Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos codificante ocomplementaria a una secuencia que codifica una metiltransferasa flavonoide (FMT) en donde dicha secuencia denucleótidos comprende:

(i) una secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, 5 SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 26;

(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 70 % de identidad después de alineación óptima con laSEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 26;

(iii) una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones de alta rigurosidad para la SEQ ID NO: 1, SEQID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 26 o su forma complementaria;

(iv) una secuencia de nucleótidos capaz de codificar la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7;

(v) una secuencia de nucleótidos capaz de codificar una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70 % deidentidad después de alineación óptima con la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7;

(vi) una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones de alta rigurosidad para la secuencia denucleótidos en (iv) o (v) o su forma complementaria.

Secuencias genéticas que tienen actividad de metiltransferasa y usos de las mismas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con una secuencia genética que codifica un polipéptido que tiene actividad metiltransferasa y el uso de la secuencia genética y/o el polipéptido para modificar una o más características fenotípicas de una planta. La metiltransferasa de la presente invención actúa sobre los flavonoides, preferiblemente cuando el flavonoide es una antocianina. Más particularmente, la presente invención se relaciona con un polipéptido que tiene actividad S-adenosil-L-metionina: antocianina 3’ -Ometiltransferasa o S-adenosil-L-metionina: antocianina 3’, 5’-O-metiltransferasa. La presente invención aún se relaciona adicionalmente con una secuencia genética que codifica un polipéptido que tiene actividad metiltransferasa derivada de Petunia. Se describen las moléculas anticodificante y codificante que corresponden a toda o parte de la secuencia genética objeto así como también plantas genéticamente modificadas así como también flores de corte, partes, extractos y tejido reproductivo de tales plantas.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Los detalles bibliográficos de las publicaciones referidas por el autor en esta especificación se recolectan al final de la descripción.

No se hace referencia a cualquier técnica anterior en esta especificación, y no se debe tomar como, un conocimiento o alguna forma de sugerencia de que está técnica anterior forma parte del conocimiento general común en cualquier país.

La industria de las flores o plantas ornamentales se esfuerza por desarrollar nuevas y diferentes variedades de flores y/o plantas. Una forma efectiva de crear tales variedades novedosas es a través de la manipulación del color de la flor. Se han utilizando técnicas de siembra clásicas con cierto éxito para producir una amplia gama de colores para la mayor parte de variedades comerciales de flores y/o plantas disponibles actualmente. Este método se ha limitado, sin embargo, por las restricciones de un grupo de genes de una especie particular y por esta razón es raro para una única especie tener el espectro completo de variedades de color. Por ejemplo, el desarrollo de variedades de color novedosas de plantas o partes de planta tales como flores, follaje y tallos ofrecería una oportunidad significativa en los mercados de flores de corte y ornamentales. En la industria de las flores o de las plantas ornamentales, el desarrollo de variedades de color novedosas de especies de florecimiento principales tales como rosa, crisantemo, tulipán, lirio, clavel, gerbera, orquídea, lisianthus, begonia, torenia, geranio, petunia, nierembergia, geranio pensamiento, balsaminia y violeta de persia serían de gran interés. Un ejemplo más específico sería el desarrollo de una rosa azul o gerbera para el mercado de flores de corte.

Adicionalmente, el desarrollo de variedades de color novedosas de partes de planta tales como vegetales, frutos y semillas ofrecería oportunidades significativas en la agricultura. Por ejemplo, las semillas de color novedosas serían útiles como etiquetas privadas para las plantas. Adicionalmente las modificaciones a los flavonoides comunes para las bayas que incluyen uvas y sus jugos que incluyen vino tienen el potencial para impartir características de valor de estilo alteradas a tales industrias de frutos y subproductos.

El color de la flor se debe predominantemente a tres tipos de pigmentos: flavonoides, carotenoides y betalaínas. De los tres, los flavonoides son los más comunes y contribuyen a una gama de colores de amarillo a rojo a azul. Las moléculas de flavonoide que hacen la contribución principal al color de la flor son las antocianinas, que son derivados glucosilados de cianidina y su derivado metilado peonidina, delfinidina y sus derivados metilados petunidina y malvidina y pelargonidina. Las antocianinas se localizan en las vacuolas de las células epidérmicas de los pétalos o las vacuolas de las células subepidérmicas de las hojas.

Los pigmentos de flavonoide son metabolitos secundarios de la ruta fenilpropanoide. La ruta biosintética para los pigmentos de flavonoide (ruta flavonoide) están bien establecidos, (Holton and Cornish, Plant Cell 7: 1071-1083, 1995; Mol et al., Trends Plant Sci. 3: 212-217, 1998; Winkel-Shirley, Plant Physiol. 126: 485-493, 2001 a y Winkel-Shirley, Plant Physiol. 127: 1399-1404, 2001b) y se muestran en las Figuras 1A y B. Se involucran tres reacciones y enzimas en la conversión de fenilalanina a p-coumaroil-CoA, uno de los primeros sustratos clave en la ruta de flavonoide. Las enzimas son fenilalanina amoniaco-liasa (PAL) , cinnamato 4-hidroxilasa (C4H) y 4-coumarato: ligasa CoA (4CL) . La primera etapa comprometida en la ruta implica la condensación de tres moléculas de malonil-CoA (proporcionadas por la acción de acetil CoA carboxilasa (ACC) en acetil CoA y CO2) con una molécula de pcoumaroil-CoA. Esta reacción se cataliza por la enzima sintasa calcona (CHS) . El producto de esta reacción, 2’, 4, 4’, 6’, tetrahidroxi-calcona, se isomeriza normalmente rápidamente mediante la enzima calcona flavanona isomerasa (CHI) para producir naringenina. La naringenina se hidroxila posteriormente en la posición 3 del anillo central mediante flavanona 3-hidroxilasa (F3H) para producir dihidrocamferol (DHK) .

El anillo B de DHK se puede hidroxilar en las posiciones 3’, o las posiciones 3’ y 5’, para producir dihidroquercetina (DHQ) y dihidromiricetina (DHM) , respectivamente. El patrón de hidroxilación del anillo B cumple una función clave en la determinación del color del pétalo, con DHK que conduce de manera general a la producción de los pigmentos basados en pelargonidina rojo ladrillo, el DHQ conduce de manera general a pigmentos con base en cianidina rojo/rosado y DHM que conduce de manera general a pigmentos basados en delfinidina azul/violeta.

Los dihidroflavonoles (DHK, DHQ y DHM) también pueden actuar mediante sintasa de flavonol para producir los flavonoles camferol, quercetina y miricetina. Los flavonoles son incoloros pero actúan como copigmentos con las antocianinas para mejorar el color de la flor.

La siguiente etapa en la ruta, que conduce a la producción de las antocianinas de color de los dihidroflavonoles, implica dihidroflavonol 4-reductasa (DFR) con la producción de las leucoantocianidinas. Estas moléculas de flavonoide son inestables bajo condiciones fisiológicas normales y glicosilación en la posición 3, a través de la acción de glicosiltransferasas, estabiliza la molécula de antocinidina permitiendo así la acumulación de antocianinas. En general, las glisosiltransferasas transfieren unas unidades estructurales de azúcar de azúcares UDP y muestran altas especificidades para la posición de glicosilación y relativamente bajas especificidades para los sustratos receptores (Seitz and Hinderer, Anthocyanins. In: Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants. Constabel, F. y Vasil, I.K. (eds.) , Academic Press, New York, USA, 5: 49-76, 1988) . Las antocianinas pueden ocurrir como 3monosidas, 3-biosidas y 3-triosidas así como también 3, 5-diglicosidas y 3, 7-diglicosidas asociadas con los azúcares glucosa, galactosa, ramnosa, arabinosa y xilosa (Strack and Wray, In: The Flavonoids -Advances in Research since 1986. Harborne, J.B. (ed) , Chapman and Hall, London, UK, 1-22, 1993) .

Las glicosiltransferasas implicadas en la estabilización de la molécula de antocianidina incluyen glucosa UDP: 3glicosiltransferasa flavonoide (3GT) , que transfiere una unidad estructural desde la glucosa UDP hasta la posición 3-O de la molécula antocianidina para producir antocianidina 3-O-glucósido.

En petunia y pensamiento (entre otros) , estas antocianinas luego se pueden glicosilar mediante otra glicosiltransferasa, ramnosa UDP: antocianidina 3-glucósido ramnosiltransferasa (3RT) , que agrega un grupo ramnosa a la glucosa ligada 3-O de la molécula antocianina para producir las antocianidina 3-rutinosidas, y una vez aciladas, se pueden modificar adicionalmente mediante UDP: glucosa antocianina 5 glicosiltransferasa (5GT) .

Muchos glicósidos antocianidina existen en la forma de derivados poliacilados. La acilación puede ser importante para la captación de antocianinas en las vacuolas como se demuestra por Hopp and Seitz (Plant 170: 74-85, 1987) . Los grupos acilo que modifican las glicosidas antocianidina se pueden dividir en dos clases principales... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos codificante o complementaria a una secuencia que codifica una metiltransferasa flavonoide (FMT) en donde dicha secuencia de nucleótidos comprende:

(i) una secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 26;

(ii) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 70 % de identidad después de alineación óptima con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6º SEQ ID NO: 26;

(iii) una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones de alta rigurosidad para la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 26 o su forma complementaria;

(iv) una secuencia de nucleótidos capaz de codificar la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7;

(v) una secuencia de nucleótidos capaz de codificar una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70 % de identidad después de alineación óptima con la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7;

(vi) una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones de alta rigurosidad para la secuencia de nucleótidos en (iv) o (v) o su forma complementaria.

2. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1 en donde el FMT modula o de otra forma facilita la metilación de una antocianina.

3. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2 en donde la molécula antocianina es un derivado de delfinidina o un derivado de petunidina o cianidina.

4. La molécula de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde el FMT es una S-adenosil-L-metionina O-metiltransferasa Clase I (SAM-OMT) .

5. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 4 en donde el FMT es un 3’ FMT o 3’5’ FMT.

6. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 2 o 3 en donde la molécula antocianina es 3glucósido delfinidina, 3, 5-glucósido delfinidina o 3-rutinosida delfinidina o en donde la metilación de una molécula antocianina resulta en la producción de un derivado petunidina, malvidina o peonidina.

7. La molécula de ácido nucleico aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde la molécula es de origen Petunia.

8. Una construcción genética que comprende una molécula de ácido nucleico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Una planta genéticamente modificada o parte de la misma o células de la misma que comprende una molécula de ácido nucleico no autóctona como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde dicha planta o parte de la misma o células de la misma es de una especie de flor de corte, una especie hortícola o una especie agrícola, en donde la planta hortícola o agrícola exhibe preferiblemente flores alteradas o inflorescencia, en donde dicha parte modificada es preferiblemente un sépalo, bráctea, peciolo, pedúnculo, ovario, tallo, antera, hoja, raíz, flor, semilla, fruto, nuez, baya o vegetal y/o en donde la planta se selecciona preferiblemente de una rosa, clavel, lisianthus, petunia, lirio, pensamiento, gerbera, crisantemo, Torenia, Begonia, Violeta de persia, Nierembergia, Catharanthus, Geranio pensamiento, Orquídea, uva, Euphorbia o Fuchsia.

10. Progenie, descendencia de progenie o estirpes vegetativamente propagadas de una planta genéticamente modificada que comprende una molécula de ácido nucleico como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha progenie, descendencia de progenie o estirpes vegetativamente propagadas comprenden una molécula de ácido nucleico no autóctona como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

11. Un método para producir una planta genéticamente modificada capaz de sintetizar FMT o con actividad FMT existente o autóctona reducida, dicho método comprende

(a) para el propósito de producir una planta capaz de sintetizar FMT, transformar en forma estable una célula de una planta adecuada con una molécula de ácido nucleico bajo condiciones que permiten la expresión eventual de dicha secuencia de ácidos nucleicos, regenerar una planta transgénica a partir de la célula y cultivar dicha planta transgénica durante un periodo y bajo condiciones suficientes para permitir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos,

(b) para el propósito de producir una planta con actividad FMT existente o autóctona reducida, transformar en forma estable una célula de una planta adecuada con una molécula de ácido nucleico, regenerar una planta transgénica a

partir de la célula y cuando sea necesario cultivar dicha planta transgénica bajo condiciones suficientes para permitir la expresión del ácido nucleico o

(c) para el propósito de producir una planta con actividad FMT existente o autóctona reducida, alterar un FMT que codifica el gen a través de la modificación de las secuencias autóctonas por medio de recombinación homóloga de un ácido nucleico apropiadamente alterado introducido en la célula de planta, y regenerar la planta genéticamente modificada a partir de la célula; en donde dicho ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y en donde la planta exhibe preferiblemente inflorescencia alterada.

12. Un método para producir una planta genéticamente modificada con niveles alterados de FMT codificado en una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, dicho método comprende introducir en una célula o células de dicha planta una secuencia genética seleccionada de:

(i) una secuencia anticodificante para mARN FMT;

(ii) una secuencia codificante para ADN FMT; y/o

(iii) una secuencia que induce ARNi específica para mARN FMT; y regenerar una planta genéticamente modificada de dicha célula, en donde la planta exhibe preferiblemente inflorescencia alterada.

13. Un método para producir una planta transgénica capaz de expresar un gen recombinante que codifica un FMT o parte de la misma o que lleva una secuencia de ácidos nucleicos que es sustancialmente complementaria a toda o una parte de una molécula de mARN opcionalmente transcribible cuando se requiere para efectuar la regulación de un FMT, dicho método comprende transformar en forma estable una célula de una planta adecuada con la molécula de ácido nucleico aislada como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, cuando sea necesario bajo condiciones que permiten la expresión eventual de dicha molécula de ácido nucleico aislada, y regenerar una planta transgénica a partir de la célula, en donde la planta exhibe preferiblemente inflorescencia alterada.

14. Una oligosecuencia de nucleótidos aislada establecida en la SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10º SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31.

15. Un FMT recombinante aislado codificado por una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

16. El FMT recombinante aislado de la reivindicación 15 en donde el FMT recombinante es una molécula de fusión que comprende dos o más secuencias de aminoácido heterólogas.

17. Una molécula de ácido nucleico de FMT recombinante aislado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende una fusión de dos o más secuencias de nucleótidos heterólogas.

18. Un organismo procariótico o eucariótico que lleva una secuencia genética que codifica una molécula FMT de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 extracromosómicamente en forma de plásmido.

19. Uso de una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la fabricación de una planta genéticamente modificada en donde la planta genéticamente modificada exhibe flores alteradas o inflorescencia.

Figura 1a Figura 1b

Replicón: pCGP3254 PstI ~20.9kb

Figura 24

Clase OMT

CONTINUACIÓN