MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA MODULAR LA FOSFORILACIÓN DE LA BETA-CATENINA.

Un método para identificar un agente contra el cáncer, en el que dicho método comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un agente con una mezcla de reacción que comprende -catenina, axina y/o caseína cinasa I alfa (CKIa), (b) incubar dicha mezcla en condiciones que permitan un cambio en la fosforilación de -catenina en la serina 45 (S45), y (c) detectar la fosforilación de -catenina en S45, con lo que la fosforilación potenciada de -catenina en S45 indica que dicho agente es útil como un agente contra el cáncer

Campo de la Invención

5

La presente invención se refiere al campo del trata-miento del cáncer. Más específicamente, la presente inven-ción describe moduladores de -catenina, métodos para iden-tificar tales moduladores, así como composiciones y sus usos. 10

Antecedentes de la Invención

Los estudios genéticos en moscas, ranas y mamíferos situaron a la ruta Wnt como un regulador maestro en el de-15 sarrollo de animales, tanto durante la embriogénesis como en el organismo maduro [Wodarz, A. y R. Nusse (1998) Annu Rev Cell Dev Biol 14 : 59-88; Eastman, Q. y R. Grosschedl (1999) Curr Opin Cell Biol 11: 233-240; Peifer, M. y P. Po-lakis (2000) Science 287: 1606-1609; Huelsken, J. y W. 20 Birchmeier (2001) Curr Opin Genet Dev 11: 547-553]. Una diana principal de la ruta Wnt es la catenina citoplásmica la cual, cuando se estabiliza en respuesta a la señaliza-ción de Wnt, entra en el núcleo y sirve como un coactivador de la transcripción inducida por TCF/LEF [Willert, K. y R. 25 Nusse (1998) Curr Opin Genet Dev 8: 95-102; Bienz, M. y H. Clevers (2000) Cell 103: 311-320; Polakis, P. (2000) Genes Dev 14: 1837-1851]. Las células no estimuladas alojan un complejo multiproteico citoplásmico que contiene -catenina, la Ser/Thr cinasa glucógeno sintasa cinasa-3 30 (GSK-3), axina [Zeng, L. et al. (1997) Cell 90: 181-192;

Ikeda, S. et al. (1998) EMBO J 17: 1371-1384; Sakanaka, C. et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U. S. A. 95: 3020-3023], o su homólogo axina/conductina [Behrens, J. et al. (1998) Science 280: 596-599; Yamamoto, H. et al. (1998) Mol Cell Biol 18: 2867-2875], y el supresor de tumores de la polipo-5 sis adenomatosa del colon (APC) [Groden, J. et al. (1991) Cell 66: 589-600; Kinzler, K.W. et al, (1991) Science 253: 661-665]. Se piensa que APC y axina desempeñan una función de armazón, facilitando la fosforilación de -catenina por GSK-3 en la región N-terminal [Hart, M.J., R. et al. 10 (1998) Curr Biol 8: 573-581; Hinoi, T. et al. (2000) J Biol Chem 275: 34399-34406]. Este suceso o sucesos de fosforila-ción marcan a la -catenina para la ubiquitinación por la SCF-TrCP E3 y la degradación proteasómica subsiguiente [Aberle, H. et al. (1997) EMBO J 16: 3797-3804; Hart, M. et 15 al. (1999) Curr Biol 9: 207-210; Kitagawa, M. et al. (1999) EMBO J 18: 2401-2410; Latres, E. et al. (1999) Oncogene 18: 849-854; Winston, J.T. et al. (1999) Genes Dev 13: 270-283].

La señalización de Wnt se inicia mediante proteínas 20 de Wnt segregadas, que se unen a miembros de la familia de receptores Frizzled [Wodarz y Nusse (1998) id ibid.]. La unión a Wnt da como resultado la activación de Dishevelled (Dvl-1, 2 y 3 en seres humanos y ratones) [Boutros, M. y M. Mlodzik (1999) Mech Dev 83: 27-37], que, vía su asociación 25 con axina, evita que GSK-3 fosforile -catenina, condu-ciendo su estabilización [Yamamoto, H. et al. (1999) J Biol Chem 274: 10681-10684]. El mecanismo de acción de Dvl in-hibiendo la fosforilación de -catenina por GSK-3 es des-conocido en su mayor parte. Según un modelo actual, implica 30 FRAT (GBP), una proteína de unión a GSK-3 que desplaza la

axina de GSK-3, dando como resultado que no se fosforile la -catenina [Li, L. et al (1999) EMBO J 18: 4233-4240; Farr, G.H. et al. (2000) J Cell Biol 148: 691-702; Bax, B. et al. (2001) Structure (Camb) 9: 1143-1152; Fraser, E. et al. (2002) J Biol Chem 277(3): 2176-85]. Sin embargo, ac-5 tualmente no hay pruebas que relacionen la actividad de Dvl directamente con la disociación de la axina-GSK-3 inducida por FRAT.

La importancia de la fosforilación de -catenina en el control de su degradación se ha deducido principalmente 10 de estudios de mutaciones de -catenina N-terminal en células tumorales [Polakis (2000) id ibid.]. Éstas, al igual que las aberraciones de APC o axina, conducen a una acumu-lación excesiva de -catenina en el núcleo, y a la expre-sión desregulada de sus genes diana, promoviendo la trans-15 formación neoplásica [Morin, P. J. et al. (1997) Science 275: 1787-1790; Rubinfeld, B. et al. (1997) Science 275: 1790-1792; Sparks, A. B. et al. (1998) Cancer Res 58: 1130-1134]. Las mutaciones de -catenina se agrupan alrededor del sitio de unión a SCF-TrCP, y por lo tanto se piensa que 20 comprometen a la ubiquitinación de -catenina y su degrada-ción consiguiente [Wong, C. M. et al. (2001) Cancer 92: 136-145]. Muchas de estas mutaciones estabilizantes se pro-ducen en restos de Ser/Thr a lo largo de un sitio de fosfo-rilación de GSK putativo que moldea el motivo de unión a E3 25 ubiquitina ligasa, enfatizando el papel de GSK-3 en la de-terminación de la estabilidad de -catenina [Polakis (2000) id ibid.]. Incluso, la Serina 45 (S45), el punto de muta-ción tumoral más frecuente individual, no se ajusta a un sitio de GSK-3 [Polakis (2000) id ibid.; Wong et al. 30

(2001) id ibid.]. Esto puede haber contribuido a la noción de que la -catenina es un sustrato inusual de GSK-3 que obvia la necesidad del cebado-fosforilación como un activa-dor para iniciar una cascada de fosforilación mediante GSK-3 [Ding, V. W. et al. (2000) J Biol Chem 275: 32475-32481; 5 Cohen, P. y S. Frame (2001) Nat Rev Mol Cell Biol 2: 769-776; Harwood, A. J. (2001) Cell 105: 821-824]. Contraria-mente a este punto de vista, los resultados de los invento-res muestran que la fosforilación de -catenina en S45 es inducida por un complejo de axina-CKI, independientemente 10 de CSK-3. Además, parece que este suceso molecular consti-tuye una diana importante para la regulación de la ruta de Wnt, puesto que los inventores muestran que Dvl puede fun-cionar como un inhibidor de la fosforilación de -catenina (véanse los Ejemplos). 15

Por tanto, en base a los hallazgos de los inventores, se describen moduladores de la fosforilación de -catenina. Mientras que la -catenina normalmente fosforilada es diri-gida hacia la degradación, en muchos tumores (particular-mente en cáncer colorrectal) la maquinaria de la fosforila-20 ción está mutada, la -catenina no fosforilada se acumula en el núcleo y funciona como un activador transcripcional. Consiguientemente, los moduladores descritos, especialmente los potenciadores de la fosforilación de -catenina, son herramientas importantes para la prevención y control del 25 desarrollo de cáncer, en particular para aquellos tipos de cáncer que resultan de la acumulación y exceso de actividad de -catenina no fosforilada. Sorprendentemente, ciertos tipos de tumores (por ejemplo, melanoma maligno) acumulan -catenina establemente fosforilada. En una descripción 30

adicional, se muestra un método para suprimir la fosforila-ción de -catenina en esta clase específica de tumores, tratando células con un inhibidor como se describe.

La invención describe tanto potenciadores como in-hibidores de la fosforilación de -catenina. De este modo, 5 además, se describe un método para identificar moduladores, es decir, inhibidores y potenciadores, de la fosforilación de -catenina.

Los objetos de la invención serán manifiestos a medi-da que transcurra la descripción. 10

Sumario de la Invención

La presente invención se refiere a moduladores de la fosforilación de -catenina y a su uso en el tratamiento 15 del cáncer.

De este modo, en un primer aspecto, la presente in-vención reivindica un método para identificar un agente contra el cáncer, en el que dicho método comprende las eta-pas de: 20

(a) poner en contacto un agente con una mezcla de reac-ción que comprende -catenina, axina y/o caseína cinasa I alfa (CKIa),

(b) incubar dicha mezcla en condiciones que permitan un 25 cambio en la fosforilación de -catenina en la serina 45 (S45), y

(c) detectar la fosforilación de -catenina en S45, con lo que la fosforilación potenciada de -catenina en S45 indica que dicho agente es útil como un agente contra 30

el cáncer.

Como se describe, un modulador es un inhibidor de la fosforilación de -catenina en Serina 45 (S45), selec-cionándose dicho inhibidor de una cualquiera de las proteí-5 nas Dishevelled (DVl), una proteína Wnt, fosfatasa...

Reivindicaciones

1. Un método para identificar un agente contra el cáncer, en el que dicho método comprende las etapas de:

5

(a) poner en contacto un agente con una mezcla de reac-ción que comprende -catenina, axina y/o caseína cinasa I alfa (CKIa),

(b) incubar dicha mezcla en condiciones que permitan un cambio en la fosforilación de -catenina en la serina 10 45 (S45), y

(c) detectar la fosforilación de -catenina en S45,

con lo que la fosforilación potenciada de -catenina en S45 indica que dicho agente es útil como un agente con-tra el cáncer. 15

2. Uso de CKI-7 para la fabricación de un medica-mento identificado para el tratamiento de cáncer.

3. El uso de la reivindicación 2, en el que -catenina de dicho cáncer está estabilizada, y su fosforila-20 ción no está impedida.

4. El uso de la reivindicación 3, en el que dicho cáncer es melanoma maligno.

5. Una composición farmacéutica que comprende CKI-7. 25

6. Uso de un ARNsi de CKI- para la fabricación de un medicamento identificado para el tratamiento de cáncer.

7. Una composición farmacéutica que comprende un ARNsi de CKI-.