METODO DE SECRECION Y DE PRODUCCION DE PROTEINAS.
Un método para producir una proteína heteróloga, que comprende cultivar Corynebacterium glutamicum AJ12036 (FERM BP-734) o una mutante que puede obtenerse a partir de AJ12036 (FERM BP-734),
que tiene la capacidad de secretar la proteína heteróloga en al menos el doble de la cantidad secretada por la Corynebacterium glutamicum ATCC13869 de tipo salvaje, que tiene una construcción de expresión genética en la que una secuencia de ácido nucleico que codifica una región del péptido señal, que funciona en una bacteria corineforme y que puede obtenerse a partir de una bacteria corineforme, está conectada al lado 3` de una secuencia promotora que funciona en una bacteria corineforme y una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga está conectada al lado 3` de dicha secuencia de ácido nucleico que codifica dicha región del péptido señal, permitiendo que dicha bacteria corineforme produzca dicha proteína heteróloga, y recuperar dicha proteína heteróloga producida
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP02/02978.
Solicitante: AJINOMOTO CO., INC..
Nacionalidad solicitante: Japón.
Dirección: 15-1 KYOBASHI 1-CHOME, CHUO-KU,TOKYO 104-0031.
Inventor/es: KIKUCHI,YOSHIMI,FERMENTATION & BIOTECH. LAB, DATE,MASAYO,FERMENTATION & BIOTECH. LAB, UMEZAWA,YUKIKO,FERMENTATION & BIOTECH. LAB, YOKOYAMA,KEIICHI,FERMENTATION & BIOTECH. LAB, HEIMA,HARUO,FERMENTATION & BIOTECH. LAB, MATSUI,HIROSHI,FERMENTATION & BIOTECH. LAB.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 4 de Noviembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/195 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de origen bacteriano.
- C07K14/34 C07K 14/00 […] › de Corynebacterium (G).
- C07K14/36 C07K 14/00 […] › de Actinomyces; de Streptomyces (G).
- C07K5/10A2
- C12N15/77 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para Corynebacterium; para Brevibacterium.
Clasificación PCT:
- C07K19/00 C07K […] › Péptidos híbridos (Inmoglobulinas híbridas compuestas solamente de inmoglobulinas C07K 16/46).
- C07K7/08 C07K […] › C07K 7/00 Péptidos con 5 a 20 aminoácidos en una secuencia totalmente determinada; Sus derivados. › con 12 a 20 aminoácidos.
- C12N15/21 C12N 15/00 […] › alfa-interferones.
- C12P21/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
Clasificación antigua:
- C07K19/00 C07K […] › Péptidos híbridos (Inmoglobulinas híbridas compuestas solamente de inmoglobulinas C07K 16/46).
- C07K7/08 C07K 7/00 […] › con 12 a 20 aminoácidos.
- C12N15/21 C12N 15/00 […] › alfa-interferones.
- C12P21/02 C12P 21/00 […] › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
Fragmento de la descripción:
Método de secreción y de producción de proteínas.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a un método para producir eficientemente una proteína heteróloga por producción secretora.
Previamente se ha informado sobre una cantidad de métodos para la producción secretora de proteínas heterólogas, tales como los descritos en la revisión sobre la producción secretora de una proteína heteróloga por parte de una bacteria perteneciente al género Bacillus [Microbial. Rev., 57, 109-137 (1993)], en la revisión sobre la producción secretora de una proteína heteróloga por parte de la levadura metilotrófica Pichia pastoris [Biotechnol., 11, 905-910 (1993)], y en el informe sobre la producción industrial de proteínas heterólogas por parte del moho perteneciente al género Aspergillus [Biotechnol., 6, 1419-1422 (1988); Biotechnol., 9, 976-981 (1991)].
La transglutaminasa producida por la producción secretora de acuerdo con una realización de la presente invención es una enzima que cataliza la reacción de transferencia de acilos de los grupos ?-carboxilamida de la cadena peptídica de la proteína. Cuando la enzima se hace reaccionar con una proteína, puede ocurrir la formación del enlace cruzado
Las transglutaminasas obtenidas a partir de animales y de microorganismos (transglutaminasa microbiana: denominada de aquí en más MTG
) se han conocido con anterioridad. La primera es una enzima dependiente del ion calcio que está distribuida en órganos de animales, piel, sangre, etc. Los ejemplos incluyen transglutaminasa hepática de cobayo (K. Ikura et al. Biochemistry 27, 2898 (1988)), transglutaminasa de queratinocitos epidérmicos humanos (M. A. Phillips et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9333 (1990)), factor XIII de coagulación sanguínea humano (A. Ichinose et al. Biochemistry 25, 6900 (1990)) y otros.
En cuanto a la segunda, se han descubierto transglutaminasas independientes del calcio de bacterias pertenecientes al género Streptoverticillium, que incluyen, por ejemplo, Streptoverticillium griseocarneum IFO 12776, Streptoverticillium cinnamoneum sub-especie cinnamoneum (de aquí en más puede abreviarse S. cinnamoneum) IFO 12852, Streptoverticillium mobaraense (de aquí en más puede abreviarse S. mobaraense) IFO 13819 y otras (Publicación de Solicitud de Patente japonesa no examinada (JP-Kokai Núm. 64-27471)). El mapeo peptídico y el análisis estructural de los genes reveló que la estructura principal de la transglutaminasa producida por estos microorganismos no compartió homología alguna con las transglutaminasas de origen animal (Publicación de Solicitud de Patente europea Núm. 0 481 504 A1).
Dado que las transglutaminasas obtenidas a partir de microorganismos (MTG) se producen a través de la purificación de los cultivos de microorganismos tales como los descritos con anterioridad, han existido problemas en términos de cantidad, eficiencia y similares. También se ha intentado la producción de transglutaminasa utilizando procedimientos de manipulación genética. Las proteínas transglutaminasas y sus genes han sido informados, por ejemplo, en Biosci. Biotechnol. Biochem., 58, 82-87 (1994), Biosci. Biotechnol. Biochem, 58, 88-92 (1994), Biochimie, 80, 313-319 (1998), Eur. J. Biochem., 257, 570-576 (1998), WO 96/06931, WO 96/22366, etc., que reportan la expresión y producción de transglutaminasa en sistemas de hospedante-vector tales como Streptomyces lividans, Aspergillus oryzae y Escherichia coli. Además de esta información, se ha informado un método en el que se produce una transglutaminasa por producción secretora en microorganismos tales como E. coli y levadura (JP-Kokai Núm. 5-199.883) y se ha informado un método en el que se produce MGT activa expresando MTG como una proteína fusionada inactiva en un cuerpo de inclusión dentro de E. coli y solubilizando posteriormente el cuerpo de inclusión empleando agentes desnaturalizantes de proteínas y reconstituyéndolo después por eliminación de los agentes desnaturalizantes (JP-Kokai No. 6-30771). Sin embargo, se ha evidenciado el problema de que el nivel de expresión es significativamente bajo en la producción secretora de microorganismos tales como E. coli o levaduras.
Por otra parte, existen ejemplos de estudios previos para la producción secretora eficiente de proteínas heterólogas utilizando una bacteria corineforme, que incluyen la secreción de nucleasas y lipasas [US4965197, J. Bacteriol., 174, 1854-1861 (1992)] y la secreción de proteasas tales como subtilisina [Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613 (1995)] por parte de Corynebacterium glutamicum (de aquí en más puede abreviarse C. glutamicum), un estudio sobre la secreción de proteínas de superficie celular de una bacteria corineforme [Solicitud de Patente Internacional publicada en Japón No. 6-502.548], la secreción de una proteína de unión a fibronectina que utiliza este estudio [Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400 (1997)], un informe en el que se aumentó la secreción de proteínas utilizando una maquinaria secretora mutada [JP-Kokai Núm. 11-169182], etc., pero ha habido una cantidad limitada de informes sobre proteínas limitadas. A la luz de la cantidad acumulada de proteínas, se describe en Appl. Environ. Microbiol., 61, 1610-1613 (1995) que se acumularon aproximadamente 2,5 mg/ml de proteína por expresión del gen de la proteasa alcalina de Dichelobacter nodosus en C. glutamicum utilizando un promotor del gen (aprE) de subtilisina de Bacillus subtilis, un sitio de unión al ribosoma y la secuencia de un péptido señal, pero en US4965197, JP-Kokai No. 6-502548 y JP-Kokai No. 11-169182 no se describen específicamente los valores de la cantidad de proteínas secretadas y acumuladas. Además, en el caso de la proteína de unión a fibronectina [Appl. Environ. Microbiol., 63, 4392-4400 (1997)], sólo se confirma la acumulación secretora de la proteína de aproximadamente 2,5 µg/l. Por lo tanto, no ha habido informes de que pudieran acumularse eficientemente proteínas heterólogas en el medio a un nivel práctico.
Además, se ha desarrollado una tecnología de ingeniería genética para una bacteria corineforme en el sistema que utiliza plásmido y fago, tal como el establecimiento de la transformación por protoplasto [J. Bacteriol., 159, 306-311 (1984); J. Bacteriol., 161, 463-467 (1985)], el desarrollo de un tipo diferente de vectores [Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984); J. Bacteriol., 159, 306-311 (1984); J. Gen. Microbiol., 130, 2237-2246 (1984); Gene, 47, 301-306 (1986); Appl. Microbiol. Biotechnol., 31, 65-69 (1989)], el desarrollo del método de regulación de la expresión genética [Bio/Technology, 6, 428-430 (1998)] y el desarrollo de un cósmido [Gene, 39, 281-286 (1985)]. Además, existen informes sobre la clonación de genes de una bacteria corineforme [Nucleic Acids Res., 14, 10113-1011 (1986); J. Bacteriol., 167, 695-702 (1986); Nucleic Acids Res., 15, 10598 (1987); Nucleic Acids Res., 15, 3922 (1987); Nucleic Acids Res., 16, 9859 (1988); Agric. Biol. Chem., 52, 525-531 (1988); Mol. Microbiol., 2, 63-72 (1988); Mol. Gen. Genet., 218, 330-339 (1989); Gene, 77, 237-251 (1989)].
Además, se ha informado un elemento transposable obtenido a partir de una bacteria corineforme [WO 93/18.151; Ep 0.445.385; JP-Kokai No. 6-46.867; Mol. Microbiol., 11, 739-746 (1994); Mol. Microbiol., 14, 571-581 (1994); Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994); FEMS Microbiol. Lett., 126, 1-6 (1995); JP-Kokai No. 7-107976].
El elemento transposable es un fragmento de ADN que puede transposarse sobre el cromosoma y que es conocido por estar presente en una amplia variedad de organismos que oscilan de procariotas a eucariotas. Se han desarrollado transposones que utilizan elementos transposables [WO 93/18.151; JP-Kokai No. 7-107.976; Mol. Gen. Genet., 245, 397-405 (1994); JP-Kokai No. 9-70.291] y un gen heterólogo se ha vuelto capaz de ser expresado utilizando un transposón.
Compendio de la invención
Reivindicaciones:
1. Un método para producir una proteína heteróloga, que comprende cultivar Corynebacterium glutamicum AJ12036 (FERM BP-734) o una mutante que puede obtenerse a partir de AJ12036 (FERM BP-734), que tiene la capacidad de secretar la proteína heteróloga en al menos el doble de la cantidad secretada por la Corynebacterium glutamicum ATCC13869 de tipo salvaje, que tiene una construcción de expresión genética en la que una secuencia de ácido nucleico que codifica una región del péptido señal, que funciona en una bacteria corineforme y que puede obtenerse a partir de una bacteria corineforme, está conectada al lado 3` de una secuencia promotora que funciona en una bacteria corineforme y una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga está conectada al lado 3` de dicha secuencia de ácido nucleico que codifica dicha región del péptido señal, permitiendo que dicha bacteria corineforme produzca dicha proteína heteróloga, y recuperar dicha proteína heteróloga producida.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la bacteria corineforme mutante es una cepa mutante que no produce una proteína PS2 de superficie celular.
3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el péptido señal es un péptido señal de una proteína de superficie celular de una bacteria corineforme.
4. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que el péptido señal es un péptido señal de una proteína de la superficie celular de Corynebacterium glutamicum.
5. El método de la reivindicación 4, en el que el péptido señal tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2.
6. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que el péptido señal es un péptido señal de una proteína de superficie celular obtenida de Corynebacterium ammoniagenes.
7. El método de la reivindicación 6, en el que el péptido señal tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 3.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el cultivo de la bacteria corineforme mutante se realiza en un medio que contiene 2,25 mM o más de ion calcio.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el cultivo de la bacteria corineforme mutante se realiza controlando la concentración de oxígeno disuelto en 3% o menor.
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