PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y USOS DE VESÍCULAS DE MEMBRANA PLASMÁTICA EXTRAÍDAS DE PLANTAS ENRIQUECIDAS EN PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS DE MEMBRANA.

Procedimiento de obtención y usos de vesículas de membrana plasmática extraídas de plantas enriquecidas en proteínas transportadoras de membrana.

La presente invención se refiere a un método de obtención de vesículas de membrana enriquecidas en proteínas transportadoras de membrana de origen vegetal para su uso cosmético o terapéutico, que pueden contener a su vez otras sustancias como son compuestos bioactivos naturales. Preferiblemente se obtienen en vegetales, a partir de la familia Brassicaceae (crucíferas). Además, la presente invención también se refiere a un procedimiento para el incremento de estas proteínas de origen vegetal.

Procedimiento de obtención y usos de vesículas de membrana plasmática extraídas de plantas enriquecidas en proteínas transportadoras de membrana SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se enmarca dentro de los sectores de química y farmacia, y concretamente se refiere a vesículas de membrana plasmática de origen natural enriquecidas en proteínas intrínsecas de membrana capaces de ser aplicadas con fines dermatológicos, farmacológicos o terapéuticos.

ESTADO DE LA TÉCNICA

En células animales, las proteínas de membrana plasmática (MP) representan un punto estratégico para una posible intervención terapéutica, haciendo de las proteínas de membrana objetivos diana para fármacos, en investigación contra el cáncer, por ejemplo (Harvey et al., 2001) . En células vegetales, los procesos de señalización que controlan las respuestas a estreses abióticos y bióticos ocurren también a nivel de MP. De hecho, tanto en células animales como vegetales, la MP controla numerosas funciones primarias tales como el transporte de metabolitos e iones, endocitosis, proliferación celular ....etc. Todos estos procesos implican una gran diversidad de proteínas altamente variables en cuanto a estructura y función.

Esta enorme variabilidad en la naturaleza de las proteínas de membrana, ha hecho que el número de procesos de extracción de las mismas sea a la vez extenso y específico. Así, además del amplio rango de pesos moleculares y puntos isoeléctricos, las proteínas difieren en su naturaleza hidrofóbica, en el caso de proteínas intrínsecas, y en la variabilidad de su contenido de lípidos, lo que hace que no siempre sean fáciles de extraer y purificar, especialmente proteínas con varios dominios transmembrana inmersos en la fase lipídica de la membrana.

Por tanto, el uso de vesículas de membrana que contengan una proteína de interés capaz de mantener su funcionalidad y propiedades, puede suponer una ventaja adicional en cuanto a su estabilidad y el coste económico de su obtención.

Los movimientos de casi todos los solutos a través de la membrana están mediados por proteínas transportadoras de membrana, más o menos especializadas en el transporte de moléculas concretaS. Puesto que la diversidad y fisiología de las distintas células de un organismo está relacionada en buena medida con su capacidad de captar unos u otros elementos externos, se postula que debe existir un acervo de proteínas transportadoras específico para cada tipo celular y para cada momento fisiológico determinado (Lodish et al., 2005) ; dicha expresión diferencial se encuentra regulada mediante: la transcripción diferencial de los genes codificantes para esas proteínas y su traducción.

Se trata de proteínas transmembrana que poseen multitud de hélices alfa inmersas en la matriz lipídica. Dicha estructura probablemente implique una vía de entrada a través de entornos hidrofílicos proteicos que causarían una disrupción en el medio altamente hidrofóbico constituido por los lípidos (Lodish et al., 2005) . Las proteínas intervienen de diversas formas en el transporte: actúan tanto como bombas impulsadas por ATP, esto es, por energía metabólica, o como canales de difusión facilitada.

Algunas de estas proteínas son capaces de transportar agua, iones y pequeños solutos a su través, tales como glicerol y urea, ambos agentes higroscópicos ampliamente usados en cosmética.

Un problema adicional en la extracción de proteínas integrales de membrana es el hecho de que éstas son constituyentes minoritarios comparado con otras proteínas solubles celulares. Hasta la fecha se ha conseguido extraer estas proteínas funcionales cuando se encuentran insertadas en la bicapa lipídica. Se ha conseguido obtener proteínas hidrofóbicas de las fracciones de membrana plasmática con un mayor rendimiento modificando el método de extracción (Gerbeau et al., 2002) . Sin embargo, un método estimulador (también denominado "elicitador") de las proteínas intrínsecas combinado con un adecuado protocolo de extracción de vesículas de membrana plasmática, incrementa el rendimiento de vesículas que contienen proteínas de membrana de origen vegetal.

Durante mucho tiempo los liposomas se han considerado como la mayor contribución innovadora en dermatología con fines farmacéuticos y cosméticos. Sin embargo, debido a su alto coste, la pureza variable de sus fosfolípidos y su naturaleza inestable, los surfactantes que contengan vesículas suponen una ventajosa alternativa. Además, estas vesículas contienen proteínas de membrana intrínsecas capaces de actuar como transportadores de ciertas sustancias.

Algunas de las sustancias terapéuticas y cosméticas que se han empleado en sistemas transportadores son:

Nombre del agente terapéutico Categoría Terapéutica Referencia Levonorgestrel Agente anticonceptivo Jain NK et al., 1998

Flurbiprofeno Antiinflamatorio no esteroideo Mokhtar et al., 2008 (AINE)

Captopril Anti-hipertensivo Gupta et al., 2007

Estradiol Hormona femenina Tsai et al., 2001

Ketorolaco trometamina AINE AIsarra et al., 2005

Furosemida Diurético Azeem et al., 2008

Losartán potásico Antihipertensivo Thakur et al., 2009

Maleato de clorfenÍramina Antihistamínico Varshosaz et al., 2005

Pseudo-ceramida Antiarrugas Iwai et al., 1998

Benzofenona-4 / Metoxicinamato de Agente protector solar Brinon et al., 1999 octilo Vitamina A Antioxidante Cioca et al., 1991

La extracción de vesículas de membrana se obtiene mediante el sistema de polímeros de dos fases (Larsson et al., 1987) que consigue separar la fracción de membrana plasmática del resto de fracción microsomal. Para ello, se procede a la homogenización en frío del tejido y separación en dextrano/polietilénglicol.

Se han empleado hidrolizados peptídicos de origen vegetal: Brassica napus (FR2925325) , Triticum monoccocum (FR2925327) , Zea mays L. (FR2925326) , Triticum turgidum (FR2925328) , Solanum tuberosum (FR2925330) , Avena sativa L. (FR2925329) , Vicia faba L. (FR2925331) , capaces de activar la síntesis de acuaporinas presentes en la epidermis humana (AQP3 fundamentalmente) , bien solos o en combinación con otros ingredientes activos. AQP3 está presente en la membrana plasmática de los queratinocitos de la epidermis (Sougrat et al., 2002) y desempeña un importante papel en el control del flujo de agua a través de la piel. Así, estas acuaporinas son capaces de transportar glicerol el cual a su vez está involucrado en la constitución de la película hidrolipídica que permite mantener la flexibilidad y cualidades sensoriales del estrato córneo. La hidratación y el contenido de AQP3 en queratinocitos están relacionados y un incremento de AQP3 en la piel supone una mejora de la hidratación de la epidermis (Dumas et al., 2007) .

Sin embargo, el reciente descubrimiento de que células del carcinoma de piel en humanos sobre-expresan altamente acuaporinas AQP3 (Hara-Chikuma and Verkman 2008b) sugiere ser cautos en el uso de moduladores de la expresión de acuaporinas para promover la hidratación de la piel.

Una alternativa al empleo de ingredientes capaces de activar la síntesis de acuaporinas sería el uso de vesículas de origen natural enriquecidas en no sólo en acuaporinas sino en otras proteínas de membrana que se emplearían como vehículo lipídico en la liberación de agua u otras sustancias en la epidermis.

Las acuaporinas también se han incorporado en formulaciones cosméticas (FR20010013463) , determinando la fórmula galénica de uso tópico en forma de solución acuosa u oleosa. Sin embargo, el uso de vesículas de membrana de origen natural (vegetal) que incluyan además de estas otras proteínas transportadoras de membrana y compuestos bioactivos o agentes hidratantes, no se ha incluido en dicha formulación, y que constituye la base de esta invención.

La familia Brassicaceae (también llamada Cruciferae o familia de las crucíferas) contiene hasta 3500 especies vegetales. Numerosos estudios epidemiológicos indican que las crucíferas entre ellas el brócoli (Brassica oleracea) , son una fuente rica de compuestos bioactivos del metabolismo secundario ricos en nitrógeno-azufre, glucosinolatos, así como de antioxidantes naturales fenólicos (flavonoides, antocianos, ácidos fenólicos) , vitaminas (C, E, A, K, etc.) y minerales esenciales (nitrógeno, fósforo, potasio, calcio, hierro, manganeso, magnesIO, ZInC, cobre, selenio etc.) (Fahey et al. 2001; Moreno et al. 2006)

Los componentes vegetales se emplean también en la industria cosmética, por ejemplo, el empleo de extractos de brotes o germinados de diferentes frutos, bayas y crucíferas, incluyendo el brócoli,...

1. Procedimiento de obtención de vesículas de membrana plasmática de origen vegetal enriquecidas en proteínas transportadoras intrínsecas de membrana caracterizado porque comprende:

a. una primera etapa de estimulación para incrementar las proteínas de membrana en una planta de una especie del género Brassica, que comprende:

a.J. aplicar un glucosinolato a la planta,

a.2. variar la conductividad eléctrica del agua de riego de la planta hasta conseguir un valor comprendido entre 0, 5 y 6 dS mol, para someter a dicha planta a un proceso de estrés abiótico, y que comprende:

a.2.J. adicionar al agua de riego una sustancia de choque osmótico seleccionada entre NaCI y KCI en concentración milimolar, y

a.2. 2. variar la temperatura del agua de riego entre O y 10°C con respecto a la temperatura ambiental media de 25 oC;

b. una segunda etapa de extracción de vesículas de membrana que comprende:

b.J. homogeneizar la planta estimulada en la primera etapa, o una parte de la misma, con un homogeneizador mecánico automático,

b.2. extraer vesículas de membrana mediante un sistema de polímeros de dos fases,

b.3. resuspender las vesículas extraídas en un tampón de conservación seleccionado entre tampón fosfato, tampón bicarbonato y tampón acetato.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la sustancia de choque osmótico se adiciona en la disolución de riego hasta alcanzar una concentración comprendida entre 10 Y 80 mM, incluidos ambos límites.

3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el glucosinolato se aplica durante un tiempo comprendido entre 1 y 78 horas, incluidos ambos límites.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el glucosinolato se aplica en la disolución de riego en concentraciones comprendidas entre 5 y 1 00 ~M, incluidos ambos límites.

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la planta es una variedad de Brassica oleracea.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque en la segunda etapa, las vesículas de membrana se extraen de una parte del organismo vegetal seleccionada entre raíz, tallo, hojas, inflorescencia, o la combinación de al menos dos de estas partes.

7. Vesícula obtenible mediante el procedimiento descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Uso de una vesícula definida en la reivindicación 7 con fines dermatológicos, farmacológicos o terapéuticos, donde dicha vesícula comprende una cantidad efectiva de proteínas transportadoras de membrana.

9. Uso de la vesícula según la reivindicación 8, donde dicha vesícula comprende además sustancias adicionales capaces de ser aplicadas con fines dermatológicos, farmacológicos o terapéuticos, donde dicha sustancia adicional está seleccionada entre al menos un compuesto bioactivo natural, un agente higroscópico, un agente químico y combinaciones de ellos.