VACUNA CONTRA LA TUBERCULOSIS CON EFICACIA MEJORADA.
Una célula Mycobacterium que es deficiente en ureasa y que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de fusión que comprende (a) al menos un dominio de un polipéptido,
en donde dicho dominio de polipéptido es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria en un mamífero, y (b) un dominio de escape fagolisosómico
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2004/004345.
Solicitante: MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FORDERUNG DER WISSENSCHAFTEN E.V..
Nacionalidad solicitante: Alemania.
Dirección: HOFGARTENSTRASSE 8,80539 MUNCHEN.
Inventor/es: KAUFMANN, STEFAN, H., E., HESS, JURGEN, RAUPACH,BARBEL, GRODE,LEANDER.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 7 de Julio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/195 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de origen bacteriano.
- C07K14/35 C07K 14/00 […] › de Mycobacteriaceae (F).
Clasificación PCT:
- C07K14/195 C07K 14/00 […] › de origen bacteriano.
- C07K14/35 C07K 14/00 […] › de Mycobacteriaceae (F).
Clasificación antigua:
- C07K14/195 C07K 14/00 […] › de origen bacteriano.
- C07K14/35 C07K 14/00 […] › de Mycobacteriaceae (F).
Fragmento de la descripción:
Vacuna contra la tuberculosis con eficacia mejorada.
La presente invención se refiere a nuevas vacunas recombinantes que proporcionan inmunidad protectora especialmente contra la tuberculosis.
La tuberculosis (TB) causada por Mycobacterium tuberculosis sigue siendo un problema global importante. Se estima que un tercio de la población mundial está infectada con M. tuberculosis (Kochi, 1991). En muchos países, la única medida para control de la TB ha sido la vacunación con el bacilo Calmette-Guérin (BCG) de M. bovis. La eficacia global de la vacuna BCG contra TB, sin embargo, es aproximadamente 50% con variaciones extremas que van desde 0% a 80% entre diferentes pruebas en campo (Roche et al., 1995). Así pues, BCG debería mejorarse, v.g. por ingeniería genética, para proporcionar una vacuna para mejor control de la TB (Murray et al., 1996; Hess y Kaufmann, 1993). La aparición extendida de cepas de M. tuberculosis con resistencia múltiple a los fármacos pone de manifiesto adicionalmente la necesidad urgente de nuevas vacunas TB (Grange, 1996).
M. tuberculosis pertenece al grupo de bacterias intracelulares que se replican en el interior de las vacuolas fagosómicas de los macrófagos en reposo, por lo que la protección contra TB depende de la inmunidad mediada por las células T (Kaufmann, 1993). Varios estudios en ratones y humanos, sin embargo, han demostrado que las Micobacterias estimulan las células T CD4 y CD8 restringidas por el complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) clase II o clase I, respectivamente (Kaufmann, 1993).
El papel importante de las células T CD8 restringidas por el MHC clase I se demostró convincentemente por el fallo de ratones deficientes en microglobulina ß2 (ß2m) para controlar la infección experimental de M. tuberculosis (Flynn et al., 1993). Debido a que estos ratones mutantes carecen del MHC clase I, no pueden desarrollarse células T CD8 funcionales. En contraste con la infección de M. tuberculosis, los ratones deficientes en ß2m son capaces de controlar ciertas dosis infecciosas de la cepa de la vacuna BCG (Flynn et al., 1993; Ladel et al., 1995). Adicionalmente, la vacunación con BCG de ratones deficientes en ß2m prolongaba la supervivencia después de la infección subsiguiente de M. tuberculosis, mientras que los C57BL/6 inmunizados con BCG resistían la TB (Flynn et al., 1993). Esta dependencia diferencial de las células T CD8 entre M. tuberculosis y BCG puede explicarse como sigue: los antígenos de M. tuberculosis logran mejor acceso al citoplasma que los antígenos de BCG, conduciendo a una presentación más pronunciada del MHC clase I (Hess y Kaufmann, 1993). Por consiguiente, una respuesta de las células T CD8 más eficaz es generada por M. tuberculosis. Esta noción se vio respaldada recientemente por la presentación de MHC clase I incrementada de un antígeno irrelevante, ovoalbúmina, por infección simultánea con M. tuberculosis, en lugar de BCG, de células presentadoras de antígeno (APC) (Mazzaccaro et al., 1996).
Las proteínas secretadas de M. tuberculosis comprenden una fuente valiosa de antígenos para la presentación de MHC clase I. Recientemente, una vacuna de DNA que codificaba el antígeno secretado Ag85A provocaba respuestas de células T CD8 restringidas por el MHC clase I en los ratones, lo que puede contribuir a la defensa contra TB (Huygen et al., 1996). En general, se están acumulando pruebas de que la inmunización con antígenos proteínicos secretados de M. tuberculosis induce cierta protección contra TB en cobayos y ratones (Horwitz et al., 1995; Andersen, 1994). Una meta importante hacia el desarrollo de vacunas TB mejoradas basadas en BCG, por consiguiente, consiste en aumentar la accesibilidad de los antígenos específicos de BCG secretados al citoplasma de las APC infectadas. El suministro subsiguiente de péptidos derivados de estas proteínas secretadas en el camino de presentación del MHC clase I puede potenciar la respuesta inmunitaria específica de BCG ya existente para prevención de la TB.
El escape fagolisosómico de L. monocytogenes representa un mecanismo singular para facilitar la presentación antigénica al MHC clase I de antígenos de listeria (Berche et al., 1987; Portnoy et al., 1988). La listeriolisina (Hly), una citolisina formadora de poros activada por sulfhidrilo, es esencial para la liberación de los microorganismos L. monocytogenes por las vacuolas fagolisosómicas en el citosol de las células hospedadoras (Gaillard et al., 1987; Portnoy et al., 1988). Esta función de escape fue transferida recientemente a Bacillus subtilis y a cepas atenuadas de Salmonella ssp. (Bielecki et al., 1991; Gentschev et al., 1995; Hess y Kaufmann, 1997). La expresión de Hly por una cepa mutante asporogénica de B. subtilis o en Salmonella ssp. da como resultado el escape de bacterias del fagolisosoma al citosol de las células J774 semejantes a macrófagos (Bielecki et al., 1991; Gentschev et al., 1995; Hess y Kaufmann, 1997).
WO 99/101496 y Hess et al (1998) describen cepas recombinantes de Mycobacterium bovis que secretan proteínas de fusión de listeriolisina biológicamente activas. Se ha demostrado que estas cepas de M. bovis son vacunas eficaces contra TB en varios modelos animales.
De acuerdo con la presente invención, se expresó Hly en cepas BCG deficientes en ureasa. Estas cepas BCG deficientes en ureasa exhiben una actividad incrementada de Hly en fagosomas y aumentaban a su vez la formación de poros en las membranas endosómicas, conduciendo a inmunoprotectividad superior. Adicionalmente, las cepas BCG-Hly deficientes en ureasa están implicadas en procesos apoptóticos, lo que puede contribuir a una protección inmunológica mejorada. Así, las cepas BCG deficientes de ureasa tienen una capacidad como vacuna mejorada aún más. Además, se encontró sorprendentemente que las cepas BCG deficientes de ureasa exhiben un perfil de seguridad incrementado comparado con las cepas BCG parentales y por consiguiente son particularmente adecuadas para la vacunación de pacientes inmunodeficientes.
Un primer aspecto de la presente invención es una célula de Mycobacterium que es eficiente en ureasa y comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de fusión que comprende (a) al menos un dominio de un polipéptido, en donde dicho dominio de polipéptido es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria en un mamífero, y (b) un dominio de escape fagolisosómico. Se prefiere que la célula sea capaz de expresar la molécula de ácido nucleico de la invención. Más preferiblemente, la célula es capaz de secretar el polipéptido de fusión y/o de proporcionar el mismo en una forma adecuada para el reconocimiento de antígenos restringidos por el MHC clase I.
La célula bacteriana de la invención es una célula de Mycobacterium. La deficiencia en ureasa puede conseguirse desactivando parcial o completamente una o varias moléculas celulares de ácido nucleico que codifican una subunidad ureasa, particularmente ureA codificante de la subunidad A de ureasa, ureB codificante de la subunidad B de ureasa y/o ureC codificante de la subunidad C de ureasa. Las secuencias de ureA, ureB y ureC en Micobacterias, particularmente en M. bovis y M. tuberculosis y las proteínas codificadas por las mismas han sido descritas por Reyrat et al., (1995) y Clemens et al., (1995).
Preferiblemente, la cepa Mycobacterium deficiente en ureasa se obtiene por deleciones y/o inserciones de uno o varios nucleótidos en secuencias de ácido nucleico codificantes de subunidades de ureasa y/o sus secuencias de control de la expresión. Las deleciones y/o inserciones pueden generarse por recombinación homóloga, inserción de transposones u otros métodos adecuados.
En una realización especialmente preferida, la secuencia ureC se desactiva, v.g. por construcción de un vector suicida que contiene un gen de ureC interrumpido por un gen marcador de selección, transformación de las células diana con el vector y cribado para selección de células positivas del marcador que tienen un fenotipo de ureasa negativo como se describe por Reyrat et al., (1995).
La célula de la invención es preferiblemente una célula de M. bovis, una célula de M. tuberculosis, particularmente una célula atenuada de M. tuberculosis u otras Micobacterias, v.g. M. microti, M. smegmatis, M. canettii, M....
Reivindicaciones:
1. Una célula Mycobacterium que es deficiente en ureasa y que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de fusión que comprende (a) al menos un dominio de un polipéptido, en donde dicho dominio de polipéptido es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria en un mamífero, y (b) un dominio de escape fagolisosómico.
2. La célula de la reivindicación 1, en donde al menos una subunidad de ureasa celular que codifica una secuencia de ácido nucleico está desactivada.
3. La célula de la reivindicación 2, en donde al menos la secuencia codificante de la subunidad C de ureasa celular está desactivada.
4. La célula de la reivindicación 1, en donde dicho dominio de escape fagolisosómico es un dominio de escape fagolisosómico de Listeria.
5. La célula de la reivindicación 1, en donde dicho dominio de escape fagolisosómico está codificado por una molécula de ácido nucleico seleccionada de:
6. La célula de la reivindicación 1, en donde el dominio capaz de suscitar una respuesta inmunitaria es un péptido o polipéptido capaz de suscitar respuestas de las células T CD8 restringidas por el MHC clase I.
7. La célula de la reivindicación 1, en donde el dominio capaz de suscitar una respuesta inmunitaria es un polipéptido de Mycobacterium.
8. La célula de la reivindicación 7, en donde el dominio capaz de suscitar una respuesta inmunitaria se selecciona de los antígenos de Mycobacterium Ag85B (M. tuberculosis), la Ag85B (M. bovis), Ag85A (M. tuberculosis) y ESAT-6 (M. tuberculosis) o un fragmento inmunógeno de los mismos.
9. La célula de la reivindicación 8, en donde el dominio capaz de suscitar una respuesta inmunitaria es el antígeno Ag85B o un fragmento inmunógeno del mismo.
10. La célula de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de fusión está precedido por una secuencia de péptido señal.
11. La célula de la reivindicación 1, en donde está localizado un enlazador peptídico entre el dominio que suscita la respuesta inmunitaria y el dominio fagolisosómico.
12. La célula de la reivindicación 1, en donde dicha molécula de ácido nucleico está enlazada operativamente con una secuencia de control de la expresión.
13. La célula de la reivindicación 12, en donde dicha secuencia de control de la expresión es activa en dicha célula.
14. La célula de la reivindicación 1, en donde dicha molécula de ácido nucleico está localizada en un vector.
15. La célula de la reivindicación 1, que es una célula de Mycobacterium bovis.
16. Una célula de Mycobacterium que es deficiente en ureasa y que comprende al menos una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica un péptido o polipéptido de escape fagolisosómico.
17. La célula de la reivindicación 16, que comprende al menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional que codifica un péptido o polipéptido capaz de suscitar una respuesta inmunitaria en un mamífero.
18. La célula de la reivindicación 16, que es una célula de Mycobacterium bovis.
19. La célula de las reivindicaciones 1 ó 17, en donde el dominio de péptido o polipéptido capaz de suscitar una respuesta inmunitaria se selecciona de autoantígenos, antígenos tumorales, antígenos virales, antígenos parasitarios, antígenos bacterianos y fragmentos inmunógenos de los mismos.
20. La célula de las reivindicaciones 1 ó 16, que es capaz de expresar dicha al menos una molécula de ácido nucleico recombinante.
21. La célula de la reivindicación 20, que es capaz de secretar un polipéptido codificado por dicha al menos una molécula de ácido nucleico.
22. La célula de las reivindicaciones 1 ó 21, que tiene una persistencia intracelular en macrófagos infectados que es igual o menor que la persistencia intracelular de una célula nativa de Mycobacterium.
23. Una composición farmacéutica que comprende como agente activo una célula de las reivindicaciones 1 ó 16, opcionalmente junto con diluyentes, vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
24. La composición de la reivindicación 23, que es una vacuna viva adecuada para administración a una superficie mucosal o por la ruta parenteral.
25. Un método para la preparación de una vacuna viva que comprende formular una célula de las reivindicaciones 1 ó 16 en una cantidad farmacéuticamente eficaz con diluyentes, vehículos y adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
26. Un método para preparar la célula de Mycobacterium de la reivindicación 1, que comprende los pasos:
27. El método de la reivindicación 26, en donde dicha célula es una célula de M. bovis.
28. Un método para preparar la célula de Mycobacterium de la reivindicación 16, que comprende los pasos de:
29. El método de la reivindicación 28 que comprende insertar al menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional en la célula bacteriana, codificando dicha molécula de ácido nucleico recombinante adicional un péptido o polipéptido capaz de suscitar una respuesta inmunitaria en un mamífero.
30. El método de la reivindicación 26 ó 28, en donde el dominio de péptido o polipéptido capaz de suscitar una respuesta inmunitaria se selecciona de autoantígenos, antígenos tumorales, antígenos virales, antígenos parasitarios, antígenos bacterianos y fragmentos inmunógenos de los mismos.
31. El uso de una célula bacteriana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-22 para la fabricación de una vacuna viva.
32. El uso de la reivindicación 31 para la fabricación de una vacuna para individuos inmunodeficientes.
33. El uso de la reivindicación 32 para la fabricación de una vacuna para individuos que sufren una infección de HIV.
34. El uso de la reivindicación 31 para la fabricación de una vacuna contra tumores.
35. El uso de la reivindicación 34 para la fabricación de una vacuna contra el cáncer superficial de vejiga.
36. El uso de la reivindicación 31 para la fabricación de una vacuna en el campo veterinario.
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