POLIPEPTIDOS ESTIMULANTES DEL CRECIMIENTO PARA USO EN PECES Y CRUSTACEOS.
La presente invención está relacionada con polipéptidos que muestran una actividad superior a la hormona de crecimiento de tilapia.
Estos polipéptidos son capaces de estimular el crecimiento, lasobrevida y calidad de las larvas de peces y crustáceos. Además,incrementan la defensa del organismo contra agentes patógenos y estimulan parámetros relacionados con el sistema inmune de organismos acuáticos. Los genes que codifican para dichos polipéptidos fueron clonados en un vector de expresión en Pichia pastoris que permite la obtención de la proteína de forma extracelular. El sobrenadante de cultivo que contiene los polipéptidos de interés fueadministrado por baños de inmersión o como suplemento en el pienso a organismos acuáticos
Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W06000006CU.
Solicitante: CENTRO DE INGENIERIA GENETICA Y BIOTECNOLOGIA (CIGB).
Nacionalidad solicitante: Cuba.
Dirección: AVENIDA 31 ENTRE 158 Y 190, CUBANACAN PLAYA,CIUDAD DE LA HABANA 10600.
Inventor/es: ESTRADA GARCIA, MARIO PABLO, ACOSTA ALBA,JANNEL, CARPIO GONZALEZ,YAMILA, MORALES FERNANDEZ,REYNOLD.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 12 de Agosto de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A23K1/16G
- A23K1/18S
- C07K14/46A
- C07K14/61 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Hormona del crecimiento (GH) (Somatotropina).
- C12N15/81 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para levaduras.
Clasificación PCT:
- A23K1/165
- C07K14/46 C07K 14/00 […] › de vertebrados.
- C07K14/61 C07K 14/00 […] › Hormona del crecimiento (GH) (Somatotropina).
- C12P21/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
Fragmento de la descripción:
Polipéptidos estimulantes del crecimiento para uso en peces y crustáceos.
Campo técnico
La presente invención se refiere al campo de la biotecnología acuática, en particular a polipéptidos con una mayor actividad en comparación con la hormona de crecimiento de tilapia, y al uso de estos polipéptidos para aumentar la supervivencia y calidad de larvas tratadas por inmersión o como aditivo alimentario.
Técnica anterior
La búsqueda de agentes que promueven el crecimiento en organismos acuáticos ha sido un centro de atención para varios laboratorios de investigación. La hormona de crecimiento (GH) ha sido el objeto principal de esta investigación.
Se ha informado de la presencia de GH en mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces. La GH o somatotropina es un polipéptido sintetizado y secretado por los somatotrofos de la hipófisis anterior en respuesta a péptidos hipotalámicos (Barinaga M., y col. (1985) Independent effects of growth hormone releasing factor on growth hormone release and gene transcription. Nature 314: 279-281). La GH está implicada en la regulación del crecimiento, el desarrollo, el metabolismo, el apetito y la osmorregulación en peces (Donaldson E. M., y col. (1979) Hormonal enhancement of growth. Fish Physiol. 8: 455-597). Aparte de sus efectos anabólicos sobre el crecimiento somático postnatal, en peces también tiene efecto sobre las células del sistema inmune. La GH promueve la proliferación de células T. Está bien documentada su actividad receptora de antígenos y su papel como coestimulador en la maduración de linfocitos (Harris H. y Bird D. J. (1997) The effects of a-MSH and MCH on the proliferations of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) lymphocytes in vitro. En: Kawashima, S., Kikuyama, S., (Eds), Advances in Comparative Endocrinology. Monduzzi Editoire, Bologn págs. 1023-1026a).
Es muy interesante su similitud estructural con varias citocinas tales como: IL-2, IL-4, IL-5, el factor estimulante de colonias de granulocitos, el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos e interferón (Sprang S. R. y Bazan J. F. (1993) Cytokine structural taxonomy and mechanisms of receptor engagement. Curr. Opin. Struc. Biol. 3: 815-827).
En mamíferos, la GH estimula la fagocitosis, la maduración y la diferenciación de timocitos (Ortega E., y col. (1996) Effects of prolactin on the in vitro phagocytic capacity of macrophages. Comp. Immunol. Immunopathol. 61: 389-393) y la apoptosis de células productoras de células T (Murphy W. J. y Longo D. L. (2000) Growth hormone as an immunodulating therapeutic agent. Immunol. Today 121: 211-213). De forma similar, se ha estudiado el efecto de GH como estimuladora de la linfopoyesis y la fagocitosis en Sparus aurata y Sparus sarba junto con la mitogénesis de los leucocitos en O. keta (Sakai M., y col (1996) Increase in Haemolytic activity of serum from rainbow trout Oncorhyncus mykiss injected with exogenous growth hormone. Fish Shellfish Immunol. 6: 615-617), la fagocitosis, la activación de células NK, la producción de anticuerpos, la actividad hemolítica del complemento en Oncorhynchus mykiss (Yada T., y col. (1999) Effects of prolactin and growth hormone on plasma immunoglobulin M levels of hipophysectomized rainbow trout, Oncorhyncus mykiss. Gen. Comp. Endocrinol. 115: 46-52) y el estallido respiratorio de leucocitos en trucha arco iris (Oncorhyncus mykiss) y Dicentrarchus labrax (Muñoz P., y col. (1998) Modulation of the respiratory burst activity of Mediterranean sea bass (Dicentrarchus labrax L.) phagocytes by growth hormone and parasitic status. Fish Shellfish Immunol. 8: 25-36).
Se ha demostrado el aumento en los niveles plasmáticos de GH como resultado de la transferencia de Salmo trutta de agua dulce a agua salada, acompañado de niveles reducidos de hormonas tiroideas en correlación con un aumento en la actividad fagocítica de los leucocitos de pronefros y un aumento en la concentración de lisozima plasmática. Algunos estudios señalaron la expresión de receptores de GH y receptores de IGF específicos en linfocitos (Tapson V. F., y col. (1988) Structural and functional characterization of the human T lymphocite receptor for insulin-like growth factor I in vitro. Clin, C. Invest. 82: 950-957). Se ha demostrado el efecto in vitro del IGF-I en la proliferación de células T. Se conoce bien el efecto inductor de IGF-I sobre células B, inmunoglobulina y células plasmáticas. Las células B muestran el mayor nivel de expresión de receptor de GH (Badolato R., y col. (1994) Differential expression of surface membrane growth hormone receptor on human peripheral blood lymphocytes detected by dual fluorochrome flow cytometry. J Clin Endocrinol Metab. 79: 984-990).
La GH puede afectar a linfocitos B y T indirectamente a través de su efecto activador sobre macrófagos y monocitos (Edwards C. K., y col. (1988) A newly defined property of somatotropin: priming of macrophages for production of superoxide anion. Science 239: 769-771). En los últimos también promueve la quimiotaxis. Estas células también actúan sobre los linfocitos por secreción de citocinas. La GH revierte la deficiencia de células NK (Davila D. R., y col. (1987) Role of growth hormone in regulating T-dependent immune events in aged, nude, and transgenic rodents, Neurosci. Res. 18: 108-116).
El ADN complementario de varias hormonas de crecimiento de peces se ha clonado y secuenciado. Se ha demostrado el efecto potente de la GH recombinante sobre el crecimiento en peces por inyección (Tsai H. J., y col. (1993) Expression of rainbow trout growth hormone cDNA in yeast. Bull. Inst. Zool. Acad. Sin. 32: 162-170) o por inmersión (Moriyama S. y Kawauchi H. (1990) Growth stimulation of juvenile salmonids by immersion in recombinant salmon growth hormone. Nippon Suisan Gakkaishi 56: 31-34). El documento EP0387457 describe las proteínas hormonales de la hipófisis prolactina y hormonas de crecimiento de peces de agua caliente producidas por microorganismos.
La GH humana existe como un grupo heterogéneo de proteínas estructuralmente relacionadas que pueden encontrarse en la glándula hipofisaria (Baumann G., y col. (1983) The molecular nature of circulating growth hormone in normal and acromegalic man: evidence for a principal and minor monomeric forms, J. Clin. Endocrinol. Metab. 56: 946-952), plasma (Bauman G., y col. (1985) Molecular forms of circulating growth hormone during spontaneous secretory episodes and in the basal state. J. Clin. Endocrinol. Metab. 60: 1216-1220) y orina (Baumann G. y Abramson E. C. (1983) Urinary growth hormone in man: evidence for multiple molecular forms. Endocrinology 56: 305-311). La variante predominante de la GH humana es un polipéptido de 22 kDa compuesto por una cadena polipeptídica única. Este polipéptido constituye el 85% de las GH humanas inmunorreactivas (Lewis U. J., y col. (1994) Variant forms and fragments of human growth hormone in serum. Acta Paediatr. Suppl. 399: 29-31). Otras variantes de GH humana comprenden un polipéptido con una sola cadena polipeptídica con un peso molecular de 20 kDa (Lewis U. J., y col. (1978) A naturally occurring structural variant of human growth hormone J. Biol. Chem. 253: 2679-2687), formas de 22 kDa acetiladas y desaminadas (Lewis U. J., y col. (1981) Altered proteolytic cleavage of human growth hormone as a result of deamidation. J. Biol. Chem. 256: 11645-11650) y una variante truncada que es el resultado de la escisión proteolítica que tiene dos cadenas polipeptídicas conectadas por un enlace disulfuro (Singh R. N. y col. (1974) Modified forms of human growth hormone with increased biological activities. Endocrinology 94: 883-891). Varios estudios demostraron que la última variante es la más activa. Esta molécula es el resultado de digestiones con proteinasas entre los aminoácidos 134 y 150 de la hGH de 22 kDa (Wroblewski V. J., y col. (1991) Proteolytic cleavage of human growth hormone (hGH) by rat tissues in vitro: influence on the kinetics of exogenously administered hGH. Endocrinology 129: 465-474). Se ha sugerido que la actividad biológica aumentada de esta variante truncada se debe a su estabilidad aumentada y al hecho de que tiene una tasa de aclaramiento metabólico inferior que las otras (Baumann G. (1979) Metabolic clearance rates of isohormones of human growth hormone in man. J. Clin. Endocrinol. Metab. 49: 495-499).
El desarrollo de la tecnología de ADN recombinante permite el uso de bacterias y levaduras como sistemas huéspedes para la producción de proteínas de interés en un procedimiento relativamente económico. La levadura Pichia...
Reivindicaciones:
1. Un polipéptido caracterizado porque su cadena polipeptídica consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de la secuencia con la SEC ID Nº: 7 o SEC ID Nº: 8.
2. Un procedimiento para producir el polipéptido de la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido se expresa extracelularmente en Pichia pastoris.
3. Una composición que comprende cualquiera de los polipéptidos definidos en la reivindicación 1 para estimular el crecimiento en peces y crustáceos.
4. El uso de sobrenadantes de cultivo de Pichia pastoris que contienen los polipéptidos descritos en la reivindicación 1, en formulaciones de pienso para estimular el crecimiento y/o la resistencia a enfermedades en peces y crustáceos a una dosis tan eficaz como de 4,8 mg del polipéptido/kg de pienso.
5. El uso de sobrenadantes de cultivo de Pichia pastoris que contienen los polipéptidos descritos en la reivindicación 1 para los tratamientos de inmersión en peces y crustáceos para estimular el crecimiento, la supervivencia y la calidad de las larvas en una concentración entre 0,05 y 0,5 mg del polipéptido/litro de agua.
6. Una composición que comprende cualquiera de los polipéptidos de la reivindicación 1 para estimular el sistema inmune humoral innato de los peces y crustáceos.
7. Una composición que comprende cualquiera de los polipéptidos definidos en la reivindicación 1 para el tratamiento de peces ornamentales.
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