestra la cantidad de producción secretora de anticuerpos en sobrenadantes de cultivo, que se han cultivado con la adición de una variedad de inhibidores de PMT (derivados de ácido rodanin-3-acético).

A continuación en el presente documento se describe en detalle la presente invención. Esta solicitud de patente reivindica la prioridad de la solicitud de patente japonesa n.º 2006-136993 presentada el 16 de mayo de 2006.

En el presente documento se divulga que una combinación de (A) introducción de un gen asociado con producción secretora de alto nivel de una proteína y (B) inhibición de adición de cadena de O-azúcar inherente a levadura (y moho) puede producir efectos sinérgicos en lo que respecta a la producción secretora de alto nivel de una proteína.

A continuación en el presente documento se describe en detalle la presente divulgación.

La presente divulgación proporciona un gen usado para la producción secretora de alto nivel de una proteína, un vector de expresión que comprende tal gen, una célula huésped transformada en la que se ha introducido tal vector de expresión, y un método para producir una proteína usando tal célula huésped transformada.

1. Gen usado para la producción secretora de alto nivel de una proteína (1) Gen HAC1 En la presente invención, un gen usado para la producción secretora de alto nivel de una proteína es el gen HAC1 activado. El gen HAC1 está presente como gen HAC1 inactivo en el genoma; sin embargo, el ARNm transcrito por el gen HAC1 tras aplicación de estrés del retículo endoplásmico se somete a corte y empalme mediante Ire1p y se convierte en ARNm que codifica para un factor de transcripción, la proteína HAC1 (Hac1p). Entonces se activa la respuesta de proteínas desplegadas (UPR) mediante la Hac1p traducida. En la presente invención, el gen HAC1 activado se define como ADNc que codifica para la proteína HAC1 (Hac1p) (es decir, es complementario a ARNm).

Por consiguiente, el gen HAC1 activado se usa según la invención. También se divulga en el presente documento que también puede alcanzarse un cierto grado de efectos por medio de la introducción del gen HAC1 inactivado.

A continuación en el presente documento se describe el gen HAC1 activado que codifica para Hac1p que realmente hace que funcione la UPR. HAC1p está constituida por, desde el extremo N-terminal, un dominio de unión a ADN que está altamente conservado en organismos, la región de cremallera de leucina, y una región activa desconocida en la que se somete a corte y empalme ARNm y se añade de nuevo mediante Ire1p en el extremo C-terminal.

El gen HAC1 activado usado en la presente invención no está limitado particularmente, siempre que tal gen codifique para la proteína HAC1 activada. Los ejemplos incluyen ADN que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23 derivada de Ogataea minuta (O. minuta), que se obtuvo recientemente en la presente invención, y ADN que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos derivada de Pichia pastoris (P. pastoris) mostrada en SEQ ID NO: 70. Puede emplearse un ADN funcionalmente equivalente homólogo a los mismos.

El término “ADN homólogos” se refiere a, por ejemplo, un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23 ó 70 y tiene la función de activar la respuesta de proteínas desplegadas (UPR), un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23 ó 70 mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene la función de activar la UPR, y un gen que se hibrida en condiciones rigurosas con un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 22 ó 69 o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma y codifica para una proteína que tiene la función de activar la UPR.

El término “una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23 ó 70” se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 90% y lo más preferiblemente al menos el 95%. La búsqueda de homología entre proteínas puede llevarse a cabo con el uso de, por ejemplo, la base de datos de ADN de Japón (DDBJ) por medio de FASTA, BLAST u otros programas.

El número indicado mediante el término “varios” en lo mencionado anteriormente “uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23 ó 70” no está limitado particularmente. Por ejemplo, el término “varios” se refiere aproximadamente a 20 o menos, preferiblemente 10 o menos, más preferiblemente 7 o menos, y más preferiblemente 5 o menos.

En las “condiciones rigurosas” mencionadas anteriormente, se forma un denominado híbrido específico, pero no se forma un híbrido no específico. En tales condiciones, por ejemplo, hebras complementarias de un ADN altamente homólogo, es decir, ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de al menos el 80%, preferiblemente al menos el 90% y más preferiblemente al menos el 95% con la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 22 ó 69 experimentan hibridación, pero hebras complementarias de ADN que tienen niveles de homología menores no experimentarán hibridación. Más específicamente, la concentración de sodio es de 150 a 900 mM, y preferiblemente de 600 a 900 mM, y la temperatura es de 60ºC a 68ºC, y preferiblemente de 65ºC.

La mutación mencionada anteriormente, tal como deleción, sustitución y/o adición, puede introducirse por medio de una técnica conocida en la materia, tal como el método de Kunkel o el método de dúplex con huecos, o una técnica de acuerdo con las mismas. Por ejemplo, pueden usarse kits de mutagénesis que utilizan mutagénesis dirigida al sitio, tales como un kit Mutant-K (Takara Bio), Mutant-G (Takara Bio) o uno de la serie de mutagénesis in vitro LA PCR (Takara Bio).

El término “función de activar la UPR” se refiere a la función de activar las reacciones de defensa de retículo endoplásmico (ER) frente a la acumulación de proteínas desplegadas (por ejemplo, inhibición de la transcripción, aceleración del plegamiento inducida mediante chaperonas moleculares, degradación de proteína desnaturalizada, o muerte celular provocada por apoptosis). La función de activar la UPR es sustancialmente equivalente a la función de un gen que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23 ó 70.

El gen HAC1 activado puede ser un gen de O. minuta, P. pastoris u otra levadura asimiladora de metanol. Los ejemplos de los mismos incluyen genes que codifican para proteínas HAC1 activadas derivadas de Hansenulla polymorpha (Pichia angusta), Pichia methanolica y Candida boidinii. Además, puede ser un gen HAC1 activado derivado de otra especie de organismo, tales como otros tipos de levadura o moho. Los ejemplos de los mismos incluyen un gen (YFL031W, número de registro de GenBank: ADN sometido a corte y empalme de D26506 mediante Ire1p) que codifica para la proteína HAC1 activada (número de registro de GenBank: NP_116622) derivada de

Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), un gen (número de registro de GenBank: AJ413272) que codifica para la proteína HAC1 activada (número de registro de GenBank: CAC88374) derivada de Trichoderma reesei y un gen (número de registro de GenBank: AJ413273) que codifica para la proteína HacA activa (número de registro de GenBank: CAC88375) derivada de Aspergillus nidulans.

Las secuencias de nucleótidos de genes que codifican para las proteínas HAC1 activadas derivadas de S. cerevisiae, Trichoderma reesei y Aspergillus nidulans se muestran en las SEQ ID NO: 39, 41 y 43, y las secuencias de aminoácidos correspondientes se muestran en las SEQ ID NO: 40, 42 y 44.

Los genes HAC1 activados derivados de Ogataea minuta y Pichia pastoris aislados en el presente documento fueron los primeros genes aislados de cepas de levadura distintas de Saccharomyces cerevisiae. Esto sugiere con fuerza la presencia del gen de interés generalmente en cepas de levadura, tales como cepas de levadura asimiladora de metanol. Por consiguiente, estos genes están dentro del alcance de los genes HAC1 activados usados en la presente invención.

Además puede usarse un factor de transcripción que activa la UPR como alternativa al gen HAC1 activado mencionado anteriormente. Un ejemplo es un gen que se activa tras corte y empalme, mediante Ire1p, del gen XBP- 1 (por ejemplo, un gen derivado de humano con número de registro de GenBank: NM_005080), que es un homólogo de HAC1 derivado de células animales u otras especies. La activación artificial mediante Ire1, que también activa HAC1, también corresponde a la activación de UPR. Por consiguiente, se considera que es equivalente a la introducción del gen HAC1 activado. Además, se considera que la expresión forzada del gen HAC1 no activado produce efectos equivalentes al caso de la introducción de HAC1 activado tal como se describió anteriormente.

El gen HAC1 activado puede obtenerse mediante cualquier método, siempre que se induzca una UPR. Por ejemplo, puede obtenerse ARNm de una célula en la que genes que codifican para proteínas que son difíciles de plegar se expresan a alto nivel o células que se tratan con un inhibidor de modificación de cadena de azúcar, tal como tunicamicina, un agente redox, tal como DTT o peróxido de hidrógeno, o un inductor de UPR, tras lo cual se sintetiza ADNc a partir del mismo. Además, puede obtenerse ARNm de una secuencia que ya se ha divulgado sintetizando una parte de o la longitud completa de la misma con el uso de un sintetizador de ADN.

(2) Gen de RRBP1 En la presente invención, el otro gen usado para la producción secretora de alto nivel de una proteína es el gen de RRBP1. El gen de RRBP1 es un gen que codifica para una proteína denominada proteína de unión al ribosoma 1, y también se denomina gen hES, ES130, ES/130 o DKFZp586A1420. El gen de RRBP1 de mamífero está compuesto por la región transmembrana N-terminal, una región posterior que es rica en aminoácidos básicos, 54 repeticiones de una secuencia que comprende 10 residuos de aminoácido, y la región C-terminal.

El gen de RRBP1 usado en la presente invención no está limitado particularmente, siempre que codifique para la proteína de unión al ribosoma 1. Los ejemplos incluyen el gen de RRBP1 derivada de humano (que codifica para la proteína KIAA1398; número de registro de GenBank: AB037819) y el gen de RRBP1 derivada de perro (que codifica para el receptor del ribosoma p180; número de registro de GenBank: X87224). Mientras sea funcionalmente equivalente a los genes mencionados anteriormente, puede usarse un gen homólogo del mismo. Las secuencias de nucleótidos del gen de RRBP1 derivada de humano y el gen de RRBP1 derivada de perro se muestran en las SEQ ID NO: 45 y 47, y las secuencias de aminoácidos correspondientes se muestran en las SEQ ID NO: 46 y 48.

Los ejemplos de genes homólogos incluyen: un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 70% con la secuencia de aminoácidos de RRBP1 derivada de humano o perro y tiene actividad de unión al ribosoma; un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de RRBP1 derivada de humano o perro mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene actividad de unión al ribosoma; y un gen que se hibrida en condiciones rigurosas con un gen que consiste en una secuencia de nucleótidos del gen de RRBP1 derivada de humano o perro o una secuencia de nucleótidos complementaria de la misma y codifica para una proteína que tiene actividad de unión al ribosoma. El grado de homología, las condiciones rigurosas y un método de mutagénesis son tal como se describieron anteriormente.

Los ejemplos específicos de tales genes homólogos incluyen genes de RRBP1 derivados de ratones (n.os de registro: XM_622097, XM_91338 y XM_991888), una rata (n.º de registro XM_230637), una Xenopus (n.º de registro: NM_001005671) y un pez cebra (danio cebra) (n.º de registro: NM_199431).

El gen de RRBP1 también puede obtenerse mediante una técnica conocida generalmente. Por ejemplo, puede prepararse ARNm a partir de una célula en la que se expresa el gen de RRBP1, y puede sintetizarse adicionalmente ADNc.

En la presente divulgación, el gen mencionado anteriormente usado para la producción secretora de alto nivel de una proteína y un gen que codifica para una proteína foránea que es la diana de la producción secretora de alto nivel descrita más adelante (a continuación en el presente documento estos genes se denominan “genes diana”) pueden obtenerse mediante una técnica general de preparación de ARNm y síntesis de ADNc usando transcriptasa inversa. Como ejemplo de la técnica general mencionada anteriormente, una biblioteca de ADNc derivada de una célula o un tejido en el que se expresa el gen diana se somete a examen con el uso de una sonda de ADN sintetizada a partir de un fragmento del gen diana, para aislar el gen de interés. Puede prepararse ARNm mediante una técnica usada generalmente en la materia. Por ejemplo, la célula o el tejido mencionado anteriormente puede tratarse con un reactivo de guanidina o un reactivo de fenol para obtener ARN total, tras lo cual se obtiene entonces poli (A)+ ARN (ARNm) por medio del método de columna de afinidad usando columnas de oligo(dT)-celulosa o poli-U-Sepharose usando Sepharose 2B como portador o una técnica discontinua. Además, puede fraccionarse poli (A)+ ARN por medio de centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa o por medio de otros medios. Posteriormente se usa el ARNm obtenido como molde para sintetizar ADNc monocatenario usando cebadores oligodT y transcriptasa inversa, se sintetiza ADNc bicatenario a partir del ADNc monocatenario usando ADN sintetasa I, ADN ligasa, ARNasaH, y similares. Al ADNc bicatenario sintetizado se le proporcionan extremos romos usando T4 ADN sintetasa, se somete al ligamiento de un adaptador (por ejemplo, un adaptador de EcoRI), fosforilación o similar, se incorpora en un fago , tal como gt11, y entonces se empaqueta in vitro para preparar una biblioteca de ADNc.

Además de un fago , pueden usarse vectores de plásmido para preparar una biblioteca de ADNc. Después de esto, puede seleccionarse una cepa que tiene el ADN de interés (es decir, un clon positivo) de la biblioteca de ADNc.

Cuando se aísla el gen diana de ADN genómico o cuando se aísla un fragmento que contiene una región de promotor y una región de terminador, se extrae ADN genómico de una cepa celular de un organismo fuente, y se selecciona el gen diana según una técnica común (Molecular Cloning, 1989; Methods in enzymology 194, 1991). El ADN genómico puede extraerse mediante el método de Cryer et al. (Methods in Cell Biology, 12, 39-44, 1975) o el método de P. Philippsen et al. (Methods Enzymol., 194, 169-182, 1991), por ejemplo. Cuando la fuente es una cepa de levadura, por ejemplo, se prepara un protoplasto de levadura y entonces se somete el protoplasto de levadura a una técnica convencional, tal como las conocidas técnicas de extracción de ADN, técnicas de precipitación con alcohol tras la eliminación de residuos celulares a una alta concentración de sal, o técnicas de precipitación con alcohol tras extracción con fenol o cloroformo.

El gen diana puede obtenerse, por ejemplo, mediante PCR (PCR Technology, Henry A. Erlich, Stockton Press, 1989). Cuando se amplifica el gen diana por medio de PCR, se usa como cebador un ADN monocatenario de 20 meros a 30 meros sintetizado y se usa ADN genómico como molde. Se confirma la secuencia de nucleótidos del gen amplificado y entonces se usa.

Puede obtenerse un fragmento que contiene un gen diana cuya secuencia es desconocida (a) preparando una biblioteca génica mediante una técnica convencional y (b) seleccionando un clon de interés a partir de la biblioteca génica resultante que va a amplificarse. Puede prepararse una biblioteca génica obteniendo ADN cromosómico de una línea celular de un organismo fuente por medio de una técnica convencional, digiriendo parcialmente el ADN cromosómico con enzimas de restricción adecuadas para fragmentación, ligando el fragmento resultante a un vector adecuado e introduciendo entonces el vector en una célula huésped adecuada. Alternativamente, puede extraerse ARNm de una célula, puede sintetizarse ADNc a partir del mismo, puede ligarse el ADNc sintetizado a un vector adecuado y puede introducirse el vector en una célula huésped adecuada, de modo que puede prepararse una biblioteca génica. En tal caso, puede usarse un plásmido que se conoce como vector convencional para la preparación de bibliotecas génicas, y por extensión pueden usarse fagos, cósmidos u otros vectores. Puede seleccionarse una célula huésped que se somete a transformación o transducción según el tipo de vector.

Los clones que portan fragmentos de genes diana se seleccionan de la biblioteca génica anterior por medio de hibridación de colonias, hibridación de placas de lisis u otros medios que impliquen el uso de sondas marcadoras que contienen secuencias específicas para los genes diana.

Además, los genes diana pueden someterse a una síntesis química total. Por ejemplo, se preparan dos pares de oligonucleótidos complementarios y entonces se aparean, se ligan varias cadenas de ADN apareadas con la ayuda de ADN ligasa, o se preparan varios oligonucleótidos parcialmente complementarios y se llenan los huecos mediante PCR. Por tanto, pueden sintetizarse genes.

Pueden determinarse secuencias de ADN de genes mediante una técnica convencional, tal como el método didesoxi (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 74, 5463-5467, 1977). Además, las secuencias de nucleótidos de ADN anteriores pueden determinarse fácilmente con el uso de un kit de secuenciación disponible comercialmente o similar.

2. Vector de expresión En el presente documento se describe un vector que comprende el gen HAC1 activado o el gen de RRBP1 o un vector que comprende tanto el gen HAC1 activado como el gen de RRBP1. Con el fin de expresar el gen HAC1 activado y el gen de RRBP1 en células huésped, puede usarse un vector que comprende cualquiera del gen HAC1 activado o el gen de RRBP1 para llevar a cabo la transformación. Alternativamente, puede usarse un vector que comprende ambos de tales genes para llevar a cabo la transformación. Además, un vector de expresión de este tipo puede comprender un gen que codifica para una proteína foránea. Alternativamente, puede prepararse por separado un vector de expresión que comprende un gen que codifica para una proteína foránea. En tal caso, se cotransfectan vectores en una célula huésped.

Un gen que codifica para una proteína foránea no está limitado particularmente. Los ejemplos incluyen: diversos genes de enzimas, tales como el gen de -amilasa y el gen de -galactosidasa; diversos genes de interferón que son proteínas farmacéuticamente útiles y fisiológicamente activas, tales como genes de interferón  e interferón ; diversos genes de interleucinas, tales como genes de IL1 y IL2; diversos genes de citocinas, tales como el gen de eritropoyetina (EPO) y el gen del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF); y genes del factor de crecimiento. Estos genes pueden obtenerse por medio de cualquier medio.

La presente invención es particularmente eficaz con una proteína que sea altamente hidrófoba y una proteína cuya producción secretora sea insuficiente debido a la formación compuesta. Por tanto, la proteína foránea mencionada anteriormente es un anticuerpo o su fragmento funcional, es decir, un heteromultímero.

Puede añadirse de manera adecuada una región de regulación de la expresión al gen HAC1 activado, al gen de RRBP1 o a un gen que codifica para una proteína foránea para constituir un vector de expresión como unidad de expresión proteica. Una unidad de expresión proteica comprende, en el sentido de un marco de lectura de transcripción, al menos una región de promotor, el gen anterior y una región de terminador de la transcripción. Un promotor que puede usarse en el presente documento puede ser un promotor de expresión inducible o promotor de expresión constitutiva. Los ejemplos de promotores de expresión inducible incluyen promotores implicados en el metabolismo de metanol de levadura asimiladora de metanol, tal como promotores del gen de alcohol oxidasa (AOX), promotores del gen de dihidroxiacetona sintasa (DAS) y promotores del gen de formiato deshidrogenasa (FDH). Un ejemplo de otro promotor inducible que puede usarse es un promotor inducible por cobre (CUP). Los ejemplos de promotores de expresión constitutiva incluyen promotores del gen de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (TDH, GAP), el gen de fosfoglicerocinasa (PGK), el gen de fosfotriosa isomerasa (TPI), el gen de enolasa (ENO), el gen de actina (ACT), el gen de citocromo c (CYC), el gen de trehalosa sintasa (TPS) y el gen de alcohol deshidrogenasa (ADH). Además, un terminador de la transcripción puede ser una secuencia que tiene una actividad de terminación de la transcripción de un promotor. Puede ser una secuencia del mismo gen del promotor o de uno diferente.

Con el fin de realizar la producción secretora de alto nivel de proteínas foráneas, es necesario el uso de un promotor potente. Cuando se intenta la producción de una proteína que tiene menos probabilidad de plegarse o menos probabilidad de secretarse con el uso de un promotor altamente activo, puede producirse de manera desventajosa hiposecreción. Tal hiposecreción se produce debido a los siguientes motivos. Es decir, la producción de proteína supera la capacidad del ribosoma en el que se realiza la traducción y del retículo endoplásmico en el que se realizan el plegamiento y la secreción. Esto provoca que las proteínas producidas en exceso se desnaturalicen, se acumulen, se ubiquitinen en células y se degraden por el proteasoma. Por consiguiente, pueden seleccionarse de manera adecuada promotores que pueden alcanzar un nivel de expresión hasta el grado en el que las proteínas resultantes se desnaturalicen y no experimenten agregación o las proteínas resultantes no superen la capacidad de secreción.

Alternativamente, puede atenuarse la actividad de los promotores y entonces pueden usarse los promotores de interés. Es probable que las moléculas que forman heteromultímeros se vean afectadas como se describió anteriormente entre las proteínas multiméricas. En particular, moléculas tales como anticuerpos son heterotetrámeros que comprenden dos moléculas de cada una de la cadena pesada y de la cadena ligera que están agregadas. Por tanto, el nivel de expresión es un factor importante para realizar una agregación adecuada. Cuando la intensidad de expresión del gen HAC1 activado es excesivamente fuerte, se aplica un estrés excesivo a una célula, y esto puede inhibir de manera desventajosa el crecimiento. Por tanto, se requieren un ajuste y una optimización de la actividad de promotor tal como se describió anteriormente.

El vector de expresión puede comprender un marcador de selección para seleccionar un transformante. Por ejemplo, los vectores de expresión para levadura pueden comprender genes de marcadores auxótrofos seleccionados de entre genes de His1, His2, His3, His4, His5, His6, Leu2, Alg1, Alg2, Alg3, Trp1, Lys2, Ade1, Ade2, Ura3 y Ura5.

Como marcadores de selección, pueden usarse marcadores resistentes a fármacos que confieren resistencia a fármacos tales como cerulenina, aureobasidina, Zeocin, canavanina, cicloheximida, higromicina, blasticidina, tetraciclina, kanamicina, ampicilina, tetraciclina y neomicina, además de los marcadores auxótrofos mencionados anteriormente. Por tanto, pueden seleccionarse transformantes. Además, pueden usarse como marcadores genes que confieren resistencia a disolventes con respecto a etanol, resistencia osmótica con respecto a glicerol o sal, resistencia a iones metálicos con respecto a cobre, y similares, de modo que pueden seleccionarse transformantes.

3. Célula huésped transformada La célula huésped transformada de la presente descripción comprende el gen descrito en 1. anteriormente o el vector de expresión descrito en 2. anteriormente introducido en la misma.

Un ejemplo de una célula huésped que va a transformarse es una célula eucariota, y preferiblemente una cepa de levadura. Los ejemplos de cepas de levadura incluyen cepas de levadura asimiladora de metanol, tales como Ogataea minuta, Pichia pastoris, Hansenulla polymorpha (Pichia angusta) y Candida boidinii, y cepas de levadura, tales como Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Yarowia lipolytica y Schizosaccharomyces pombe. Más específicamente, puede usarse la cepa YK3 de Ogataea minuta (och1pep4prb1yps1ura3ade1) como la cepa de Ogataea minuta, y puede usarse la cepa BY4741 de Saccharomyces cerevisiae (MATa his3 leu2met15 ura3) como la cepa de Saccharomyces cerevisiae, aunque las cepas de levadura no están limitadas a esto.

Además, la presente divulgación pretende obtener una célula huésped en la que el ER, que es esencial para la secreción, esté potenciado. Por consiguiente, la presente divulgación puede aplicarse a células animales u otras células.

En la presente invención, puede introducirse un vector de expresión en una célula huésped mediante cualquier método, siempre que un gen introducido esté presente de manera estable y se exprese de manera adecuada en un huésped. Los ejemplos de tales métodos que se emplean generalmente incluyen el método de fosfato de calcio (Ito et al., Agric. Biol. Chem., 48, 341, 1984), la electroporación (Becker, D. M. et al., 1990; Methods. Enzymol., 194, 182- 187), el uso de esferoplastos (Creggh et al., Mol. Cell. Biol., 5, 3376, 1985), el método de acetato de litio (Itoh, H., 1983; J. Bacteriol. 153, 163-168) y la lipofección.

4. Método para producir proteína En la presente invención, pueden producirse proteínas cultivando las células huésped transformadas por medio de una técnica convencional y tomando una muestra de las proteínas del producto de cultivo, seguido por purificación. El término “producto de cultivo” usado en el presente documento se refiere a células en cultivo, cepas cultivadas, o bacterias o células perturbadas, además de un sobrenadante de cultivo.

La célula huésped transformada puede cultivarse en un medio según un método convencional usado para el cultivo de la célula huésped.

Cuando la célula huésped transformada es un microorganismo, tal como una levadura, puede usarse un medio o bien natural o bien sintético como medio para el cultivo, siempre que contenga fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y sales inorgánicas asimilables por el microorganismo y sea capaz de proporcionar un cultivo eficaz del transformante. Puede usarse cualquier fuente de carbono asimilable por el microorganismo, y los ejemplos de las mismas incluyen: hidratos de carbono tales como glucosa, fructosa, sacarosa y almidón; ácidos orgánicos tales como ácido acético y ácido propiónico; y alcoholes tales como etanol y propanol. Los ejemplos de fuentes de nitrógeno incluyen: amoniaco; sales de amonio de ácidos inorgánicos u orgánicos tales como cloruro de amonio, sulfato de amonio, acetato de amonio y fosfato de amonio; otros compuestos que contienen nitrógeno; peptona; extractos de carne; y licor de maíz fermentado. Los ejemplos de sales inorgánicas incluyen: fosfato de monopotasio, fosfato de dipotasio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro de sodio, sulfato de hierro (I), sulfato de manganeso, sulfato de cobre y carbonato de calcio. Según el tipo de marcador de selección, puede añadirse de manera adecuada un agente antibiótico, tal como aureobasidina, ampicilina o tetraciclina, a un medio.

Alternativamente, puede eliminarse un aminoácido que puede suministrarse mediante un gen que complementa la auxotrofía (por ejemplo, Leu, Ura o Trp).

Cuando se cultiva la célula huésped transformada, en el caso de levadura, por ejemplo, el nivel de pH del medio se ajusta preferiblemente a de 4 a 7. La temperatura de cultivo es de entre 15ºC y 32ºC, y preferiblemente de aproximadamente 28ºC. Cuando se expresa una proteína que tiene una estructura estérica complicada como anticuerpo, el cultivo puede llevarse a cabo preferiblemente a baja temperatura, con el fin de plegar de manera más eficaz una proteína de este tipo en la célula. La duración del cultivo es generalmente de aproximadamente 24 a 1.000 horas, y el cultivo puede llevarse a cabo por medio de un cultivo discontinuo, tal como un cultivo estático, con sacudidas, con agitación o con aireación, o por medio de un cultivo continuo.

Un producto de expresión de un gen de una proteína foránea del producto de cultivo (es decir, una disolución de cultivo o células cultivadas) puede confirmarse por medio de SDS-PAGE, inmunotransferencia de tipo Western, ELISA, o similares.

Las proteínas producidas pueden aislarse y purificarse por medio de técnicas convencionales para el aislamiento y la purificación de proteínas. Cuando se producen proteínas diana en las bacterias o las células tras el cultivo, las bacterias o las células pueden pulverizarse usando, por ejemplo, un pulverizador ultrasónico, una prensa francesa, un homogeneizador Manton-Gaulin, un molino Dinomil, o similares, para obtener las proteínas diana. Cuando las proteínas diana se producen fuera de las bacterias o las células, la disolución de cultivo se usa tal cual, o las bacterias o las células se retiran por medio de centrifugación o similar. Después de esto, las proteínas diana se recogen por medio de extracción usando un disolvente orgánico, se someten a diversas técnicas de cromatografía (por ejemplo, cromatografía hidrófoba, de fase inversa, de afinidad o de intercambio iónico), filtración en gel usando tamices moleculares, electroforesis usando gel de poliacrilamida, o similar, según la necesidad. Estas técnicas pueden emplearse solas o en combinaciones de dos o más. Por tanto, pueden aislarse y purificarse las proteínas diana.

Las técnicas de cultivo y purificación anteriores son ejemplos, y los métodos no están limitados a las mismas. La secuencia de aminoácidos del producto génico purificado puede confirmarse mediante un método convencional de análisis de aminoácidos, tal como la secuenciación de aminoácidos automatizada por medio de la técnica de degradación de Edman.

5. Método para inhibir la cadena de O-azúcar (o método para inhibir la actividad PMT) En la presente invención, el cultivo mencionado anteriormente se lleva a cabo preferiblemente en condiciones en las que se inhibe la actividad proteína O-manosiltransferasa (PMT).

Se forma una cadena de O-azúcar en una célula de mamífero tras la adición de GalNAc mediante la péptido O- GalNAc transferasa, que está presente principalmente en el aparato de Golgi. Tal adición de cadena de azúcar tiene lugar tras el plegamiento de proteínas. Por el contrario, la formación de cadena de O-azúcar en células de levadura y moho se inicia tras la adición de manosa a un residuo de serina o treonina de la proteína mediante una proteína O- manosiltransferasa (PMT) codificada por el gen de PMT. Tal adición se denomina actividad PMT. La adición de manosa tiene lugar en paralelo al plegamiento de proteínas en el retículo endoplásmico (ER) en la célula. Por tanto, puede añadirse de manera desventajosa una cadena de azúcar innecesaria a un sitio en el que tal adición no tendría lugar en el caso de la expresión de proteínas de mamífero. Por consiguiente, tal modificación innecesaria provocaría una formación de agregados insuficiente y reduciría la actividad.

Por consiguiente, realizando el cultivo en condiciones en las que se inhibe la actividad proteína O- manosiltransferasa (PMT), puede inhibirse la formación de una cadena de O-azúcar innecesaria. Esto también acelera la agregación de proteínas y permite mantener la actividad y propiedades físicas nativas de proteínas. En la presente invención, los efectos de la producción secretora de alto nivel de proteínas por medio de la introducción del gen HAC1 activado y/o el gen de RRBP pueden producir adicionalmente efectos sinérgicos regulando la formación de cadena de O-azúcar potenciada por UPR por medio de la inhibición de la actividad PMT.

La adición de una cadena de O-azúcar peculiar para una levadura o un moho puede inhibirse mediante, por ejemplo, los dos métodos descritos a continuación. Estos métodos pueden realizarse en combinación.

(1) El cultivo y la producción se llevan a cabo en condiciones en las que se inhibe la actividad PMT que experimenta la adición de una cadena de O-azúcar peculiar para una levadura o un moho.

(2) Se usan células en las que se inhibe la actividad PMT que experimenta la adición de una cadena de O-azúcar peculiar para una levadura o un moho.

La actividad proteína O-manosiltransferasa (PMT) de (1) anteriormente puede inhibirse con la adición de un inhibidor de la actividad PMT (es decir, un inhibidor de PMT) al medio, por ejemplo. Un ejemplo de un inhibidor de la actividad PMT que puede usarse es el derivado de ácido rodanin-3-acético (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 14, págs. 3975-3978, 2004). Los ejemplos específicos del derivado de ácido rodanin-3-acético incluyen ácido 5-[[3,4-(1- fenilmetoxi)fenil]metilen]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolidinacético (compuesto (1c) descrito en Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 14, pág. 3975, 2004) y ácido {(5Z)-4-oxo-5-[3-(1-feniletoxi)-4-(2-feniletoxi)benciliden]-2-tioxo- 1,3-tiazolidin-3-il}acético (compuesto (5a) descrito en Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 14, pág. 3975, 2004). Un inhibidor de la actividad PMT de este tipo (el derivado de ácido rodanin-3-acético) se examinó por primera vez como agente antibacteriano, y no se examinó con el propósito de mejorar la productividad o calidad de proteínas. Los efectos del mismo se descubrieron por primera vez en la presente invención. PMT es importante para la generación de manoproteínas que constituyen la pared celular de levadura. Una actividad PMT excesivamente reducida afectará de manera adversa al crecimiento de levadura. Por consiguiente, cuando se usan sistemas de expresión inducible, la adición de un inhibidor de la actividad PMT en el momento de la expresión de genes de proteínas foráneas, tras el crecimiento celular, sería más eficaz. Por tanto, pueden producirse al máximo nivel proteínas diana de alta calidad en las que se inhibe la modificación de cadena de O-azúcar.

La actividad proteína O-manosiltransferasa (PMT) descrita en (2) anteriormente puede inhibirse perturbando el gen de PMT o inhibiendo la expresión de tal gen. En S. cerevisiae, PMT está codificada por al menos 6 genes; es decir, el gen de PMT1 (GenBank: L19169), el gen de PMT2 (GenBank: L05146), el gen de PMT3 (GenBank: X83797), el gen de PMT4 (GenBank: X83798), el gen de PMT5 (GenBank: X95644) y el gen de PMT6 (GenBank: Z72984), y estos genes forman independientemente un homodímero (PMT4p) o un heterodímero (PMT1p/PMT2p) y presentan actividad. Se sabe que la PMT que actúa varía según una glicoproteína. En la presente invención, se encontró que las proteínas PMT tienen selectividad con respecto a la adición de una cadena de O-azúcar a un anticuerpo. Específicamente, los efectos de la inhibición de la adición de cadena de O-azúcar no se encontraron en la cepa deficiente en el gen de PMT5 o PMT6, tal como se describe en los ejemplos.

Por tanto, PMT es un gen importante para el crecimiento de levadura. Cuando la actividad, tal como la perturbación del gen de PMT, se elimina o se reduce extremadamente, la pared celular se vuelve frágil. Por tanto, el uso de una cepa deficiente en el gen de PMT requiere atención. La perturbación de genes de PMT divulgada en el documento WO 2002/046437 no siempre es eficaz. En ocasiones puede afectar de manera adversa al crecimiento de una proteína foránea debido a la inhibición del crecimiento y la inhibición de la perturbación o expresión de genes de PMT que tiene una actividad PMT óptima, lo que puede minimizar la adición de cadena de O-azúcar y la modificación en la proteína diana, si se desea. Los ejemplos de métodos para inhibir genes de PMT incluyen un método que implica el uso de ARN antisentido o ARNi y un método de atenuación de un promotor. En la presente invención, se demuestra que un método en el que se inserta un fragmento de ADN en la parte de gen estructural de PMT y la región de promotor para escindir el gen (a continuación en el presente documento, tal método puede denominarse “inactivación mediante inserción de genes” y un vector de plásmido para la inactivación mediante inserción de genes se denomina “vector de inactivación mediante inserción”) es un ejemplo de un medio para atenuar un promotor. Además, también puede emplearse un método en el que se introduce un fragmento de gen de PMT que no tiene actividad PMT pero se genera como proteína o gen cuyo residuo de aminoácido relacionado con la actividad se ha mutado, para inhibir la actividad PMT (es decir, un método del dominante negativo).

Mejores modos para llevar a cabo la invención

A continuación en el presente documento, la presente invención se describe en detalle con referencia a los ejemplos, aunque el alcance técnico de la presente invención no está limitado a los ejemplos. Los plásmidos, las enzimas de restricción, las enzimas modificadoras de ADN, y similares que se usan en los ejemplos de la presente invención son productos disponibles comercialmente, y estos productos pueden usarse según técnicas convencionales. Además, los procedimientos de clonación de ADN, secuenciación de nucleótidos, transformación de células huésped, cultivo de células huésped transformadas, toma de muestras y purificación de enzimas a partir de productos de cultivo, y similares se conocen ampliamente en la técnica o pueden aprenderse a través de publicaciones existentes.

[Ejemplo 1] Construcción de plásmido de expresión de gen foráneo (1) Construcción de vector en tándem de expresión de gen foráneo que comprende el promotor del gen AOX1 que tiene el gen resistente a G418 como marcador, el casete terminador y el promotor del gen GAP, y el casete terminador Se usaron como materiales pOMex3G y pOMexGP1U dados a conocer en el documento WO 2003/091431. Se escindió pOMex3G con XbaI y se le proporcionaron extremos romos, seguido por introducción del ligador SpeI. Se designó el vector resultante como pOMex3GXS. Por separado, se escindió pOMexGP1U con EcoT22I y se le proporcionaron extremos romos, seguido por introducción del ligador ApaI. Se designó el vector resultante como pOMexGP1UTA. Se digirió pOMexGP1UTA con HindIII y KpnI y se le proporcionaron extremos romos. Después de esto, se digirió el fragmento aislado de aproximadamente 2,0 kb que contenía un promotor y un terminador de GAP con ApaI y entonces se introdujo en el pOMex3GXS de extremos romos. Se designó el vector resultante como pOMexGAT-G. pOMexGAT-G es un vector en tándem que comprende el sitio SpeI-BamHI dentro del casete de expresión de AOX1 y el sitio SalI-ApaI dentro del casete de expresión de GAP.

(2) Construcción de un vector de expresión de gen foráneo con el uso de un promotor y un terminador del gen GAP usando el gen ADE1 como marcador de selección Se usó como material pOMex4A divulgado en el documento WO 2003/091431. Se trató pOMexGP1U mencionado anteriormente con EcoT22I y se le proporcionaron extremos romos, seguido por introducción del ligador BamHI. Se designó el vector resultante como pOMexGP2U. Se trató pOMexGP2U con SalI y se le proporcionaron extremos romos, seguido por introducción del ligador SpeI. Se designó el vector resultante como pOMexGP3U. Se digirió pOMexGP3U con HindIII y KpnI, y se aisló un fragmento de aproximadamente 2,0 kb que contenía el casete de expresión de GAP. Se ligó el fragmento resultante a un fragmento de aproximadamente 5,0 kb que comprende el marcador de ADE1 aislado tratando pOMex4A con HindIII-KpnI. Se designó el vector resultante como pOMexGP1A.

pOMexGP1A es un vector de expresión de gen foráneo que comprende el sitio SpeI-BamHI dentro del casete de expresión de GAP.

(3) Construcción de un vector de expresión de gen foráneo con un promotor y un terminador de fosfoglicerina cinasa (PGK1) y usando un gen resistente a higromicina B como marcador de selección Se obtuvo el gen PGK1 que codifica para fosfoglicerina cinasa a partir de la cepa IFO10746 de Ogataea minuta y se determinó la secuencia de nucleótidos del mismo.

(3-1) Preparación de sondas Se sintetizaron cebadores degenerados de ADN que comprendían secuencias de nucleótidos correspondientes a las secuencias de aminoácidos conservadas, es decir, RVDFNVPLD y EGKELPGVA, derivadas de Saccharomyces cerevisiae (número de registro de GenBank: P00560) y Candida maltosa (número de registro de GenBank: P41757) de la siguiente manera.

PPG5: 5’-GN GTN GAY TTY AAY GTN CCN TTR GA-3’ (SEQ ID NO: 1) PPG3: 5’-GY NAC DCC NGG YAA YTC YTT DCC YTC-3’ (SEQ ID NO: 2) El cebador PPG5 (SEQ ID NO: 1) corresponde a la secuencia de aminoácidos, RVDFNVPLD, y el cebador PPG3 (SEQ ID NO: 2) es una secuencia de una hebra complementaria de una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos, EGKELPGVA. Se usó ADN cromosómico de la cepa IFO10746 de O. minuta como molde, se llevó a cabo una PCR usando los cebadores PPG5 y PPG3 a 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto, y se repitió este ciclo 25 veces. Se recuperó el fragmento de ADN amplificado (de aproximadamente 1,2 kb) y se clonó usando el kit de clonación TOPO TA. Se aisló ADN plasmídico del clon resultante y se determinó la secuencia de nucleótidos. Por tanto, se seleccionó un clon que tenía una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que tiene una alta homología con la secuencia de aminoácidos del gen PGK1 derivado de S. cerevisiae y C. maltosa en el fragmento de ADN con inserción de plásmido. Se recuperó el fragmento con inserción de ADN de 1,2 kb tras escindir el plásmido con EcoRI, seguido por electroforesis en gel de agarosa.

(3-2) Preparación y examen de la biblioteca Se escindió ADN cromosómico de la cepa IFO10746 de O. minuta con diversas enzimas de restricción y se realizó electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Se transfirió el ADN separado a la membrana de nailon Hybond N+ (Amersham). Se marcó el fragmento de ADN obtenido en (1-3-1) anteriormente con el uso de AlkPhos DIRECT (Amersham), seguido por hibridación de tipo Southern. Se llevó a cabo la hibridación según una técnica convencional (Molecular cloning 2ª ed., ed. Sambrook, J., et al., Cold Spring Harbor Laboratory U.S.A., 1989). Como resultado, se consideró que el gen PGK1 estaba presente en un fragmento de BamHI de aproximadamente 9,0 kb. Con el fin de clonar el fragmento de ADN, se preparó una biblioteca genómica. Se escindió ADN cromosómico de O.

minuta con BamHI y se sometió a electroforesis en agarosa, y se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 9,0 kb del gel. Se ligó el fragmento de ADN recuperado al pUC118 escindido con BamHI y se transformó en la cepa DH5 de E. coli según el método de Hanahan (Gene, 10, 63, 1980) para preparar la biblioteca. Se examinaron aproximadamente 4.000 clones por medio de hibridación de colonias usando los fragmentos de ADN mencionados anteriormente como sondas. De entre los clones positivos obtenidos, se seleccionaron los plásmidos pOMPGK1 que portaban los genes PGK1.

(3-3) Secuenciación de nucleótidos Se determinó la secuencia de nucleótidos en la región de BamHI en el plásmido pOMPGK1 mediante el método de paseo con cebador y se encontró que la secuencia determinada tenía la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 3. La secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 3 comprende un marco de lectura abierto que comprende 1.254 pares de bases desde los nucleótidos 4.766 hasta 6.016. Se inspeccionó la homología entre la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 que se deduce basándose en el marco de lectura abierto y fosfoglicerina cinasas derivadas de Saccharomyces cerevisiae y Candida maltosa. Como resultado, se encontró que la primera homología era del 74% y que la segunda homología era del 81%.

(3-4) Construcción de un casete de expresión de gen foráneo usando el promotor y el terminador del gen PGK1 Se preparó un casete de expresión que introduce un gen foráneo entre un fragmento que contenía el promotor del gen PGK1 y un fragmento que contenía un terminador de O. minuta. Con el fin de introducir los sitios SpeI, BglII y BamHI entre el promotor y el terminador del gen PGK1, se sintetizaron los siguientes cebadores.

OPGK-P-F: 5’-AAGCTTGACAATGTAGGAGATCATAAACACATCGTGCGCGTC-3’ (SEQ ID NO: 5) OPGK-P-R: 5’-GGATCCAGATCTCATATGACTAGTTGCTAGTTCTATGCGG CGTTAGTGTTTACACTACGACAGCT- 3’ (SEQ ID NO: 6) OPGK-T-F: 5’-GGATCCGTGGGATTTGCGTGATCTACGTAGTGGTTATTTT-3’ (SEQ ID NO: 7) OPGK-T-R: 5’-GGTACCGCAGTGAAAGGCGATGCCACCATGTGCAAGGAG TTC-3’ (SEQ ID NO: 8) Usando el pOMPGK1 anterior como molde, se llevó a cabo una PCR usando el cebador OPGK-P-F (SEQ ID NO: 5) y el cebador OPGK-P-R (SEQ ID NO: 6) a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto, y se repitió este ciclo 20 veces. Además, se llevó a cabo una PCR usando el cebador OPGK-T-F (SEQ ID NO: 7) y el cebador OPGK-T-R (SEQ ID NO: 8) a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto, y se repitió este ciclo 20 veces. Se recuperaron los fragmentos de ADN de 1,5 kb y 1,0 kb amplificados y se clonaron usando el kit de clonación TOPO TA. Se determinaron las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de ADN de inserción para seleccionar clones que tenían las secuencias de nucleótidos correctas. Se aislaron los fragmentos de ADN de inserción de 1,5 kb y 1,0 kb como el fragmento de HindIII-BamHI y el fragmento de BamHI- KpnI, respectivamente.

Se introdujo el fragmento de BamHI-KpnI de 1,0 kb mencionado anteriormente entre BamHI y KpnI de pOMex5H descrito en el documento WO 2003/091431. Después de esto, se introdujo el fragmento de HindIII-BamHI de 1,5 kb mencionado anteriormente entre HindIII y BamHI del plásmido obtenido. Se designó el plásmido resultante como pOMexPGHy. pOMexPGHy es un vector de expresión de gen foráneo que comprende los sitios SpeI, BglII y BamHI en el casete de expresión del gen PGK1.

[Ejemplo 2] Construcción de vector de expresión de gen de anticuerpo Con el fin de clonar una señal de secreción de MF alfa1 (número de registro de GenBank: P01149) derivado de S.

cerevisiae (denominada a continuación en el presente documento la “señal de secreción de aMF”), se sintetizaron los siguientes cebadores.

Sp-aMFs-F: 5’-ACTAGTATGAGATTTCCTTCAATTT-3’ (SEQ ID NO: 9) S1-aMFs-F: 5’-GTCGACATGAGA’ITTCCTTCAATTT-3’ (SEQ ID NO: 10) Xb-aMFs-R: 5’-AGCTTCAGCCTCTCTTTTATCTAGAGA-3’ (SEQ ID NO: 11) Se usó el ADN de genoma de S. cerevisiae obtenido de la misma manera que se describió anteriormente como molde para llevar a cabo una PCR usando el cebador Sp-aMFs-F (SEQ ID NO: 9) y el cebador Xb-aMFs-R (SEQ ID NO: 11) a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 30 segundos, y se repitió este ciclo 20 veces. Además, se llevó a cabo una PCR usando el cebador S1-aMFs-F (SEQ ID NO: 10) y el cebador Xb-aMFs-R (SEQ ID NO: 11) a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 30 segundos, y se repitió este ciclo 20 veces. Se recuperaron los fragmentos de ADN amplificados de aproximadamente 0,3 kb en cada PCR y se clonaron usando el kit de clonación TOPO TA. Se confirmaron las secuencias de nucleótidos de las secuencias de ADN de inserción, y se designaron los plásmidos resultantes como TOPOaMFsSP y TOPOaMFsSL, respectivamente.

Se usó el gen de anticuerpo anti-receptor de TRAIL (documento WO 2002/094880) como gen de anticuerpo. Con el fin de introducir sitios de enzima de restricción en sitios en ambos extremos terminales de los genes de cadena ligera y cadena pesada, se sintetizaron los siguientes cebadores.

Xb-KREAEA-Hc-F: 5’-TCTCTAGATAAAAGAGAGGCTGAAGCTCAGCTGCAGCTGCAGGAGTC-3’ (SEQ ID NO: 12) Hc-R-Bg: 5’-CCAGATCTGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3’ (SEQ ID NO: 13) Xb-KREAEA-Lc-F: 5’-TCTCTAGATAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAAATTGTGTTGACACAGTC-3’ (SEQ ID NO: 14) Lc-R-Ap: 5’-AAAGGGCCCTCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCT-3’ (SEQ ID NO: 15) Usando estos cebadores de ADN, se llevó a cabo una PCR para amplificar una cadena ligera por medio de 20 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto y para amplificar una cadena pesada por medio de 20 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto y 30 segundos, y se clonaron los productos amplificados en pCR2.1-TOPO. Se confirmaron las secuencias de nucleótidos de las secuencias de ADN de inserción, se designaron los plásmidos resultantes como TOPOHc-Trail y TOPOLc-Trail, respectivamente. Se introdujeron una señal de secreción de aMF aislada de TOPOaMFsSL por medio de digestión con SalI y XbaI y una cadena ligera de anticuerpo aislada de TOPOLc-Trail por medio de digestión con XbaI y ApaI en el pOMexGAT-G digerido con SalI-ApaI por medio de ligación de 3 fragmentos. Se designó el plásmido resultante como pOMexGATG/L. Posteriormente, se introdujeron una señal de secreción de aMF aislada de TOPOaMFsSP por medio de digestión con SpeI y XbaI y una cadena pesada de anticuerpo aislada de TOPOHc-Trail por medio de digestión con XbaI y BglII en el pOMexGAT-G/L digerido con SpeI-BamHI por medio de ligación de 3 fragmentos. Se designó el vector resultante como pOMexGAT-G/Ab (figura 3). pOMexGAT-G/Ab es un vector de expresión de anticuerpo que comprende las unidades de expresión tanto de la cadena pesada como de la cadena ligera de anticuerpo.

[Ejemplo 3] Construcción del vector de expresión de gen HAC1 activado de O. minuta Se obtuvo el gen HAC1 activado cultivando células (cepas YK2-3 de O. minuta) en medio YPD a 27ºC durante 12 horas y añadiendo tunicamicina hasta una concentración de 10 g/ml en el medio para inducir UPR. Se llevó a cabo el cultivo en un medio que contenía tunicamicina durante 12 horas adicionales. Una vez recogidas las células, se preparó ARNm usando el kit de ARN Yeastar (ZYMO research).

Se sometió el ARNm obtenido a tratamiento con ADNasa usando ADNasa I de calidad para amplificación (Invitrogen). Se sintetizó el ADNc a partir del ARNm usando el sistema de síntesis de primera hebra para RT Super script III (Invitrogen). Se amplificó el ADNc resultante por medio de PCR usando el cebador de ADN HAC1-1 (SEQ ID NO: 16) y el cebador HAC1-12 (SEQ ID NO: 17) descritos a continuación a 94ºC durante 30 segundos, 52ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto, y se repitió este ciclo 30 veces. Se clonaron los productos amplificados en pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Después de esto, se confirmaron las secuencias de nucleótidos de los dos tipos de fragmentos de genes amplificados por PCR (SEQ ID NO: 18 y 19).

HAC1-1: 5’-ATGACTTCCTTTTCAGCACCGCATC-3’ (SEQ ID NO: 16) HAC1-12: 5’-CAAAATTGCAAGCAAGTTAACCG-3’ (SEQ ID NO: 17) Uno de los dos tipos de fragmentos de ADNc obtenidos concordaba con la secuencia genómica; sin embargo, el otro fragmento era una secuencia acortada que carecía de parte de la misma, es decir, un fragmento de ADNc sometido a corte y empalme por Ire1p activado por UPR. Con el fin de obtener ADNc del HAC1 activado, se repitió un ciclo de PCR de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 30 segundos, y se repitió 20 veces usando el conjunto de ADNc, que se dedujo que contenía el cebador de ADN speHAC1F (SEQ ID NO: 20), el cebador bglHAC1R (SEQ ID NO: 21) y ADNc del HAC1 activado.

speHAC1F: 5’-gactagtATGACTTCCTTTTCAGCACCG-3’ (SEQ ID NO: 20) bglHAC1R: 5’-cagatctTCATGACAAGAAATCATCGAAT-3’ (SEQ ID NO: 21) el fragmento obtenido de aproximadamente 1 kb comprendía una secuencia desde el codón de iniciación hasta el codón de terminación del gen HAC1 activado (SEQ ID NO: 22), que es equivalente a la secuencia de aminoácidos de Hac1p activado que comprende 320 residuos de aminoácido (SEQ ID NO: 23). Se trató esta secuencia con SpeI y BglII, se aisló y entonces se introdujo en el pOMexPGHy tratado con SpeI-BglII. Se designó el vector resultante como pOMexPGHy/Hac1 (figura 3). Este vector comprende una unidad de expresión de gen HAC1 activado.

[Ejemplo 4] Construcción de vector de expresión de gen de RRBP1 de humano Se usó el gen de RRBP1 de humano (KIAA1398, n.º de registro de GenBank AB037819) facilitado por el Instituto de Investigación de ADN de Kazusa. Con el fin de introducir sitios de enzima de restricción en ambos extremos terminales del gen, se usaron los siguientes cebadores de ADN, p180 MSp-F y p180 UBg-R (SEQ ID NO: 24 y 25), y el gen de RRBP1 de humano para amplificar el gen de interés mediante PCR por medio de 20 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 5 minutos.

p180 MSp-F: 5’-ATACAATACAAAGTCGAGACTAGTATGGATATTTACGACACTCAAACCTT-3’ (SEQ ID NO: 24) p180 UBg-R: 5’-TCTATCCACACGGATCAGATCTTCAGACAGAGGTGCCCTCCTTTGAGCTG-3’ (SEQ ID NO: 25) Se introdujo el fragmento resultante de aproximadamente 4,5 kb en el pOMexGP1A digerido con SpeI-BamHI usando el kit de clonación por PCR In-Fusion Dry-Down de BD (BD Science). Se determinó una secuencia de aproximadamente 500 pb que comprende una región que codifica para el codón de iniciación del gen de RRBP1 de humano a partir del sitio SpeI, y se determinó un fragmento de aproximadamente 500 pb que comprende una región que codifica para el codón de terminación del gen de RRBP1 de humano a partir del sitio BamHI. Se designó el vector resultante como pOMexGP1A/p180PCR. Se digirió pOMexGP1A/p180PCR con NdeI y AscI, y se eliminó un fragmento que comprende una región de desde 110 pb pasta 4541 pb en ORF del gen de RRBP1 de humano del plásmido. Por separado, se digirió el gen de RRBP1 de humano facilitado por el Instituto de Investigación de ADN de Kazusa con NdeI y AscI, se aisló un fragmento que comprende una región de desde 110 pb hasta 4541 pb en ORF, y se introdujo el fragmento aislado en el pOMexGP1A/p180PCR digerido con NdeI-AscI mencionado anteriormente. Se designó el vector resultante como pOMexGP1A/p180 (figura 3). pOMexGP1A/p180 es el vector de expresión del gen de RRBP1 de humano.

[Ejemplo 5] Preparación la cepa de levadura de expresión de anticuerpos (O. minuta) Usando el vector pOMexGAT-G/Ab digerido con NotI, se transformaron cepas YK-3 de O. minuta (och1pep4prb1yps1ura3ade1: descritas en el documento WO 2003/091431) por medio de electroporación.

Se emplearon las condiciones para electroporación descritas en el documento WO 2003/091431. Se seleccionaron las células transformadas en medio de placa de agar YPD que contenía 50 g/ml de G418 y se cultivaron. Después de esto, se extrajeron los genomas, se confirmó la introducción de una cadena pesada por medio de PCR usando el cebador de ADN Xb-KREAEA-Hc (SEQ ID NO: 12) y el cebador Hc-R-Bg (SEQ ID NO: 13) mencionados anteriormente, y se confirmó la introducción de una cadena ligera por medio de PCR usando el cebador Xb- KREAEA-Lc-F (SEQ ID NO: 14) y el cebador Lc-R-Ap (SEQ ID NO: 15) mencionados anteriormente. La cepa en la que se había observado la introducción de los genes de cadena pesada y cadena ligera se designó como la cepa AO1 de O. minuta productora de anticuerpos.

[Ejemplo 6] Preparación de cepa de levadura productora de anticuerpos (O. minuta) que expresa el gen HAC1 activado y el gen de RRBP1 Se introdujo pOMexGP1A/p180 digerido con Sse8783I en la cepa AO1 de O. minuta productora de anticuerpos hecha crecer en el ejemplo 5 por medio de electroporación. Se obtuvo la cepa transformada seleccionando una cepa ADE+ en medio de placa de agar SD, cultivando la cepa, extrayendo el genoma y confirmando la introducción del gen de RRBP1 por medio de PCR usando p180 MSp-F (SEQ ID NO: 24) y p180 UBg-R (SEQ ID NO: 25) mencionados anteriormente. La cepa transformada obtenida se designó como la cepa AK2R de O. minuta. Al mismo tiempo, se llevó a cabo transformación usando pOMexGP1A digerido con Sse8783I para obtener la cepa AK2A de O. minuta como control. Además, se introdujo pOMexPGHy-Hac1 digerido con Aor51HI en la cepa AK2R de O. minuta AK2R y la cepa AK2A de O. minuta por medio de electroporación. Se confirmó la introducción del gen HAC1 activado en la cepa transformada seleccionando una cepa en un medio de placa de agar YPD que comprende higromicina a 50 g/ml, cultivando la cepa, extrayendo el genoma y confirmando por medio de PCR usando el cebador de ADN speHAC1F (SEQ ID NO: 20) y el cebador bgIHAC1R (SEQ ID NO: 21). Se designaron las cepas resultantes como la cepa AK3RH de O. minuta y la cepa AK3AH de O. minuta. Al mismo tiempo, se introdujo pOMexPGHy digerido con Aor51HI en la cepa AK2R de O. minuta y la cepa AK2A de O. minuta para obtener la cepa AK3RHy de O. minuta y la cepa AK3AHy de O. minuta como controles.

[Ejemplo 7] Confirmación de la secreción de anticuerpos por cepa de levadura transformada (O. minuta) Se cultivaron las cepas AK3RH de O. minuta, AK3AH de O. minuta, AK3RHy de O. minuta y AK3AHy de O. minuta en medio BYPMG (extracto de levadura al 1% (Difco), polipeptona al 2% (Difco), metanol al 1,5%, glicerol al 0,5% y tampón fosfato 0,1 M (pH 6,0)) a 28ºC durante 4 días. Se preparó un sobrenadante de cultivo a partir de la disolución de cultivo y se sometió a SDS-PAGE. Se sometieron las proteínas separadas a transferencia en una membrana de PVDF, y se realizó análisis de tipo Western usando anticuerpos anti-humano marcados (anticuerpo anti-Fc de humano y anticuerpo anti- de humano). Como resultado, se encontró que la cepa en la que se había introducido el gen de RRBP1 y el gen HAC1 activado secretaba una cantidad significativamente mayor de anticuerpos que otras cepas, tal como se muestra en la figura 4.

[Ejemplo 8] Productividad de anticuerpos secretores mediante cepa de levadura transformada (O. minuta) Se sometió la disolución de cultivo preparada en el ejemplo 7 a HPLC usando columnas de proteína A (Poros A 50 um, 4,6 mm, D/50 mml, Applied Biosystems) para medir la cantidad de producción de anticuerpos (condiciones de separación: tampón de equilibrado: tampón fosfato 10 mM (pH 6,0); tampón de elución: tampón fosfato 10 mM (pH 3,4); velocidad de flujo: 4 ml/min; detección: 210 nm). Como muestra patrón, se usó un anticuerpo producido en células animales (CHO). La figura 5 muestra la productividad de anticuerpos por DO 600 = 1. Las cantidades de anticuerpos secretados en la cepa AK3RHy de O. minuta en la que sólo se había introducido el gen de RRBP1 y en la cepa AK3AH de O. minuta en la que sólo se había introducido el gen HAC1 activado tendieron a aumentar, en comparación con la cantidad en la cepa control, es decir, la cepa AK3AHy de O. minuta. Sin embargo, la cantidad de producción de anticuerpos en la cepa AK3RH de O. minuta en la que se expresaban tanto el gen HAC1 activado como el gen de RRBP1 fue significativamente mayor que en la cepa control, es decir la cepa AK3AHy de O. minuta, y en la cepa en la que se había introducido únicamente el gen HAC1 activado o el gen de RRBP1. Por tanto se confirmó que la coexpresión del gen HAC1 activado y el gen de RRBP1 produciría efectos mayores que los efectos sinérgicos sobre la productividad de anticuerpos.

[Ejemplo 9] Producción de anticuerpos en condiciones en las que se inhibe la formación de la cadena de O-azúcar usando la cepa de levadura transformada (O. minuta) Se cultivaron AK3RH de O. minuta y AK3AHy de O. minuta en medio BYPG (extracto de levadura al 1% (Difco), polipeptona al 2% (Difco), glicerol al 0,5% y tampón fosfato 0,1 M (pH 6,0)) durante 2 días, y se cultivaron estas cepas en medios BYPM [extracto de levadura al 1% (Difco), polipeptona al 2% (Difco), metanol al 1,5% y tampón fosfato 0,1 M (pH 6,0)] a los que se habían añadido inhibidores de PMT 0 M, 1 M, 5 M, 10 M, 20 M y 50 M (el derivado de ácido rodanin-3-acético: ácido 5-[[3,4-(1-fenilmetoxi)fenil]metilen]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolidinacético (compuesto (1c) descrito en Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 14, pág. 3975, 2004)) a 28ºC durante 2 días. Se preparó un sobrenadante de cultivo a partir de la disolución de cultivo y se sometió a SDS-PAGE. Después de esto, se sometieron las proteínas separadas a transferencia en una membrana de PVDF, y se llevó a cabo análisis de tipo Western usando un anticuerpo anti-humano marcado (anticuerpo anti-Fc de humano). La figura 6 muestra los resultados del mismo. La concentración adecuada del inhibidor de PMT que había que añadir era 5 M. En tal caso, se aumentó la cantidad de secreción de anticuerpos y el porcentaje de formación de agregado.

[Ejemplo 10] Construcción de vector de expresión de gen de anticuerpo Con el fin de expresar una proteína de fusión de la señal de secreción de MF alfa1 derivada de S. cerevisiae

(número de registro de GenBank: P01149) (denominada a continuación en el presente documento “señal de secreción de aMF”), se ligó la cadena ligera del anticuerpo anti-receptor de TRAIL, y la cadena pesada del mismo, la señal de secreción del gen aMF al gen de anticuerpo anti-receptor de TRAIL (documento WO 2001/083560) por medio de PCR de extensión por solapamiento usando los siguientes cebadores oligonucleotídicos.

Para la señal de secreción de aMF-a y la cadena pesada de anticuerpo anti-receptor de TRAIL EcoALF: 5’-GGAATTCATGAGATTTCCTTCAAT-3’ (SEQ ID NO: 26) AlfH02: 5’-CTCCACCAGCTGTACTTCTCTTTTCTCGAGAGATA-3’ (SEQ ID NO: 27) AlfH03: 5’-TATCTCTCGAGAAAAGAGAAGTACAGCTGGTGGAG-3’ (SEQ ID NO: 28) AlfH04: 5’-GGTCGACTCATTTACCCGGGGACAG-3’ (SEQ ID NO: 29) Para la señal de secreción de aMF-a y la cadena ligera de anticuerpo anti-receptor de TRAIL EcoALF: 5’-GGAATTCATGAGATTTCCTTCAAT-3’ (SEQ ID NO: 26) AlfL02: 5’-TGGGTCATCTGAATGTCTCTTTTCTCGAGAGATA-3’ (SEQ ID NO: 30) AlfL03: 5’-TATCTCTCGAGAAAAGAGACATTCAGATGACCCA-3’ (SEQ ID NO: 31) AlfL04: 5’-GGTCGACCTAACACTCTCCCCTGT-3’ (SEQ ID NO: 32) Se amplificó la región del gen de señal de secreción de aMF usando, como molde, el ADN genómico de S. cerevisiae preparado usando el reactivo de extracción de ADN de levadura Y-DER (PIERCE). Se obtuvo la señal de secreción de aMF para la cadena pesada por medio de PCR usando el cebador EcoALF (SEQ ID NO: 26) y el cebador AlfH02 (SEQ ID NO: 27) a 95ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 60 segundos, y se repitió este ciclo 30 veces. Se obtuvo la señal de secreción de aMF para la cadena ligera por medio de PCR usando el cebador EcoALF (SEQ ID NO: 26) y el cebador AlfL02 (SEQ ID NO: 30) a 95ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 60 segundos, y se repitió este ciclo 30 veces. Se recuperaron los fragmentos de ADN diana amplificados de aproximadamente 0,26 kb.

Se amplificó la región de gen de anticuerpo usando ADNc del anticuerpo anti-receptor de TRAIL (documento WO2001/08356) como molde. Se obtuvo el fragmento de cadena pesada por medio de PCR usando el cebador AlfH03 (SEQ ID NO: 28) y el cebador AlfH04 (SEQ ID NO: 29) a 95ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 90 segundos, y se repitió este ciclo 30 veces. Se obtuvo el fragmento de cadena ligera por medio de PCR usando el cebador AlfL03 (SEQ ID NO: 31) y el cebador AlfL04 (SEQ ID NO: 32) a 95ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 90 segundos, y se repitió este ciclo 30 veces. Se recuperaron el fragmento de ADN diana de la región de cadena pesada amplificada de aproximadamente 1,35 kb y el de la región de cadena ligera de aproximadamente 0,65 kb.

Posteriormente, se usaron la región de señal de secreción de aMF para la cadena pesada y la región de cadena pesada de aproximadamente 1,35 kb como moldes para llevar a cabo una PCR usando el cebador EcoALF (SEQ ID NO: 26) y el cebador AlfH04 (SEQ ID NO: 29) a 95ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 90 segundos, y se repitió este ciclo 30 veces. Se recuperó el fragmento de ADN diana amplificado de aproximadamente 1,6 kb. Además, se usaron la región señal de secreción de aMF para la cadena ligera y la región de cadena ligera de aproximadamente 0,65 kb como moldes para llevar a cabo una PCR usando el cebador EcoALF (SEQ ID NO: 26) y el cebador AlfL04 (SEQ ID NO: 32) a 95ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 60 segundos, y se repitió este ciclo 30 veces. Se recuperó el fragmento de ADN diana amplificado de aproximadamente 0,9 kb. Se clonaron los fragmentos de ADN recuperados en pCR2.1-TOPO. Basándose en las secuencias de nucleótidos de los fragmentos de ADN de inserción, se encontró que estas secuencias tienen los genes en las que se había fusionado la señal de secreción de aMF en marco a la cadena pesada de anticuerpo y la señal de secreción de aMF se había fusionado en marco a la cadena ligera de anticuerpo, respectivamente. Los plásmidos obtenidos se designaron como TOPO-alfHc y TOPO-alfLc, respectivamente. Se usaron el sitio de enzima de restricción EcoRI introducido en el cebador EcoALF (SEQ ID NO: 26) y los sitios de enzima de restricción SalI introducidos en el cebador AlfH04 (SEQ ID NO: 29) y el cebador AlfL04 (SEQ ID NO: 32) para recuperar fragmentos de ADN que codifican para el producto de fusión de señal de secreción de aMF y la cadena pesada de anticuerpo y el de la señal de secreción de aMF y la cadena ligera de anticuerpo por medio de digestión con EcoRI-SalI a partir de TOPO-alfHc y TOPO-alfLc.

Con el fin de expresar la cadena pesada de anticuerpo y la cadena ligera de anticuerpo en S. cerevisiae, se ligaron fragmentos de ADN que codifican para el producto de fusión de señal de secreción de aMF y la cadena pesada de anticuerpo y el producto de fusión de señal de secreción de aMF y la cadena ligera de anticuerpo recuperado por medio de digestión con EcoRI-SalI al sitio EcoRI-SalI en el casete de promotor-terminador del gen de gliceraldehído- 3-fosfato deshidrogenasa (TDH3, GAP), que se había introducido en vector lanzadera YEp352 de E. coli-levadura (Yeast 2, págs. 163-167, 1986). Se designaron los plásmidos resultantes como YEp352GAP-II-alfHc y YEp352GAP- II-alfLc, respectivamente. Posteriormente, se usaron los sitios de enzima de restricción BamHI en ambos extremos terminales del casete de promotor-terminador de GAP para recuperar un fragmento de gen que codifica para BamHI- el promotor de GAP-la señal de secreción de aMF-la cadena pesada de anticuerpo-el terminador de GAP-BamHI (fragmento 1) y un fragmento de gen que codifica para BamHI-el promotor de GAP-la señal de secreción de aMF-la cadena ligera de anticuerpo-el terminador de GAP-BamHI (fragmento 2) a partir de YEp352GAP-II-alfHc y YEp352GAP-II-alfLc, respectivamente. Se introdujeron los fragmentos 1 y 2 en el sitio BamHI de YEp352GAP-II- alfHc o Ep352GAP-II-alfLc por medio de ligación de 3 fragmentos, de los que se había escindido el fragmento 1 ó 2. Se designó el vector resultante como YEp352 GAP-II-alfHc/alfLc (figura 7). Basándose en patrones de escisión de enzima de restricción, se confirmó la introducción en tándem de los fragmentos 1 y 2 en el sentido de avance en YEp352 GAP-IIalfHc/alfLc. YEp352 GAP-II-alfHc/alfLc es un vector de expresión de anticuerpo que porta unidades de expresión tanto de cadena pesada de anticuerpo como de cadena ligera.

[Ejemplo 11] Construcción de vector de expresión del gen HAC1 activado de S. cerevisiae

La actividad ARNasa de IRE1 activado elimina 252 nucleótidos del ARNm precursor de HAC1 de S. cerevisiae para formar ARNm de HAC1 maduro. Este ARNm de HAC1 maduro se traduce en HAC1 activado del que se eliminan 10 residuos de aminoácido del extremo C-terminal y al que se añaden nuevamente 18 residuos de aminoácido (PNAS 97, págs. 4660-4665, 2000). Por tanto, se construyó un gen que codifica para HAC1 activado por medio de PCR de extensión por solapamiento usando los siguientes cebadores oligonucleotídicos.

HAC-Sac-ATG: 5’-GGAGCTCATGGAAATGACTGATTTTG-3’ (SEQ ID NO: 33) HAC-internalR: 5’-GAATTCAAACCTGACTGCGCTTCTGGATTACGCCAATTGTCAA G-3’ (SEQ ID NO: 34) HAC-internalF: 5’-CTTGACAATTGGCGTAATCCAGAAGCGCAGTCAGGTTTGAATT C-3’ (SEQ ID NO: 35) HAC-Sma-STOP: 5’-GCCCGGGTCATGAAGTGATGAAGAAATC-3’ (SEQ ID NO: 36) Se usó ADN genómico de S. cerevisiae preparado con el uso de reactivo de extracción de ADN de levadura Y-DER (PIERCE) como molde. Se llevó a cabo una PCR usando el cebador HAC-Sac-ATG (SEQ ID NO: 33) y el cebador HAC-internalR (SEQ ID NO: 34) a 95ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 60 segundos, y se repitió este ciclo 30 veces. Por separado, se llevó a cabo una PCR usando el cebador HAC-internalF (SEQ ID NO: 35) y el cebador HAC-Sma-STOP (SEQ ID NO: 36) a 95ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 60 segundos, y se repitió este ciclo 30 veces. Se recuperaron los fragmentos de ADN diana amplificados de aproximadamente 0,66 kb (fragmento A) y de aproximadamente 0,06 kb (fragmento B).

Posteriormente, se usaron el fragmento A y el fragmento B amplificados como moldes para llevar a cabo una PCR usando el cebador HAC-Sac-ATG (SEQ ID NO: 33) y el cebador HAC-Sma-STOP (SEQ ID NO: 36) a 95ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 60 segundos, y se repitió este ciclo 30 veces para obtener el fragmento de ADN diana amplificado de aproximadamente 0,7 kb. Se clonó el fragmento de ADN recuperado en pCR2.1-TOPO. Basándose en la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN de inserción, se encontró que el fragmento tiene un gen que codifica para HAC1 activado que comprende 238 residuos de aminoácido. El plásmido se designó como TOPO-aHac1. Se usaron el sitio de enzima de restricción SacI que se había introducido en el cebador HAC-Sac-ATG (SEQ ID NO: 33) y el sitio de enzima de restricción SmaI que se había introducido en el cebador HAC-Sma-STOP (SEQ ID NO: 36) para recuperar un gen que codifica para HAC1 activado por medio de digestión con SacI-SmaI.

Con el fin de expresar HAC1 activado en S. cerevisiae, se ligó un gen que codifica para HAC1 activado recuperado por medio de digestión con SacI-SmaI al sitio SacI-SmaI en el casete de promotor-terminador del gen de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (TDH3, GAP), que se había introducido en el vector lanzadera YEp351 de E. coli-levadura (Yeast 2, págs. 163-167, 1986). Se designó el plásmido resultante como YEp351GAP-II-aHAC1 (figura 7). Este vector comprende una unidad de expresión de gen HAC1 activado.

[Ejemplo 12] Construcción de vector de expresión del gen de RRBP1 de humano Se usó el gen de RRBP1 de humano (KIAA1398, n.º de registro de GenBank: AB037819) facilitado por el Instituto de Investigación de ADN de Kazusa. Con el fin de introducir sitios de enzima de restricción en ambos extremos terminales del gen anterior, se amplificó el gen por medio de PCR usando los siguientes cebadores oligonucleotídicos, P180kpnatg y P180xbastop (SEQ ID NO: 37 y 38) y el gen de RRBP1 de humano a 95ºC durante 10 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 68ºC durante 6 minutos, y se repitió este ciclo 30 veces.

P180kpnatg: 5’-GGGTACCATGGATATTTACGACACTC-3’ (SEQ ID NO: 37) P180xbastop: 5’-GTCTAGATCAGACAGAGGTGCCCTCC-3’ (SEQ ID NO: 38) Se recuperó el fragmento resultante de aproximadamente 4.7 kb y se clonó en pCR2.1-TOPO. Basándose en la secuencia de nucleótidos del fragmento de ADN de inserción, se confirmó que regiones de aproximadamente 600 pb en ambos extremos terminales del fragmento de inserción comprendían de manera apropiada las secuencias de nucleótidos diana. Se designó el plásmido resultante como TOPO-P180. Posteriormente, se digirió TOPO-P180 con las enzimas de restricción NdeI y HpaI, y se eliminó un fragmento que contenía una región equivalente a una región de entre 110 pb y 4524 pb de KIAA1398. En la región eliminada, se introdujo un fragmento de NdeI-HpaI de aproximadamente 4,4 kb de KIAA1398 para construir TOPO-P180N, y se desmetiló el sitio de enzima de restricción XbaI con el uso de la cepa SCS110 de E. coli (Stratagene). Se usaron los sitios de enzima de restricción KpnI-XbaI que se habían introducido en el cebador P180kpnatg (SEQ ID NO: 37) y el cebador P180xbastop (SEQ ID NO: 38) para recuperar un fragmento de KpnI-XbaI que comprende un gen que codifica para RRBP1.

Con el fin de expresar RRBP1 en S. cerevisiae, se ligó el fragmento de KpnI-XbaI recuperado anterior al sitio KpnI- XbaI en el casete de promotor-terminador del gen de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (TDH3, GAP), que se había introducido en el vector lanzadera YEp352 de E. coli-levadura (Yeast 2, págs. 163-167, 1986). Se designó el plásmido resultante como YEp352GAP-II-p180. Posteriormente, se digirió YEp352GAP-II-p180 con la enzima de restricción PvuI, y se recuperó un fragmento de PvuI que contenía el promotor de GAP-el gen de RRBP1-terminador de GAP. Se ligó el fragmento de PvuI a un fragmento de PvuI que comprende un gen marcador, es decir, una región esencial para la replicación del vector lanzadera YEp351 de E. coli-levadura (Yeast 2, págs. 163-167, 1986) para construir YEp351GAP-II-p180 (figura 7). Este vector comprende la unidad de expresión del gen de RRBP1.

[Ejemplo 13] Construcción de vector de coexpresión para el gen HAC1 activado y el gen de RRBP1 Con el fin de introducir el gen HAC1 activado y el gen de RRBP1 con el uso de un único vector en S. cerevisiae, se construyó un vector de coexpresión para el gen HAC1 activado y el gen de RRBP1. Se digirió YEp351GAP-II-aHAC1 construido en el ejemplo 11 con la enzima de restricción HpaI. Posteriormente, se recuperó un fragmento de BamHI que contenía el promotor de GAP-el gen de RRBP1-terminador de GAP de YEp352GAP-II-p180 construido en el ejemplo 12, se proporcionaron extremos romos a ambos extremos terminales usando ADN polimerasa de T4 (Takara Bio), y se introdujo el fragmento resultante en el sitio HpaI de YEp351GAP-II-aHAC1. Se designó el plásmido resultante como YEp351GAP-II-aHAC1/p180 (figura 7). Se analizó la secuencia de nucleótidos para determinar la dirección para introducir el fragmento de BamHI que contenía el promotor de GAP-el gen de RRBP1- terminador de GAP introducido. Este vector comprende una unidad de expresión para el gen HAC1 activado y el gen de RRBP1.

[Ejemplo 14] Construcción de cepa de levadura que expresa anticuerpos y cepa de levadura que expresa anticuerpos (S. cerevisiae) que expresa el gen HAC1 activado y el gen de RRBP1 Se prepararon células competentes de las cepas BY4741 de S. cerevisiae (MATa his3 leu2met15 ura3) usando el kit Frozen-EZ Yeast Transformation II (ZYMO RESARCH). Se inocularon las cepas BY4741 de S. cerevisiae en 5 ml de medio YPAD (medio YPD que contenía adenina al 0,04% (Sigma)), y se usaron las células de levadura obtenidas del cultivo durante la noche (30ºC a 310 rpm). Se introdujeron los vectores de expresión construidos en el ejemplo 10 al ejemplo 13 en las cepas BY4741 de S. cerevisiae usando el kit Frozen-EZ Yeast Transformation II (ZYMO RESARCH). Se seleccionaron los transformantes crecidos en medio agar ST que comprende agar al 2% (la base de nitrógeno de levadura y medio de sulfato de amonio que comprende glucosa al 2%, adenina al 0,04% y KCl 0,3 M y que carece de uracilo y leucina (Sigma)) como las cepas de levadura que expresan anticuerpos.

YEp352 GAP-II-alfHc/alfLc que comprende las unidades de expresión de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo tiene el gen marcador URA3 que complementa la mutación que requiere uracilo de un huésped. YEp351 GAP-II (un vector de control en el que no se ha introducido el gen), YEp351GAP-II-aHAC1 (un vector de expresión de HAC1 activado), YEp351GAP-II-p180 (un vector de expresión de RRBP1) y YEp351GAP-II-aHAC1/p180 (un vector de coexpresión para el gen HAC1 activado y RRBP1) comprenden cada uno un gen marcador LEU2 que complementa la mutación que requiere leucina de un huésped. Por tanto, estos vectores se transformaron en un huésped, de modo que los genes sólo podían hacerse crecer cuando ambos vectores se introducían en combinación tal como se muestra a continuación para construir cuatro tipos de cepas de levadura que expresan anticuerpos.

T2K01 de S. cerevisiae YEp352 GAP-II-alfHc/alfLc (URA3)YEp351 GAP-II (LEU2) T2K02 de S. cerevisiae YEp352 GAP-II-alfHc/alfLc (URA3)YEp351GAP-II-aHAC1 (LEU2) T2K03 de S. cerevisiae YEp352 GAP-II-alfHc/alfLc (URA3)YTEp351GAP-II-p180 (LEU2) T2K04 de S. cerevisiae YEp352 GAP-II-alfHc/alfLc (URA3)YEp351GAP-II-aHAC1/p180 (LEU2) [Ejemplo 15] Productividad de anticuerpos mediante cepa de levadura transformada (S. cerevisiae) Se cultivaron las cepas T2K01 de S. cerevisiae, T2K02 de S. cerevisiae, T2K03 de S. cerevisiae y T2K04 de S.

cerevisiae preparadas en el ejemplo 14 usando medio ST a 30ºC durante 3 días. Se inoculó la disolución de cultivo en medio YPAD para dar como resultado una concentración final del 5% en el mismo, y se realizó el cultivo a 30ºC durante 3 días. Se preparó un sobrenadante de cultivo a partir de la disolución de cultivo, y se designó el sobrenadante resultante como una muestra que contenía anticuerpos secretados y producidos por levadura. Se sometieron los anticuerpos secretados y producidos a un ensayo cuantitativo por medio de ELISA de tipo sándwich.

Se adsorbieron proteínas de receptor de TRAIL que eran antígenos de los anticuerpos anti-receptor de TRAIL en una placa de 96 pocillos, se añadió una muestra de levadura, y se llevó a cabo la detección usando un anticuerpo anti-Fc específico de IgG humana marcado con peroxidasa (anticuerpo frente a IgG humana (Fc) purificado por afinidad marcado con peroxidasa (KPL)) y el sustrato ABTS peroxidasa (KPL). Se usaron los anticuerpos producidos en células animales (NS0) como muestras patrón.

Tal como se muestra en la figura 8A, la cepa T2K03 de S. cerevisiae en la que se sólo se había introducido el gen de RRBP1 no era sustancialmente diferente de una cepa control, es decir, la cepa T2K01 de S. cerevisiae, en lo que se refiere a la productividad. Sin embargo, en el caso de la cepa T2K02 de S. cerevisiae en la que sólo se había introducido el gen HAC1 activado, la productividad fue aproximadamente el doble de la de la cepa control, es decir, la cepa T2K01 de S. cerevisiae. Además, la productividad de anticuerpos en la cepa T2K04 de S. cerevisiae en la que se coexpresaba el gen HAC1 activado y el gen de RRBP1 fue significativamente mayor que la de la cepa control, es decir, la cepa T2K01 de S. cerevisiae, y una cepa en la que se había introducido únicamente el gen HAC1 activado o el gen de RRBP1 (es decir, aproximadamente siete veces mayor que el control). Esto indica que la coexpresión del gen HAC1 activado y el gen de RRBP1 produciría efectos equivalentes a o mayores que los efectos sinérgicos sobre la productividad de anticuerpos.

[Ejemplo 16] Productividad de anticuerpos en condiciones en las que se inhibe la formación de la cadena de O- azúcar usando la cepa de levadura transformada (S. cerevisiae) Se cultivaron las cepas T2K01 de S. cerevisiae, T2K02 de S. cerevisiae, T2K03 de S. cerevisiae y T2K04 de S. cerevisiae preparadas en el ejemplo 14 usando medio ST a 30ºC durante 3 días. Se inoculó la disolución de cultivo hasta una concentración final del 5% en medio YPAD al que se había añadido inicialmente 10 M de inhibidor de PMT (el derivado de ácido rodanin-3-acético: ácido 5-[[3,4-(1-fenilmetoxi)fenil]metilen]-4-oxo-2-tioxo-3- tiazolidinacético (compuesto (1c) descrito en Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 14, pág. 3975, 2004), y se realizó el cultivo a 30ºC durante 3 días. Se preparó un sobrenadante de cultivo a partir de la disolución de cultivo, y se designó el sobrenadante resultante como una muestra que contenía anticuerpos secretados y producidos por levadura. De la misma manera que en el ejemplo 15, se sometió la muestra a ensayo cuantitativo por medio de ELISA de tipo sándwich usando anticuerpos producidos en células animales (NS0) como muestras patrón.

Tal como se muestra en la figura 8B, la productividad de anticuerpos de la cepa T2K02 de S. cerevisiae en la que se había introducido el gen HAC1 activado y la de la cepa T2K03 de S. cerevisiae en la que se había introducido el gen de RRBP1 fueron aparentemente mayores que en la cepa control, es decir, la cepa T2K01 de S. cerevisiae. Además, la cantidad de anticuerpos producidos por la cepa T2K04 de S. cerevisiae en la que se coexpresaban el gen HAC activado y el gen de RRBP1 fue significativamente mayor que en la cepa control, es decir, la cepa T2K01 de S. cerevisiae, y una cepa en la que se había introducido únicamente el gen HAC1 activado o el gen de RRBP1 (es decir, aproximadamente ocho veces mayor que el control). Los efectos sinérgicos de la coexpresión del gen HAC1 activado y el gen de RRBP1 sobre la producción de anticuerpos se potenciaron adicionalmente mediante la de la formación de la cadena de O-azúcar.

[Ejemplo 17] Preparación de la cepa deficiente en el gen YPS1 de proteasa de Ogataea minuta (och1yps1ura3ade1) Se escindió el vector deficiente en el gen YPS1, pDOMYP1, divulgado en el documento WO 2003/091431 con BamHI y ClaI y se transformó en la cepa TK5-3 de O. minuta (och1Aura3ade1) divulgada en el documento WO 2003/091431 por medio de un método de impulsos eléctricos. Con el fin de confirmar que se perturbaban los genes YPS1 de tales genes, se sintetizaron los siguientes cebadores.

DY5; 5’-CTCAAGGGCCTGGAGACTACG-3’ (SEQ ID NO: 49) DY3; 5’-CGGGATTCCCGAGTCGCTCACC-3’ (SEQ ID NO: 50) Se usó ADN cromosómico aislado de la cepa transformada como molde para llevar a cabo una PCR usando los cebadores DY5 y DY3 a 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, y se repitió este ciclo 25 veces. Se detectó un fragmento de ADN de 3,7 kb amplificado de una cepa en la que se había introducido el plásmido en su locus de YPS1. Se designó la cepa seleccionada como la cepa YK4 de O. minuta (och1Aura3Aade1yps1::URA3). Una vez cultivada la cepa YK4 de O. minuta en medio YPD hasta una fase estacionaria, se obtuvieron cepas que mostraban resistencia a ácido 5-fluoroorótico (5-FOA). Se usó ADN cromosómico de la cepa resistente a 5-FOA como molde para llevar a cabo una PCR usando los cebadores DY5 y DY3 a 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 3 minutos, y se repitió este ciclo 25 veces. Se detectó un fragmento de ADN de 1,2 kb amplificado a partir de una cepa que carecía de URA3. Esta cepa och1ura3ade1yps1 se designó como cepa YK5 de O. minuta.

[Ejemplo 18] Preparación de cepa productora de gen de anticuerpo sintético (O. minuta) y producción de anticuerpos (1) Construcción de vector de expresión de gen de anticuerpo sintético Se escindió pOMexGP1U divulgado en el documento WO 2003/091431 con SpeI, se le proporcionaron extremos romos, y entonces se ligó. Se sometieron el sitio SalI y el sitio EcoT22I del plásmido resultante a cambio de ligador con el sitio SpeI y el sitio BamHI, respectivamente. Se designó el plásmido resultante como pOMexGP1USp.

Se diseño un gen a partir de la secuencia de aminoácidos del gen de anticuerpo anti-receptor de TRAIL (documento WO2002/094880) mientras se tenía en cuenta la frecuencia del uso de codones de O. minuta, y se sintetizó artificialmente un gen de anticuerpo a partir del mismo (Takara Bio). Se añadió la señal de lisozima de pollo o señal de SUC2 de S. cerevisiae al extremo N-terminal de los genes de la cadena ligera y la cadena pesada, y se añadieron secuencias de nucleótidos de los sitios de enzima de restricción (el sitio XbaI en el lado 5’ y el sitio BamHI en el lado 3’) a ambos extremos terminales (secuencias de nucleótidos: SEQ ID NO: 51, 53, 55 y 57; secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 52, 54, 56 y 58). Se introdujeron dos tipos de fragmentos de genes de cadena ligera que tenían diferentes señales que se habían digerido con XbaI y BamHI en el vector pOMexGP1A preparado en el ejemplo 1 (2). Se designaron los vectores resultantes como pOMexGPA/AbSUC y pOMexGPA/AbLys. Se introdujeron dos tipos de fragmentos de genes de cadena pesada que emitían diferentes señales que se habían digerido con XbaI y BamH en el sitio SpeI-BamHI del vector pOMexGP1USp. Se designaron los vectores resultantes como pOMexGPUSp/ AbSUC y pOMexGPUSp/AbLys.

Se usó pOMexPGHy (ejemplo 1 (3-4)) como molde para llevar a cabo una PCR usando el cebador de ADN PGKHy- F (SEQ ID NO: 59) y el cebador de ADN PGKHy-R (SEQ ID NO: 60) a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto, y se repitió este ciclo 20 veces. Por tanto, se amplificó el gen resistente a higromicina B.

PGKHy-F: 5’-ATAGAACTAGCAACTAGATGAAAAAGCCTGAACTCAC-3’ (SEQ ID NO: 59) PGKHy-R: 5’-CAAATCCCACGGATCACTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3’ (SEQ ID NO: 60) Se introdujo el fragmento de gen amplificado en pOMexPGHy digerido con SpeI-BglII usando el kit In-Fusion (BD Bioscience), y se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento de inserción. Se usó el plásmido resultante como molde para llevar a cabo una PCR usando el cebador de ADN PGKpUC-p (SEQ ID NO: 61) y el cebador de ADN PGKpUC-t (SEQ ID NO: 62) a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos, y se repitió este ciclo 20 veces. Por tanto, se amplificó un fragmento de gen que contenía el promotor de PGK-gen resistente a higromicina B-terminador de PGK.

PGKpUC-p: 5’-AATTCGAGCTCGGTACAGGGATACATGGGATACCAAAG-3’ (SEQ ID NO: 61) PGKpUC-t: 5’-GAGGATCCCCGGGTACCAGGGTCGATTTTCTTGGTCGA-3’ (SEQ ID NO: 62) Se introdujo el fragmento de gen amplificado en pUC118 digerido con Asp718I (Takara Bio) usando el kit In-Fusion (BD Bioscience), y se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento de inserción. Se designó el plásmido resultante como PGKHyg/pUC118. Se digirió pOMexGP1USp con HindIII y KpnI, se aisló un casete que comprendía el promotor-terminador de GAP, y se insertó el casete aislado en PGKHyg/pUC118 digerido con HindIII- KpnI. Se designó el plásmido resultante como GAP/HyG/pUC118. Posteriormente, se digirió pUC19 (Takara Bio) con NdeI y EcoRI, se le proporcionaron extremos romos y entonces se ligó para eliminar una región NdeI-EcoRI dentro de pUC19. Se digirió este plásmido con HindIII-SacI, y se introdujo un fragmento de gen que comprendía el promotor-terminador de GAP aislado de GAP/HyG/pUC118 por medio de digestión con HindIII-SacI y el promotor de PGK-gen resistente a higromicina B-terminador de PGK. Se designó el plásmido resultante como pOMexHy.

Se introdujo el fragmento de gen de cadena pesada de anticuerpo al que se había añadido la señal de lisozima de pollo digerida con XbaI-BamH en pOMexHy tratado con SpeI-BamHI, y se designó el vector resultante como pOMex- Hy/AbLys.

(2) Preparación de cepa de levadura que expresa gen de anticuerpo Se usaron los vectores de expresión de anticuerpos digeridos con NotI, es decir, pOMexGPA/AbLys y pOMexGPUASp/AbLys, para transformar la cepa YK5 de O. minuta (och1yps1ura3ade1) por medio de electroporación. Se emplearon las condiciones para electroporación descritas en el documento WO 2003/091431. Se seleccionaron las células transformadas en medio de placa de agar SD (glucosa al 2%, base de nitrógeno de levadura al 0,67% (Difco)). Se cultivó una sola colonia en medio B2YP4G (base de nitrógeno de levadura al 1,34% (Difco), extracto de levadura al 2% (Difco), polipeptona al 4% (Difco), glicerol al 4% y tampón fosfato 0,1 M (pH 6,0)) a 27ºC durante 4 días. Se preparó un sobrenadante de cultivo a partir de la disolución de cultivo, se llevó a cabo análisis de tipo Western de la manera descrita en el ejemplo 7 para seleccionar una cepa productora de anticuerpos en la que se habían introducido genes de la cadena ligera y la cadena pesada de anticuerpo, y se designó la cepa resultante como la cepa AA1 de O. minuta. Tal como se muestra en la figura 9, la cantidad de anticuerpos secretados por la cepa AA1 de O. minuta fue significativamente mayor que la secretada por la cepa AO1 de O.

minuta AO1 preparada en el ejemplo 5.

Se introdujeron los vectores de expresión de anticuerpos digeridos con NotI, es decir, pOMexGPA/AbSUC y pOMexGPUSp/AbSUC, en la cepa TK5-3 de O. minuta (och1ura3ade1) descrita en el documento WO 2003/091431 para obtener una cepa YY1 de O. minuta que expresa anticuerpos. Se emplearon métodos de electroporación y selección de cepas descritos anteriormente.

[Ejemplo 19] Adquisición de gen HAC1 activado de P. pastoris y construcción de vector de expresión Se obtuvo el gen HAC1 activado de P. pastoris a partir de las células (cepa GS115 de P. pastoris) de la misma manera que en el ejemplo 3. Se sintetizó el ADNc a partir de la cepa GS115 de P. pastoris de la misma manera que en el ejemplo 3. Se amplificó este ADNc por medio de PCR usando el cebador de ADN HACp1-1 (SEQ ID NO: 63) y el cebador HACp1-12 (SEQ ID NO: 64) mostrado a continuación a 94ºC durante 30 segundos, 52ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto, y se repitió este ciclo 30 veces. Se clonó el producto amplificado en pCR2.1- TOPO (Invitrogen), y se confirmaron las secuencias de nucleótidos derivadas de los dos tipos de fragmentos de genes amplificados por PCR (SEQ ID NO: 65 y 66).

HACp1-1: 5’-ATGCCCGTAGATTCTTCTCATAAGACAGC-3’ (SEQ ID NO: 63) HACp1-12: 5’-CAAAGTCATTTAAATCAAATGCATTAGCGG-3’ (SEQ ID NO: 64) Una de las secuencias de nucleótidos (SEQ ID NO: 65) de los dos tipos de fragmento de ADNc obtenidos estaba de acuerdo con la secuencia genómica; sin embargo, la otra secuencia (SEQ ID NO: 66) era parcialmente deficiente y estaba acortada. Esto indica que tal secuencia deficiente era un fragmento de ADNc que se había sometido a corte y empalme mediante Ire1p activado por UPR. Con el fin de obtener ADNc de longitud completa de HAC1 activado, se llevó a cabo una PCR a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto usando el cebador de ADN speHACp1F (SEQ ID NO: 67) y el cebador de ADN bglHACp1R (SEQ ID NO: 68) mostrados a continuación y un conjunto de ADNc que se consideró que contenía el ADNc activado de HAC1 descrito anteriormente, y se repitió este ciclo 20 veces.

speHACp1F: 5’-gactagtATGCCCGTAGATTCTTCTCATA-3’ (SEQ ID NO: 67) bglHACp1R: 5’-cagatctCTATTCCTGGAAGAATACAAAGT-3’ (SEQ ID NO: 68) El fragmento resultante de aproximadamente 1 kb contenía una región entre el codón de iniciación y el codón de terminación del gen HAC1 activado de P. pastoris (SEQ ID NO: 69), que es equivalente a la secuencia de aminoácidos de Hac1p activado que comprende 304 residuos de aminoácido (SEQ ID NO: 70). Se trató el fragmento resultante con SpeI y BglII, se aisló, y entonces se introdujo en el pOMexPGHy tratado con SpeI-BglII (ejemplo 1 (3- 4)). Se designó el vector resultante como pOMexPGHy/PpHac1. Este vector comprende la unidad de expresión del gen HAC1 activado derivado de P. pastoris.

[Ejemplo 20] Construcción de vector de expresión del gen HAC1 activado de S. cerevisiae

Se usó TOPO-aHac1 que contenía el gen HAC1 activado de S. cerevisiae preparado en el ejemplo 11 como molde para llevar a cabo una PCR usando el cebador de ADN ScHAC-XbaF (SEQ ID NO: 71) y el cebador de ADN ScHAC-BamR (SEQ ID NO: 72) a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto, y se repitió este ciclo 20 veces. Por tanto, se amplificó el gen HAC1 activado de S. cerevisiae.

ScHAC-XbaF: 5’-gtctagaATGGAAATGACTGATTTTGAACT-3’ (SEQ ID NO: 71) ScHAC-BamR: 5’-cggatccTCATGAAGTGATGAAGAAATCAT-3’ (SEQ ID NO: 72) Se digirió el fragmento resultante con XbaI y BamHI, y se recuperó un gen que codifica para HAC1 activado derivado de S. cerevisiae. Tras el aislamiento, se introdujo el gen en el pOMexPGHy tratado con SpeI-BglII (ejemplo 1 (3-4)). Se designó el vector resultante como pOMexPGHy/ScHac1. Este vector comprende la unidad de expresión del gen HAC1 activado derivado de S. cerevisiae.

[Ejemplo 21] Producción de anticuerpos por la cepa de O. minuta en la que se han introducido los genes HAC1 activados de O. minuta, P. pastoris y S. cerevisiae

(1) Preparación de la cepa de O. minuta en la que se han introducido los genes HAC1 activados de O. minuta, P.

pastoris y S. cerevisiae

Se introdujeron el vector de expresión del gen HAC1 activado derivado de O. minuta digerido con Aor51HI; es decir, pOMexPGHy/Hac1, el vector de expresión del gen HAC1 activado derivado de P. pastoris; es decir, pOMexPGHy/PpHac1, y el vector de expresión del gen HAC1 activado derivado de S. cerevisiae; es decir, pOMexPGHy/ScHac1, en la cepa AA1 de O. minuta productora de anticuerpos hecha crecer en el ejemplo 18 por medio de electroporación. Se confirmó la introducción del gen HAC1 activado en la cepa transformada seleccionando cepas en medio de placa de agar YPD al que se había añadido higromicina B hasta una concentración de 50 g/ml, cultivando las mismas, y extrayendo luego el genoma. Se sometió la cepa en la que se había introducido el vector de expresión del gen HAC1 activado derivado de O. minuta, pOMexPGHy/Hac1, a PCR usando el cebador de ADN speHAC1F (SEQ ID NO: 20) y el cebador bglHAC1R (SEQ ID NO: 21) descritos en el ejemplo 3. Se sometió la cepa en la que se había introducido el gen HAC1 activado derivado de P. pastoris a PCR usando el cebador de ADN speHACp1F (SEQ ID NO: 67) y el cebador bglHACp1R (SEQ ID NO: 68) a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto, y se repitió este ciclo 30 veces. Se sometió la cepa en la que se había introducido el gen HAC1 activado derivado de S. cerevisiae a PCR en las mismas condiciones, excepto por el uso del cebador de ADN ScHAC-XbaF (SEQ ID NO: 71) y el cebador ScHAC-BamR (SEQ ID NO: 72). Se designaron las cepas resultantes como la cepa AA2omH de O. minuta, la cepa AA2ppH de O. minuta y la cepa AA2scH de O. minuta. Simultáneamente, se introdujo pOMexPGHy digerido con Aor51HI en la cepa AA1 de O. minuta para obtener la cepa AA2Hy de O. minuta como control.

(2) Confirmación de la secreción de anticuerpos por cepa productora de anticuerpos en la que se había introducido el gen HAC1 Se cultivaron las cepa productoras de anticuerpos en las que se habían introducido los genes HAC1 preparados en (1) anteriormente; es decir, la cepa AA2omH de O. minuta, la cepa AA2ppH de O. minuta, la cepa AA2scH de O.

minuta y la cepa AA2Hy de O. minuta, de la misma manera descrita en el ejemplo 18 (2), y se llevó a cabo análisis de tipo Western en condiciones no reductoras. Los resultados son tal como se muestra en la figura 10. Es decir, se observó de manera más significativa la adición de una cadena de azúcar a la molécula de anticuerpo pero no se observaron los efectos de aceleración notable de la secreción de agregados de anticuerpo-H2L2 en la cepa AA2omH de O. minuta, la cepa AA2ppH de O. minuta y la cepa AA2scH de O. minutas, en comparación con la cepa AA2Hy de O. minuta control preparada en (1) anteriormente. Por tanto, podían esperarse efectos de producción similares por medio de la introducción del gen HAC1 derivado de una especie deferente de un huésped.

(3) Productividad de anticuerpos secretores por la cepa de O. minuta productora de anticuerpos en la que se había introducido el gen HAC1 (cuantificación por medio de análisis homogéneo basado en TR-FRET) Se aplicó tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7,2) que comprende 12 l de anticuerpo anti-IgG humana marcado con LANCE Eu-W1024 0,97 g/ml (PerkinElmer), 8,3 ug/ml de anticuerpo de ratón anti-IgG humana conjugado con biotina (BD Bioscience), estreptavidina Surelight APC 16,7 ug/ml (PerkinElmer) y el 10% de Block Ace (Dainippon Pharmaceutical) a una placa de semiárea de 96 pocillos (Corning), y se introdujeron en la misma 2 l de una disolución de muestra preparada diluyendo adecuadamente la disolución de cultivo preparada en (2) anteriormente con tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7,2) que contenía el 10% de Block Ace, seguido por agitación. Se sometió la disolución de muestra a la reacción a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 hora, y entonces se sometió a ensayo la fluorescencia usando EnVision (PerkinElmer). Se determinó la cantidad de anticuerpos agregados producidos basándose en el valor a 665 nm/615 nm. Se usaron los anticuerpos producidos en células animales (CHO) como muestras patrón. Tal como se muestra en la figura 11, no se observó aceleración significativa de secreción de anticuerpos en la cepa AA2omH de O. minuta, la cepa AA2ppH de O. minuta y la cepa AA2scH de O. minuta en las que se habían introducido los genes HAC1 activados, en comparación con la cepa AA2Hy de O. minuta. Sin embargo, podían esperarse efectos similares de producción incluso por medio de introducción del gen HAC1 derivado de una especie diferente de un huésped.

(4) Producción de anticuerpos por la cepa de O. minuta en la que se había introducido el gen HAC1 usando inhibidor de PMT (1c) Se inoculó un asa de siembra de platino de la cepa AA2omH de O. minuta, la cepa AA2ppH de O. minuta, la cepa AA2scH de O. minuta y la cepa AA2Hy de O. minuta en 5 ml de medio B2YP4G, se cultivó a 27ºC durante 1 día, y entonces se diluyó con medio B2YP4G para ajustar la DO600 a 10. Se añadió al mismo el inhibidor de PMT descrito en el ejemplo 9 (1c: concentración de disolución madre: 10 mM) hasta una concentración de 2 M en el mismo. Se realizó el cultivo a 27ºC durante 3 días adicionales, se sometió a ensayo la DO600 cada 24 horas, y se añadieron 0,04 M de cada inhibidor de PMT (1c) cuando el valor de DO600 aumentaba en 1. Se preparó un sobrenadante de cultivo a partir de la disolución de cultivo, y se midió la cantidad de producción de anticuerpos mediante el método descrito en el ejemplo 21 (3). Los resultados se muestran en la figura 11. Se encontró que la cepa AA2omH de O. minuta, la cepa AA2ppH de O. minuta y la cepa AA2scH de O. minuta en las que se había introducido el gen HAC1 activado pueden presentar efectos más significativos de acelerar la secreción de anticuerpos cultivándolas con la adición del inhibidor de PMT, en comparación con la cepa AA2Hy de O. minuta control.

Por tanto, se encontró que se lograban efectos de aceleración de la secreción de anticuerpos con el uso de genes HAC1 de diferentes especies.

[Ejemplo 22] Aislamiento de gen de PMT derivado de O. minuta

Se obtuvo el gen de PMT1 derivado de O. minuta por medio de PCR usando ADN cromosómico de la cepa IFO10746 de O. minuta como molde y el cebador de ADN PM1-5 (SEQ ID NO: 73) y el cebador de ADN PM1-3 (SEQ ID NO: 74) a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, y se repitió este ciclo 25 veces.

PM1-5: 5’-ATGGCGGGCAAA.AATCAGAAATCTAGCGCG-3’ (SEQ ID NO: 73) PM1-3: 5’-TTACAACTCGTCTTTGACTAGAGGCGGGGA-3’ (SEQ ID NO: 74) Se recuperó el fragmento de ADN amplificado de aproximadamente 2,4 kb y se clonó usando el kit de clonación TOPO TA. Se aisló el ADN de plásmido del clon resultante, y se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento de inserción (SEQ ID NO: 75) Por tanto, se seleccionó un clon que tenía una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 76), que es altamente homóloga a la secuencia de aminoácidos del gen de PMT1 derivado de S. cerevisiae del fragmento de ADN de inserción del plásmido. Se designó el plásmido aislado como pOmPM1.

Se obtuvo el gen de PMT2 derivado de O. minuta usando el cebador de ADN PM2-5 (SEQ ID NO: 77) y el cebador de ADN PM2-3 (SEQ ID NO: 78), se obtuvo el gen de PMT4 usando el cebador de ADN PM4-5 (SEQ ID NO: 79) y el cebador de ADN PM4-3 (SEQ ID NO: 80), se obtuvo el gen de PMT5 usando el cebador de ADN PM5-5 (SEQ ID NO: 81) y el cebador de ADN PM5-3 (SEQ ID NO: 82) y se obtuvo el gen de PMT6 usando el cebador de ADN PM6- 5 (SEQ ID NO: 83) y el cebador de ADN PM6-3 (SEQ ID NO: 84), de la misma manera que en el caso del gen de PMT1. Se designaron los plásmidos que comprendían el gen de PMT2 (secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO: 85; secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 86), el gen de PMT4 (secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO: 87; secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 88), el gen de PMT5 (secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO: 89; secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 90) y el gen de PMT6 (secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO: 91; secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 92) como pOmPM2, pOmPM4, pOmPM5 y pOmPM6, respectivamente.

PM2-5: 5’-ATGGGCGAACGTACGGGCAAAAGTGCGCTC-3’ (SEQ ID NO: 77) PM2-3: 5’-CTAATCGGAAATTCTCCACGTGCTCAAGAG-3’ (SEQ ID NO: 78) PM4-5: 5’-ATGGGGCCCAAAATAAAGACCGGCAAGAAA-3’ (SEQ ID NO: 79) PM4-3: 5’-CTATTTAGCAAAATGCAGTTTGATGTTGAG-3’ (SEQ ID NO: 80) PM5-5: 5’-ATGGACGAGAAAAACATCTCTGGCTTAGAA-3’ (SEQ ID NO: 81) PM5-3: 5’-CTACTCACTATAGACGGAGCAGTCGATCGA-3’ (SEQ ID NO: 82) PM6-5: 5’-ATGTCCGAGTCAGAGCTGAGAAACCGCAAA-3’ (SEQ ID NO: 83) PM6-3: 5’-CTAAGCTATACGCCAGGTGGAAACCCAGTT-3’ (SEQ ID NO: 84) [Ejemplo 23] Preparación del vector de perturbación o inactivación mediante inserción el gen de PMT para O. minuta

(1) Preparación del vector de inactivación mediante inserción del gen de PMT (1-1) Preparación del gen de inactivación mediante inserción del gen de PMT1 Con el fin de aislar una secuencia parcial del gen de PMT1 con el uso de pOmPM1 obtenido en el ejemplo 22, se usaron el siguiente cebador de ADN PMT1hIII (SEQ ID NO: 93) y el cebador de ADN PMTIKp (SEQ ID NO: 94) para llevar a cabo una PCR a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos, y se repitió este ciclo 15 veces.

PMT1hIII: 5’-caagcttGGACCTACAACACGTCCGAAGAA-3’ (SEQ ID NO: 93) PMT1Kp: 5’-cggtaccGGTTTGATACCTTGGGTGGCACA-3’ (SEQ ID NO: 94) Se digirió el fragmento de ADN amplificado de aproximadamente 1,6 kb con HindIII y KpnI y se recuperó. Posteriormente, se digirió pPICZ (Invitrogen) con BglII y se le proporcionaron extremos romos. Se insertó en el mismo el ligador HindIII, se digirió adicionalmente con BamHI, y se le proporcionaron extremos romos, seguido por inserción del ligador KpnI. Se designó el plásmido resultante como pZ-Hd-Kp. Se digirió pZ-Hd-Kp con HindIII y KpnI, se aisló un fragmento de ADN de 2,0 kb que contenía un gen resistente a zeocina, y se insertó en el mismo la secuencia parcial del gen de PMT1 amplificada por PCR. Se determinó la secuencia de nucleótidos de la secuencia parcial del gen de PMT1 insertado, y entonces se designó el plásmido resultante como pOmPM1dZ. pOmPM1dZ es capaz de inactivar mediante inserción la región estructural del gen (CDS) y la región de promotor del gen de PMT1 de O. minuta e inhibir la transcripción del gen de PMT1. Por separado, se digirió pOMexGPUSp preparado en el ejemplo 18 con HindIII y KpnI, se recuperó un fragmento de gen que contenía el promotor y el terminador de GAP, y se insertó el fragmento recuperado en el fragmento de ADN de 2,0 kb digerido con HindIII-KpnI que contenía el gen resistente a zeocina. Se designó el plásmido resultante como GAP/Z.

(1-2) Preparación del vector de inactivación mediante inserción del gen de PMT2 Con el fin de aislar una secuencia parcial del gen de PMT2 con el uso de pOmPM2 obtenido en el ejemplo 22, se usaron el siguiente cebador de ADN PMT2hIII (SEQ ID NO: 95) y el cebador de ADN PMT2Kp (SEQ ID NO: 96) para llevar a cabo una PCR a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos, y se repitió este ciclo 15 veces.

PMT2hIII: 5’-gaagcttACTACATAATTCGTGTACGTGTTC-3’ (SEQ ID NO: 95) PMT2Kp: 5’-cggtaccGTCGCCGTATTGGTCAGCAATCTC-3’ (SEQ ID NO: 96) Se recuperó el fragmento de ADN amplificado de aproximadamente 1,5 kb y se digirió con HindIII y KpnI, y entonces se recuperó el fragmento digerido. Se insertó el fragmento de ADN obtenido en un fragmento de ADN de 2,0 kb que contenía un gen resistente a zeocina, que se había aislado de pZ-Hd-Kp por medio de digestión con HindIII y KpnI, y se determinó la secuencia de nucleótidos de la secuencia parcial del gen de PMT2 insertado. Se designó el plásmido resultante como pOmPM2dZ. pOmPM2dZ es capaz de inactivar mediante inserción la región estructural del gen (CDS) y la región de promotor del gen de PMT2 de O. minuta PMT2 e inhibir la transcripción del gen de PMT2.

(1-3) Preparación del vector de inactivación mediante inserción del gen de PMT4 Con el fin de aislar una secuencia parcial del gen de PMT4 con el uso de pOmPM4 obtenido en el ejemplo 22, se usaron el siguiente cebador de ADN PMT4FHdinf (SEQ ID NO: 97) y el cebador de ADN PMT4RKpinf (SEQ ID NO: 98) para llevar a cabo una PCR a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos, y se repitió este ciclo 15 veces.

PMT4FHdinf: 5’-GTCATGAGATCCaagctGATCCCTCAATGGAGATCTACT-3’ (SEQ ID NO: 97) PMT4RKpinf: 5’-GGTGTGTGGGGGATCgGGATGCAAATGGATGGCTCGAAC-3’ (SEQ ID NO: 98) Se insertó el fragmento de ADN obtenido de aproximadamente 1,5 kb en un fragmento de ADN de 2,0 kb que contenía un gen resistente a zeocina, que se había aislado de pZ-Hd-Kp por medio de digestión con HindIII y KpnI usando el kit In-Fusion (BD Bioscience). Se determinó la secuencia de nucleótidos de la secuencia parcial del gen de PMT4 insertado, y entonces se designó el plásmido resultante como pOmPM4dZ.

(2) Preparación del vector de perturbación del gen de PMT (2-1) Preparación del vector de perturbación del gen de PMT5 Se digirió pROMU1 que contenía un fragmento de gen que tenía secuencias de repetición de aproximadamente 0,8 kb en el sentido de 5’ y en el sentido de 3’ del gen estructural URA3 de O. minuta divulgado en el documento WO 2003/091431 con HindIII, y se le proporcionaron extremos romos, seguido por inserción del ligador BamHI. Se digirió el vector resultante con BamHI y BglII, y se introdujo un fragmento de aproximadamente 3,3 kb que contenía secuencias de repetición y el gen URA3 de O. minuta en el pBluescript KS-(Stratagene) digerido con BamHI. Se designó el vector resultante como rURApBKS.

Se usó ADN cromosómico de la cepa IFO10746 de O. minuta como molde, se usaron el cebador de ADN PMT5maeF2 (SEQ ID NO: 99) y el cebador de ADN PMT5maeR (SEQ ID NO: 100) para llevar a cabo una PCR a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, y se repitió este ciclo 25 veces. Se recuperó el fragmento de ADN amplificado de aproximadamente 1,5 kb y se introdujo en el rURApBKS digerido con BamHI-HindIII usando el kit In-Fusion (BD Bioscience). Se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento de gen insertado. Se designó el vector resultante como PMT5K/O/rURA3pre.

Se usó ADN cromosómico de la cepa IFO10746 de O. minuta como molde, se usaron el cebador de ADN PMT5ushiroF (SEQ ID NO: 101) y el cebador de ADN PMT5ushiroR (SEQ ID NO: 102) para llevar a cabo una PCR a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, y se repitió este ciclo 25 veces. Se recuperó el fragmento de ADN amplificado de aproximadamente 1,5 kb y se introdujo en el PMT5K/O/rURA3pre digerido con NotI usando el kit In-Fusion (BD Bioscience). Se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento de gen insertado. Se designó el vector resultante como PMT5K/O/rURA3.

PMT5maeF2: 5’-GACGGTATCGATAAGCTTGATGCGCGGCCTTCCGACCTT-3’ (SEQ ID NO: 99) PMT5maeR: 5’-CTGGGGAAGCTCGGATCCGGCTCGAGGTCTTCGTTCAGA-3’ (SEQ ID NO: 100) PMT5ushiroF: 5’-CTAGTTCTAGAGCGGCCCAGGTCGCTTTCAGGCAGCAG-3’ (SEQ ID NO: 101) PMT5ushiroR: 5’-CACCGCGGTGGCGGCCAAGCTTGGGTACCGGCTCGCGTAG-3’ (SEQ ID NO: 102) (2-2) Preparación del vector de perturbación del gen de PMT6 Se usó ADN cromosómico de la cepa IFO10746 de O. minuta como molde, se usaron el cebador de ADN PMT6inf5’armF (SEQ ID NO: 103) y el cebador de ADN PMT6inf5’armR (SEQ ID NO: 104) para llevar a cabo una PCR a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 2 minutos, y se repitió este ciclo 25 veces. Se recuperó el fragmento de ADN amplificado de aproximadamente 2,8 kb y se introdujo en el rURApBKS digerido con BamHI usando el kit In-Fusion (BD Bioscience). Se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento de gen insertado. Se designó el vector resultante como PMT6K/O/rURA3pre.

Se usó ADN cromosómico de la cepa IFO10746 de O. minuta como molde, se usaron el cebador de ADN PMT6inf3’armF (SEQ ID NO: 105) y el cebador de ADN PMT6inf3’armR2 (SEQ ID NO: 106) para llevar a cabo una PCR a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 2 minutos, y se repitió este ciclo 25 veces. Se recuperó el fragmento de ADN amplificado de aproximadamente 2,5 kb y se introdujo en el PMT6K/O/rURA3pre digerido con NotI-SacII usando el kit In-Fusion (BD Bioscience). Se determinó la secuencia de nucleótidos del fragmento de gen insertado. Se designó el vector resultante como PMT6K/O/rURA3.

PMT6inf5’armF: 5’-GCAGCCCGGGGgatccACGAAACCACGTCCTACT-3’ (SEQ ID NO: 103) PMT6inf5’armR: 5’-GGGGAAGCTcggatcGACTCATCTTGAAACGCA-3’ (SEQ ID NO: 104) PMT6inf3’armF: 5’-AGTTCTAGAGCGGCCTTACCACCATTACATGCC-3’ (SEQ ID NO: 105) PMT6inf3’armR2: 5’-AATTGGAGCTCCACCGCGGCCGCAACTTACTCGACGCTAA-3’ (SEQ ID NO: 106) [Ejemplo 24] Preparación de cepa de O. minuta productora de anticuerpos con un gen de PMT perturbado o inactivado mediante inserción y evaluación de la misma (1) Preparación de cepa de O. minuta productora de anticuerpos con un gen de PMT inactivado mediante inserción En cuanto a los vectores de inactivación mediante inserción del gen de PMT preparados en el ejemplo 23, se digirió el vector de inactivación mediante inserción del gen de PMT1 con PstI, se digirió el vector de inactivación mediante inserción del gen de PMT2 con XhoI y se digirió el vector de inactivación mediante inserción del gen de PMT4 con

HindIII. Se introdujeron estos productos de digestión en la cepa YY1 de O. minuta productora de anticuerpos hecha crecer en el ejemplo 18 por medio de electroporación. Se confirmó la interrupción de genes de PMT en las cepas transformadas de la siguiente manera. Se seleccionaron cepas en medio de placa de agar YPD a las que se había añadido zeocina hasta una concentración de 50 g/ml en el mismo y se cultivaron, seguido por extracción de los genomas. Se sometió el gen de PMT1 a PCR a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minutos, y se repitió este ciclo 30 veces, con el uso de un par de cebadores de DNA de Zeo1 (SEQ ID NO: 107) y PMT1zeo1 (SEQ ID NO: 109) y un par de cebadores de ADN de Zeo2 (SEQ ID NO: 108) y PMT1zeo2 (SEQ ID NO: 110). Se sometió el gen de PMT2 a PCR en las mismas condiciones, con el uso de un par de cebadores de ADN de Zeo1 (SEQ ID NO: 107) y PMT2zeo1 (SEQ ID NO: 111) y un par de cebadores de ADN de Zeo2 (SEQ ID NO: 108) y PMT2zeo2 (SEQ ID NO: 112). Se sometió el gen de PMT4 a PCR en las mismas condiciones, con el uso de un par de cebadores de ADN de Zeo1 (SEQ ID NO: 107) y PMT4PCR3’armF (SEQ ID NO: 113) y un par de cebadores de ADN de Zeo2 (SEQ ID NO: 108) y PMT4PCR5’armR3 (SEQ ID NO: 114). Por tanto, se confirmó la inactivación mediante inserción de los genes de PMT con la introducción de vectores de inactivación mediante inserción.

Zeo1: 5’-GAACGGCACTGGTCAACTTGGCCAT-3’ (SEQ ID NO: 107) Zeo2: 5’-CTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGA-3’ (SEQ ID NO: 108) PMT1zeo1: 5’-GAATTCTAGCCGAGCATGAGCTA-3’ (SEQ ID NO: 109) PMT1zeo2: 5’-CGTTCAGACTCTTGTTGATTTTCCAC-3’ (SEQ ID NO: 110) PMT2zeo1: 5’-GCTGTGCCACTGCACGCCTCGACTC-3’ (SEQ ID NO: 111) PMT2zeo2: 5’-CTTGTCCCTCTTGAATGGCGAGTG-3’ (SEQ ID NO: 112) PMT4PCR3’armF: 5’-GGAACACGCCAAACATCATG-3’ (SEQ ID NO: 113) PMT4PCR5’armR3: 5’-CACAAGCAGAATCAGGCAC-3’ (SEQ ID NO: 114) Se designaron las cepas resultantes como la cepa YY2P1 de O. minuta (una cepa con un gen de PMT1 inactivado mediante inserción), la cepa YY2P2 de O. minuta (una cepa con un gen de PMT2 inactivado mediante inserción) y la cepa YY2P4 de O. minuta (una cepa con un gen de PMT4 inactivado mediante inserción). Además, se introdujo GAP/Z digerido con Sse8387I en la cepa YY1 de O. minuta, y se seleccionó una cepa resistente a zeocina para obtener la cepa YY2Z de O. minuta como cepa control.

(2) Productividad de anticuerpos secretores por la cepa de O. minuta productora de anticuerpos con un gen de PMT inactivado mediante inserción Se cultivaron las cepas productoras de anticuerpos con genes de PMT inactivados mediante inserción preparados en (1) anteriormente de la manera descrita en el ejemplo 18 (2), y entonces se llevó a cabo análisis de tipo Western. Los resultados se muestran en la figura 12 y la figura 14. Es decir, la cantidad de secreción de agregados de anticuerpo disminuyó ligeramente con respecto a la lograda por la cepa YY2P1 de O. minuta con un gen de PMT1 inactivado mediante inserción, la cepa YY2P2 de O. minuta con un gen de PMT2 inactivado mediante inserción y la cepa YY2P4 de O. minuta con un gen de PMT4 inactivado mediante inserción, en comparación con la cepa YY2Z de

O. minuta preparada en (1) anteriormente (figura 12: carril 3 y carril 6; figura 14: carril 3).

(3) Productividad de anticuerpos secretores por la cepa de O. minuta productora de anticuerpos con un gen de PMT inactivado mediante inserción (cuantificación por medio de análisis homogéneo basado en TR-FRET) Se midió la cantidad de anticuerpos producida en la disolución de cultivo preparada en (2) anteriormente mediante el método descrito en el ejemplo 21 (3). Como muestra patrón, se usaron anticuerpos producidos en células animales (CHO). Tal como se muestra en la figura 13 y la figura 15, las cantidades de agregados de anticuerpo secretadas aumentaron ligeramente en la cepa YY2P1 de O. minuta con un gen de PMT1 inactivado mediante inserción, la cepa YY2P2 de O. minuta con un gen de PMT2 inactivado mediante inserción y la cepa YY2P4 de O. minuta con un gen de PMT4 inactivado mediante inserción, en comparación con la cepa YY2Z de O. minuta preparada en (1) anteriormente (figura 13: YY2P1 y YY2P2; figura 15: YY2P4).

(4) Preparación de cepas deficientes en PMT5 y PMT6 y evaluación de las mismas (4-1) Preparación de la cepa deficiente en el gen de PMT5 de O. minuta (och1yps1ura3ade1pmt5) Se digirió el vector de perturbación del gen de PMT5, PMT5K/O/rURA3, preparado en el ejemplo 23 (2-1) con HindIII y se transformó en la cepa YK5 de Ogataea minuta (och1ura3ade1yps1) preparada en el ejemplo 17 por medio del método de impulsos eléctricos. Con el fin de confirmar que se habían perturbado los genes de PMT5 de estas cepas, se sintetizaron los siguientes cebadores.

gPMT5-5: 5’-CGGTGACGACTTCGACTAGTCGAG-3’ (SEQ ID NO: 115) gPMT5-2: 5’-CGGTGCTGTTGGCGTCGTCATGGGTG-3’ (SEQ ID NO: 116) gPMT5-3: 5’-GGCGCGTTCCAATTCCACTCTGCTG-3’ (SEQ ID NO: 117) gPMT5-4: 5-CGACGAGTCCTCTCACCAGGAGGTTG-3’ (SEQ ID NO: 118) Se usó ADN cromosómico aislado de la cepa transformada como molde para llevar a cabo una PCR usando el cebador gPMT5-5 (SEQ ID NO: 115) y el cebador gPMT5-2 (SEQ ID NO: 116) a 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, y se repitió este ciclo 25 veces. Se detectó un fragmento de ADN amplificado de 4,9 kb de una cepa en la que se había incorporado un plásmido en su locus de PMT5. De manera similar, se usó ADN cromosómico aislado de la cepa transformada como molde para llevar a cabo una PCR usando el cebador gPMT5-3 (SEQ ID NO: 117) y el cebador gPMT5-4 (SEQ ID NO: 118) a 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, y se repitió este ciclo 25 veces. Se detectó un fragmento de ADN amplificado de 4,9 kb de una cepa en la que se había incorporado un plásmido en su locus de PMT5. Se designó la cepa seleccionada como la cepa YK6 de O. minuta (och1ura3ade1yps1pmt5::URA3).

(4-2) Preparación de la cepa deficiente en el gen de PMT6 de O. minuta (och1yps1ura3ade1pmt6) Se digirió el vector de perturbación del gen de PMT6, PMT6K/O/rURA3, preparado en el ejemplo 23 (2-2) con BamHI y NotI y entonces se transformó en la cepa YK5 de O. minuta (och1ura3ade1yps1) preparada en el ejemplo 17 por medio del método de impulsos eléctricos. Con el fin de confirmar que se habían perturbado los genes de PMT6 de estas cepas, se sintetizaron los siguientes cebadores.

PMT6 PCR3’armF: 5’-TGTGGGTGCGATCCTGAG-3’ (SEQ ID NO: 119) PMT6 PCR3’armR: 5’-GCCGTCGTTGGAGCAAAACT-3’ (SEQ ID NO: 120) PMT6 PCR5’armF: 5’-GCATGTGCCACTGCTAAA-3’ (SEQ ID NO: 121) PMT6 PCR5’armR: 5’-GACCAACTTTCCCGTGTAA-3’ (SEQ ID NO: 122) Se usó ADN cromosómico aislado de la cepa transformada como molde, se usaron el cebador PMT6 PCR3’armF (SEQ ID NO: 119) y el cebador PMT6 PCR3’armR (SEQ ID NO: 120) para llevar a cabo una PCR a 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, y se repitió este ciclo 25 veces. Se detectó un fragmento de ADN amplificado de 5,8 kb de una cepa en la que se había incorporado un plásmido en su locus de PMT6. De manera similar, se usó ADN cromosómico aislado de la cepa transformada como molde para llevar a cabo una PCR usando el cebador de PMT6 PCR5’armF (SEQ ID NO: 121) y el cebador de PMT6 PCR5’armR (SEQ ID NO: 122) a 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos, y se repitió este ciclo 25 veces. Se detectó un fragmento de ADN amplificado de 6,3 kb de una cepa en la que se había incorporado un plásmido en su locus de PMT6. Se designó la cepa seleccionada como la cepa YK7 de O. minuta (och1ura3ade1yps1pmt6::URA3).

(5) Preparación de cepa de O. minuta productora de anticuerpos en la que se habían perturbado los genes de PMT5 y PMT6 Se usaron el vector de expresión de anticuerpo digerido con NotI, pOMexGPA/AbLys, (preparado en el ejemplo 18 (1)) y el vector de expresión de anticuerpo digerido con Sse8387I, pOMexHy/AbLys, (preparado en el ejemplo 18 (1)) para transformar la cepa YK6 de O. minuta (och1yps1ura3ade1pmt5::rURA3) y la cepa YK7 de O. minuta (och1yps1ura3ade1pmt6::rURA3) por medio de electroporación. Se seleccionaron las células transformadas en medio de placa de agar SD (glucosa al 2%, base de nitrógeno de levadura al 0,67% (Difco)) al que se había añadido higromicina B a una concentración de 50 g/ml en el mismo. Se cultivó una única colonia en medio B2YP4G (base de nitrógeno de levadura al 1,34% (Difco), extracto de levadura al 2% (Difco), polipeptona al 4% (Difco), glicerol al 4%, tampón fosfato 0,1 M (pH 6,0)) a 27ºC durante 4 días. Se preparó un sobrenadante de cultivo a partir de la disolución de cultivo, se llevó a cabo análisis de tipo Western mediante el método descrito en el ejemplo 7, y se seleccionaron cepas productoras de anticuerpos en las que se habían introducido genes de la cadena ligera y la cadena pesada de anticuerpo. Se designaron las cepas resultantes como la cepa AP5 de O. minuta (la cepa deficiente en el gen de PMT5) y la cepa AP6 de O. minuta (la cepa deficiente en el gen de PMT6). Por separado, se introdujeron el vector de expresión de anticuerpo digerido con NotI, pOMexGPA/ AbLys, y el pOMexHy/AbLys digerido con Sse8387I en la cepa YK4 de O. minuta (och1ura3ade1yps1::rURA3) por medio de electroporación, y se prepararon cepas productoras de anticuerpos y se seleccionaron como cepas control de la misma manera descrita anteriormente. Se designaron las cepas obtenidas como cepas Acon de O. minuta.

(6) Productividad de anticuerpos secretores por una cepa de O. minuta productora de anticuerpos en la que se habían perturbado los genes de PMT5 y PMT6 Se cultivaron la cepa AP5 de O. minuta en la que se había perturbado el gen de PMT5 y la cepa AP6 de O. minuta y la cepa Acon de O. minuta en la que se había perturbado el gen de PMT6 de la misma manera descrita en el ejemplo 18 (2), y se llevó a cabo análisis de tipo Western no reductor. Se midió la cantidad de anticuerpos producida en la disolución de cultivo de la misma manera descrita en el ejemplo 21 (3). Como muestra patrón, se usaron anticuerpos producidos en células animales (CHO). Los resultados se muestran en la figura 16. Es decir, no hubo diferencia significativa en la productividad de agregados de anticuerpo entre la cepa AP5 de O. minuta o la cepa AP6 de O. minuta y la cepa Acon de O. minuta control.

[Ejemplo 25] Preparación de la cepa de O. minuta con un gen de PMT inactivado mediante inserción y con el gen HAC1 introducido en la misma y evaluación de la misma (1) Preparación de la cepa de O. minuta con un gen de PMT inactivado mediante inserción en la que se había introducido el gen HAC1 Se digirió el vector de expresión del gen HAC1 activado derivado de O. minuta, pOMexPGHy/Hac1, preparado en el ejemplo 3 con Aor51HI y se introdujo en la cepa YY2P2 de O. minuta (una cepa con un gen de PMT2 inactivado mediante inserción), la cepa YY2P4 de O. minuta (una cepa con un gen de PMT4 inactivado mediante inserción) y la cepa YY2Z de O. minuta (la cepa control), que se había preparado en el ejemplo 24 (1), por medio de electroporación. Con el fin de confirmar que se había introducido el gen HAC1 activado en la cepa transformada, se seleccionaron las cepas en medio de placa de agar YPD al que se había añadido higromicina B a una concentración de 50 g/ml en la misma, se cultivaron la cepas, se extrajeron los genomas, y se llevó a cabo una PCR, según el método del ejemplo 6. Se designaron las cepas obtenidas como la cepa YY3P2omH de O. minuta (la cepa con un gen de PMT2 inactivado mediante inserción y con el gen HAC1 introducido en la misma), la cepa YY3P4omH de O. minuta (la cepa con un gen de PMT4 inactivado mediante inserción y con el gen HAC1 introducido en la misma) y la cepa YY3ZomH de O. minuta (la cepa control en la que se había introducido el gen HAC1). Simultáneamente, se introdujo pOMexPGHy digerido con Aor51HI en la cepa YY2Z de O. minuta, y se obtuvo la cepa YY3ZHy de O. minuta (la cepa control en la que se había introducido un vector) como cepa control.

(2) Productividad de anticuerpos secretores por la cepa de O. minuta con un gen de PMT inactivado por inserción y con el gen HAC1 introducido en la misma Se cultivaron las cepas productoras de anticuerpos con un gen de PMT inactivado por inserción y con el gen HAC1 introducido en las mismas preparadas en (1) anteriormente mediante el método descrito en el ejemplo 18 (2), y se llevó a cabo análisis de tipo Western. Los resultados se muestran en la figura 12 y la figura 14. Se encontró que la cepa YY3P2omH de O. minuta con un gen de PMT2 inactivado mediante inserción y con el gen HAC1 introducido en la misma secretaba una cantidad significativamente mayor de anticuerpos que la cepa YY3ZomH de O. minuta en la que sólo se había introducido el gen HAC1 y la cepa YY2P2 de O. minuta con un gen de PMT2 inactivado mediante inserción (figura 12: carril 7). Se encontró que la cepa YY3P4omH de O. minuta con un gen de PMT4 inactivado mediante inserción y con el gen HAC1 introducido en la misma secretaba una cantidad significativamente mayor de anticuerpos que la cepa YY3ZomH de O. minuta en la que sólo se había introducido el gen HAC1 y la cepa YY2P4 de O. minuta con un gen de PMT4 inactivado mediante inserción (figura 14: carril 6).

Se midió la cantidad de anticuerpos producida en la disolución de cultivo mediante los métodos descritos en el ejemplo 8 y en el ejemplo 21 (3). Como muestra patrón, se usaron anticuerpos producidos en células animales (CHO). Los resultados se muestran en la figura 13 y en la figura 15. Se encontró que la cepa YY3P2omH de O. minuta con un gen de PMT2 inactivado mediante inserción y con el gen HAC1 introducido en la misma secretaba una cantidad significativamente mayor de agregados de anticuerpo que las cepas control, es decir, la cepa YY3ZomH de O. minuta (una cepa en la que sólo se había introducido el gen HAC1), la cepa YY2P2 de O. minuta (una cepa con un gen de PMT2 inactivado mediante inserción) y la cepa YY3ZHy de O. minuta (una cepa control en la que se había introducido un vector) (figura 13: cepa YY3P2omH de O. minuta). Además, se encontró que la cepa YY3P4omH de O. minuta con un gen de PMT4 inactivado mediante inserción y con el gen HAC1 introducido en la misma secretaba una cantidad significativamente mayor de anticuerpos que las cepas control, es decir, la cepa YY3ZomH de O. minuta (una cepa en la que sólo se había introducido el gen HAC1), la cepa YY2P4 de O. minuta (una cepa con un gen de PMT4 inactivado mediante inserción) y la cepa YY3ZHy de O. minuta (una cepa control en la que se había introducido un vector) (figura 15: la cepa YY3P4omH de O. minuta).

[Ejemplo 26] Producción de anticuerpos por cepa de O. minuta con un gen de PMT inactivado por inserción y con el gen HAC1 introducido en la misma usando el inhibidor de PMT (1c) Se inoculó un asa de siembra de platino de cepas productoras de anticuerpos con un gen de PMT inactivado por inserción y con el gen HAC1 introducido en las mismas preparadas en el ejemplo 25 (1) en 5 ml de medio B2YP4G, se cultivaron a 27ºC durante 1 día, y se diluyeron con medio B2YP4G para ajustar la DO600 a 10. Se añadió la disolución resultante a los inhibidores de PMT descritos en el ejemplo 9 (1c; concentraciones de disoluciones madre: 0,1 mM, 0,5 mM, 2,5 mM y 10 mM) hasta concentraciones de 0,016 M, 0,08 M, 0,4 M y 2,0 M, respectivamente. Se realizó el cultivo a 27ºC durante 3 días adicionales, se midió la DO600 cada 24 horas y se añadieron inhibidores de PMT (1c) en cantidades de 0,00032 M, 0,0016 M, 0,008 M y 0,04 M, respectivamente, cuando el valor de DO600 aumentaba en 1. Se preparó un sobrenadante de cultivo a partir de la disolución de cultivo, y se llevó a cabo análisis de tipo Western mediante el método descrito en el ejemplo 18 (2). Los resultados se muestran en la figura 17. Además, se cuantificó la productividad de anticuerpos secretores mediante el método descrito en el ejemplo 21 (3). Los resultados se muestran en la figura 18. Se logró la mayor productividad de anticuerpos en la cepa YY3P2omH de O. minuta (una cepa con un gen de PMT2 inactivado mediante inserción y con el gen HAC1 introducido en la misma) cuando se añadió inhibidor de PMT aproximadamente 0,008 M (concentración de disolución madre: 2,5 mM) cuando el valor de DO600 aumentaba en 1. Se logró la mayor productividad de anticuerpos en la cepa YY3P4omH de O. minuta (una cepa con un gen de PMT4 inactivado mediante inserción y con el gen HAC1 introducido en la misma) cuando se añadió inhibidor de PMT aproximadamente 0,04 M (concentración de disolución madre: 10 mM) cuando el valor de DO600 aumentaba en 1. Puede deducirse que la adición de cadena de azúcar se inhibe fuertemente mediante la inhibición de la expresión del gen de PMT y el uso de inhibidores de PMT en combinación. Con el fin de inhibir la adición de cadena de azúcar en relación con la cepa en la que se había introducido HAC1, puede esperarse una productividad superior de anticuerpos agregados mediante la inhibición de la actividad de la proteína PMT con la inhibición de la expresión del gen de PMT y el uso de inhibidores de PMT en combinación.

[Ejemplo 27] Evaluación del inhibidor de PMT (5a) Se inoculó un asa de siembra de platino de las cepas YY1 de O. minuta en la que se habían introducido genes de anticuerpo en 5 ml de medio B2YP4G, se cultivaron a 27ºC durante 1 día, y se diluyeron con medio B2YP4G para ajustar la DO600 a 10. Se añadió a las mismas un inhibidor de PMT (ácido {(5Z)-4-oxo-5-[3-(1-feniletoxi)-4-(2- feniletoxi)benciliden]-2-tioxo-1,3-tiazolidin-3-il}acético (compuesto-5a descrito en Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 14, pág. 3975, 2004) que es diferente del inhibidor de PMT (1c) descrito en el ejemplo 9 para dar como resultado una concentración de 1 m en ellas. Se realizó el cultivo a 27ºC durante 3 días adicionales, se midió la DO600 cada 24 horas y se añadió el inhibidor de PMT en cantidades de 0,02 M cuando el valor de DO600 aumentaba en 1. Se preparó un sobrenadante de cultivo a partir de la disolución de cultivo, se llevó a cabo análisis de tipo Western mediante el método descrito en el ejemplo 18 (2), y se cuantificó la productividad de anticuerpos secretores mediante el método descrito en el ejemplo 21 (3). Los resultados se muestran en la figura 19 y en la figura 20. Se consideró que la productividad de agregados de anticuerpo tendía a aumentar por medio de la adición del inhibidor de PMT (5a), que se había examinado nuevamente. Por tanto, se consideró que el inhibidor de PMT (5a) tenía efectos equivalentes a los del inhibidor de PMT (1c) descrito en el ejemplo 9.

Aplicabilidad industrial

La presente invención permite la producción secretora de alto nivel de anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos en levadura.

Lista de secuencias

<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Método para la producción secretora de alto nivel de proteínas <130> PH-3149-PCT <150> JP2006-136993 <151> 16-05-2006 <160> 122 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 1 gngtngaytt yaaygtnccn ttrga <210> 2 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 2 gynacdccng gyaaytcytt dccytc 26 <210> 3 <211> 9046 <212> ADN <213> Ogataea minuta

<220> <221> CDS <222> (4766).. (6016) <400> 3 <210> 5 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 5 aagcttgaca atgtaggaga tcataaacac atcgtgcgcg tc 42 <210> 6 <211> 65 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 6 <210> 7 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 7 ggatccgtgg gatttgcgtg atctacgtag tggttatttt <210> 8 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 8 ggtaccgcag tgaaaggcga tgccaccatg tgcaaggagt tc 42 <210> 9 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 9 actagtatga gatttccttc aattt <210> 10 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 10 gtcgacatga gatttccttc aattt <210> 11 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 11 agcttcagcc tctcttttat ctagaga 27 <210> 12 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 12 tctctagata aaagagaggc tgaagctcag ctgcagctgc aggagtc 47 <210> 13 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 13 ccagatctgg atcctcattt acccggagac agggagagg 39 <210> 14 <211> 47 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 14 tctctagata aaagagaggc tgaagctgaa attgtgttga cacagtc 47 <210> 15 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 15 aaagggccct caacactctc ccctgttgaa gctct <210> 16 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 16 atgacttcct tttcagcacc gcatc <210> 17 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 17 caaaattgca agcaagttaa ccg 23 <210> 18 <211> 1431 <212> ADN <213> Ogataea minuta

<400> 18

<210> 19 <211> 1187 <212> ADN <213> Ogataea minuta

<400> 19

<210> 20 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 20 gactagtatg acttcctttt cagcaccg 28 <210> 21 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 21 cagatcttca tgacaagaaa tcatcgaat 29 <210> 22 <211> 963 <212> ADN <213> Ogataea minuta

<220> <221> CDS <222> (1)..(963) <400> 22 <210> 24 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 24 atacaataca aagtcgagac tagtatggat atttacgaca ctcaaacctt <210> 25 <211> 50 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 25 tctatccaca cggatcagat cttcagacag aggtgccctc ctttgagctg <210> 26<211> 24<212> ADN<213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 26 ggaattcatg agatttcctt caat 24 <210> 27 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 27 ctccaccagc tgtacttctc ttttctcgag agata <210> 28 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 28 tatctctcga gaaaagagaa gtacagctgg tggag <210> 29 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 29 ggtcgactca tttacccggg gacag <210> 30 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 30 tgggtcatct gaatgtctct tttctcgaga gata 34 <210> 31 <211> 34 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 31 tatctctcga gaaaagagac attcagatga ccca 34 <210> 32 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 32 ggtcgaccta acactctccc ctgt 24 <210> 33 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 33 ggagctcatg gaaatgactg attttg 26 <210> 34 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 34 gaattcaaac ctgactgcgc ttctggatta cgccaattgt caag 44 <210> 35 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 35 cttgacaatt ggcgtaatcc agaagcgcag tcaggtttga attc 44 <210> 36 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 36 gcccgggtca tgaagtgatg aagaaatc 28 <210> 37 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 37 gggtaccatg gatatttacg acactc 26 <210> 38 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cebador <400> 38 gtctagatca gacagaggtg ccctcc 26 <210> 39 <211> 717 <212> ADN <213> Saccharomyces cerevisiae

<220> <221> CDS <222> (1).. (717) <400> 39

<210> 41 <211> 1356 <212> ADN <213> Trichoderma reesei

<220> <221> CDS <222> (1)..(1356) <400> 41

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 42 <211> 451 <212> PRT <213> Trichoderma reesei

<400> 42

ES 2 553 162 T3  

<210> 43 <211> 1053 <212> ADN <213> Aspergillus nidulans

<220> <221> CDS <222> (1)..(1053) <400> 43

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <211> 350 <212> PRT <213> Aspergillus nidulans

<400> 44

ES 2 553 162 T3  

<210> 45 <211> 5468 <212> ADN <213> Homo sapiens

<220> <221> CDS <222> (285).. (4967) <400> 45

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 46 <211> 1560 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 46

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 47 <211> 5425 <212> ADN <213> Canis familiaris

<220> <221> CDS <222> (244)..(4848) <400> 47

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 48 <211> 1534 <212> PRT <213> Canis familiaris

<400> 48

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 49 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 49 ctcaagggcc tggagactac g 21 <210> 50 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 50 cgggattccc gagtcgctca cc 22 <210> 51 <211> 1416 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> nucleótido sintético <400> 51

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 52 <211> 1416 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> nucleótido sintético <220> <221> CDS <222> (7).. (1410) <400> 52

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 53 <211> 714 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> nucleótido sintético <400> 53 <210> 54 <211> 714 <212> ADN <213> Artificial

ES 2 553 162 T3   <220> <223> nucleótido sintético <220> <221> CDS <222> (7)..(708) <400> 54

ES 2 553 162 T3   <210> 55 <211> 1437 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> nucleótido sintético <400> 55

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 56 <211> 1437 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> nucleótido sintético <220> <221> CDS <222> (7).. (1431) <400> 56

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 57 <211> 735 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> nucleótido sintético <400> 57

ES 2 553 162 T3   <210> 58 <211> 735 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> nucleótido sintético <220> <221> CDS <222> (7)..(729) <400> 58

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 59 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 59 atagaactag caactagatg aaaaagcctg aactcac 37 <210> 60 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 60 caaatcccac ggatcactat tcctttgccc tcggac 36 <210> 61 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 61 aattcgagct cggtacaggg atacatggga taccaaag 38 <210> 62 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 62 gaggatcccc gggtaccagg gtcgattttc ttggtcga 38 <210> 63 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 63 atgcccgtag attcttctca taagacagc 29

ES 2 553 162 T3   <210> 64 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 64 caaagtcatt taaatcaaat gcattagcgg <210> 65 <211> 1220 <212> ADN <213> Pichia pastoris

<400> 65

ES 2 553 162 T3   <210> 66

ES 2 553 162 T3   <211> 898 <212> ADN <213> Pichia pastoris

<400> 66 <210> 67 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 67 gactagtatg cccgtagatt cttctcata 29 <210> 68 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial

ES 2 553 162 T3   <220> <223> cebador <400> 68 cagatctcta ttcctggaag aatacaaagt <210> 69 <211> 915 <212> ADN <213> Pichia pastoris

<400> 69 <210> 70 <211> 304 <212> PRT <213> Pichia pastoris

ES 2 553 162 T3   <400> 70

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 71 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 71 gtctagaatg gaaatgactg attttgaact <210> 72 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 72 cggatcctca tgaagtgatg aagaaatcat <210> 73 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 73 atggcgggca aaaatcagaa atctagcgcg <210> 74 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial

ES 2 553 162 T3   <220> <223> cebador <400> 74 ttacaactcg tctttgacta gaggcgggga <210> 75 <211> 2520 <212> ADN <213> Ogataea minuta

<400> 75

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 76 <211> 839 <212> PRT <213> Ogataea minuta

<400> 76

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <223> cebador <400> 77 atgggcgaac gtacgggcaa aagtgcgctc <210> 78 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 78 ctaatcggaa attctccacg tgctcaagag <210> 79 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 79 atggggccca aaataaagac cggcaagaaa <210> 80 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 80 ctatttagca aaatgcagtt tgatgttgag <210> 81 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 81 atggacgaga aaaacatctc tggcttagaa <210> 82 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 82 ctactcacta tagacggagc agtcgatcga <210> 83 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220>

ES 2 553 162 T3   <223> cebador <400> 83 atgtccgagt cagagctgag aaaccgcaaa <210> 84 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 84 ctaagctata cgccaggtgg aaacccagtt <210> 85 <211> 2259 <212> ADN <213> Ogataea minuta

<400> 85

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 86 <211> 752 <212> PRT <213> Ogataea minuta

<400> 86

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 87 <211> 2265 <212> ADN <213> Ogataea minuta

<400> 87

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 88 <211> 754 <212> PRT <213> Ogataea minuta

<400> 88

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 89 <211> 2199 <212> ADN <213> Ogataea minuta

<400> 89

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 90 <211> 732 <212> PRT <213> Ogataea minuta

<400> 90

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <212> ADN <213> Ogataea minuta

<400> 91

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 92 <211> 746 <212> PRT <213> Ogataea minuta

<400> 92

ES 2 553 162 T3  

ES 2 553 162 T3   <210> 93 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 93 caagcttgga cctacaacac gtccgaagaa <210> 94 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 94 cggtaccggt ttgatacctt gggtggcaca <210> 95 <211> 31 <212> ADN

ES 2 553 162 T3   <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 95 gaagcttact acataattcg tgtacgtgtt c 31 <210> 96 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 96 cggtaccgtc gccgtattgg tcagcaatct c 31 <210> 97 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 97 gtcatgagat ccaagctgat ccctcaatgg agatctact 39 <210> 98 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 98 ggtgtgtggg ggatcgggat gcaaatggat ggctcgaac 39 <210> 99 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 99 gacggtatcg ataagcttga tgcgcggcct tccgacctt 39 <210> 100 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 100 ctggggaagc tcggatccgg ctcgaggtct tcgttcaga 39 <210> 101 <211> 38 <212> ADN

ES 2 553 162 T3   <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 101 ctagttctag agcggcccag gtcgctttca ggcagcag 38 <210> 102 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 102 caccgcggtg gcggccaagc ttgggtaccg gctcgcgtag <210> 103 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 103 gcagcccggg ggatccacga aaccacgtcc tact 34 <210> 104 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 104 ggggaagctc ggatcgactc atcttgaaac gca 33 <210> 105 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 105 agttctagag cggccttacc accattacat gcc 33 <210> 106 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 106 aattggagct ccaccgcggc cgcaacttac tcgacgctaa <210> 107 <211> 25 <212> ADN

ES 2 553 162 T3   <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 107 gaacggcact ggtcaacttg gccat <210> 108 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 108 cttcgtggcc gaggagcagg actga <210> 109 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 109 gaattctagc cgagcatgag cta 23 <210> 110 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 110 cgttcagact cttgttgatt ttccac 26 <210> 111 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 111 gctgtgccac tgcacgcctc gactc <210> 112 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 112 cttgtccctc ttgaatggcg agtg 24 <210> 113 <211> 20 <212> ADN

ES 2 553 162 T3   <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 113 ggaacacgcc aaacatcatg <210> 114 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 114 cacaagcaga atcaggcac 19 <210> 115 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 115 cggtgacgac ttcgactagt cgag 24 <210> 116 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 116 cggtgctgtt ggcgtcgtca tgggtg 26 <210> 117 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 117 ggcgcgttcc aattccactc tgctg <210> 118 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 118 cgacgagtcc tctcaccagg aggttg 26 <210> 119 <211> 18 <212> ADN

ES 2 553 162 T3   <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 119 tgtgggtgcg atcctgag 18 <210> 120 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 120 gccgtcgttg gagcaaaact <210> 121 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 121 gcatgtgcca ctgctaaa 18 <210> 122 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> cebador <400> 122 gaccaacttt cccgtgtaa 19

ES 2 553 162 T3  

REIVINDICACIONES

1.

Célula huésped de levadura transformada que comprende un ADNc que codifica para la proteína HAC1 activada de levadura y un gen de RRBP1 de humano o perro, en la que la célula huésped transformada comprende un gen que codifica para una proteína heteromultimérica foránea, en la que la proteína heteromultimérica es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.

2.

Célula huésped transformada según la reivindicación 1, que comprende dicho ADNc que codifica para la proteína HAC1 activada de levadura seleccionado de (a) o (b) a continuación: (a) un gen que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23; (b) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23 mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene la función de activar la respuesta de proteínas desplegadas (UPR), en la que varios aminoácidos son 20 o menos, preferiblemente 10 o menos, más preferiblemente 7 o menos, y más preferiblemente 5 o menos.

3.

Célula transformada según la reivindicación 1, que comprende dicho ADNc que codifica para la proteína HAC1 activada de levadura seleccionado de (i) o (j) a continuación: (i) un gen que codifica para la proteína HAC1 activada de Saccharomyces cerevisiae o Trichoderma reesei,

(j) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la proteína HAC1 activada de Saccharomyces cerevisiae o Trichoderma reesei mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene la función de activar la UPR, en la que varios aminoácidos son 20 o menos, preferiblemente 10 o menos, más preferiblemente 7 o menos, y más preferiblemente 5 o menos.

4.

Célula huésped transformada según la reivindicación 1, que comprende dicho ADNc que codifica para la proteína HAC1 activada de levadura seleccionado de (m) o (n) a continuación: (m) un gen que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 70; (n) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 70 mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene la función de activar la UPR, en la que varios aminoácidos son 20 o menos, preferiblemente 10 o menos, más preferiblemente 7 o menos, y más preferiblemente 5 o menos.

5.

Célula huésped transformada según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la levadura es una levadura asimiladora de metanol.

6.

Célula huésped transformada según la reivindicación 5, en la que la levadura asimiladora de metanol es Ogataea minuta.

7.

Célula huésped transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

8.

Célula huésped transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que el gen de PMT (proteína O-manosiltransferasa) está inactivado mediante inserción.

9.

Método para producir una proteína que comprende cultivar la célula huésped transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en un medio y tomar una muestra de la proteína heteromultimérica del producto de cultivo.

10.

Método según la reivindicación 9, en el que cultivo se lleva a cabo en condiciones en las que se inhibe la actividad proteína O-manosiltransferasa (PMT).

11.

Método según la reivindicación 10, en el que se inhibe la actividad proteína O-manosiltransferasa (PMT) con la adición de un inhibidor de la actividad PMT al medio.

12.

Método según la reivindicación 10, en el que se inhibe la actividad proteína O-manosiltransferasa (PMT)

ES 2 553 162 T3   inactivando mediante inserción el gen de PMT en la célula huésped.

13.

Método para producir una proteína según la reivindicación 10, en el que se inhibe la síntesis de cadena de O-azúcar inactivando mediante inserción el gen de PMT y añadiendo el inhibidor de la actividad PMT al medio.

14.

Método para producir una proteína según la reivindicación 11 ó 13, en el que el inhibidor de la actividad PMT es ácido 5-[[3,4-(1-fenilmetoxi)fenil]metilen]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolidinacético o ácido {(5Z)-4-oxo-5-3- (1-feniletoxi)-4-(2-feniletoxi)benciliden]-2-tioxo-1,3-tiazolidin-3-il}acético.

15.

Método para producir una célula huésped de levadura transformada que comprende las etapas de: (A) introducir un ADNc que codifica para la proteína HAC1 activada de levadura en una célula huésped de levadura; y (B) introducir el gen de RRBP1 en una célula huésped de levadura, en el que dicho ADNc que codifica para la proteína HAC1 activada de levadura es cualquiera de los siguientes genes (1), (2) o (3): (1) el gen seleccionado de (a) o (b) a continuación: (a) un gen que codifica para una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23; (b) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 23 mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene la función de activar la UPR, en el que varios aminoácidos son 20 o menos, preferiblemente 10 o menos, más preferiblemente 7 o menos, y más preferiblemente 5 o menos; (2) un gen que codifica para la proteína HAC1 activada de Saccharomyces cerevisiae o Trichoderma reesei;

(3) un gen que codifica para una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de la proteína HAC1 activada de Saccharomyces cerevisiae o

Trichoderma reesei mediante deleción, sustitución y/o adición de uno o varios aminoácidos y tiene la función de activar la UPR, en el que varios aminoácidos son 20 o menos, preferiblemente 10 o menos, más preferiblemente 7 o menos, y más preferiblemente 5 o menos; y en el que el gen de RRBP1 es un gen que codifica para la RRBP1 de humano o perro, y en el que la célula huésped transformada comprende un gen que codifica para una proteína heteromultimérica foránea introducido en la misma, en el que la proteína heteromultimérica es un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo.

16.

Método según la reivindicación 15, en el que la levadura es una levadura asimiladora de metanol.

17.

Método según la reivindicación 16, en el que la levadura asimiladora de metanol es Ogataea minuta.

18.

Método según la reivindicación 15, en el que la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

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