MÉTODO PARA MEJORAR LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS.

Unidad de expresión de proteína que comprende funcionalmente unidos de 5' a 3':

i) un promotor, ii) un marco de lectura abierto que codifica para una proteína de interés y iii) una secuencia señal de terminación de la transcripción, caracterizada por que dicha unidad de expresión de proteína comprende además al menos una segunda secuencia señal de terminación de la transcripción ubicada en el sentido de 3' de dicho marco de lectura abierto, en la que dicha segunda secuencia señal de terminación de la transcripción está en orientación opuesta de la primera secuencia señal de terminación de la transcripción, y en la que dicha segunda secuencia señal de terminación de la transcripción se escoge de las secuencias presentadas en la tabla 1

Método para mejorar la producción de proteínas La invención se refiere a los campos de bioquímica, biología molecular y farmacología. Más específicamente la presente invención se refiere a la producción de proteínas en una célula (hospedadora) .

Las proteínas se producen en sistemas para una amplia gama de aplicaciones en biología y biotecnología. Estas incluyen investigación en la función celular y molecular, producción de proteínas como reactivos de diagnóstico o productos biofarmacéuticos y modificación de los caracteres o fenotipos de animales de ganado y cultivos. Los productos biofarmacéuticos son habitualmente proteínas que tienen una función extracelular, tales como anticuerpos para inmunoterapia u hormonas o citocinas para provocar una respuesta celular. Las proteínas con funciones extracelulares salen de la célula mediante la ruta secretora, y se someten a modificaciones tras la traducción durante la secreción (Chevet et al. 2001) . Las modificaciones (principalmente glicosilación y formación de enlaces disulfuro) no se producen en las bacterias. Además, los oligosacáridos específicos unidos a las proteínas mediante enzimas glicosilantes son específicos para el tipo de célula y especie. Estas consideraciones a menudo limitan la elección de células hospedadoras para la producción de proteínas heterólogas a células eucariotas (Kaufman, 2000) . Para la expresión de proteínas terapéuticas humanas, las células hospedadoras tales como bacterias, levaduras o plantas pueden ser inapropiadas. Incluso las diferencias sutiles en la glicosilación de proteínas entre roedores y seres humanos, por ejemplo, puede ser suficiente para hacer que las proteínas producidas en células de roedor sean inaceptables para uso terapéutico (Sheeley et al., 1997) . Las consecuencias de la glicosilación inapropiada (es decir no humana) incluyen inmunogenicidad, semivida funcional reducida y pérdida de actividad. Esto limita adicionalmente la elección de células hospedadoras, a líneas celulares humanas o a líneas celulares tales como células de ovario de hámster chino (CHO) , que pueden producir glicoproteínas con estructuras de hidratos de carbono similares a la humana (Liu, 1992) .

Algunas proteínas de interés biotecnológico son funcionales como multímeros, es decir consisten en dos o más cadenas de polipéptidos posiblemente diferentes en su forma biológica y/o biotecnológicamente activa, por ejemplo los anticuerpos (Wright y Morrison, 1997) . La producción de tales proteínas multiméricas en sistemas heterólogos es difícil técnicamente debido a varias limitaciones de los sistemas de expresión actuales. Estas limitaciones incluyen

(1) dificultades al aislar líneas celulares/células recombinantes que producen los polipéptidos monoméricos en niveles altos (previsibilidad y rendimiento) , y (2) disminuciones en los niveles de expresión durante el ciclo de producción industrial de las proteínas (estabilidad) . Estos problemas se describen en más detalle a continuación.

(1) Las proteínas recombinantes tales como los anticuerpos que se usan como compuestos terapéuticos necesitan producirse en grandes cantidades. Las células hospedadoras usadas para la producción de proteínas recombinantes deben ser compatibles con la escala de los procesos industriales que se emplean. Específicamente, el sistema de expresión del transgén (o el gen que codifica para una proteína de interés, los dos términos se usan intercambiablemente en el presente documento) usado para la proteína heteróloga necesita retenerse por las células hospedadoras en una forma activa y estable durante las fases de crecimiento de ampliación a escala y de producción. Esto se logra mediante la integración del transgén dentro del genoma de la célula hospedadora. Sin embargo, la creación de líneas celulares recombinantes mediante medios convencionales es un proceso ineficaz y costoso debido a la imprevisibilidad de la expresión transgénica entre las células hospedadoras recombinantes. La imprevisibilidad es producto de la alta probabilidad de que el transgén se vuelva inactivo debido al silenciamiento génico (McBurney et al., 2002) . Usando tecnologías convencionales, la proporción de células hospedadoras recombinantes que producen un polipéptido a niveles altos oscila entre el 1-2%. Con el fin de construir una línea celular que produce dos polipéptidos a niveles altos, los dos transgenes están integrados generalmente de manera independiente. Si los dos transgenes se transfectan simultáneamente en dos ácidos nucleicos separados, la proporción de células que producirán ambos polipéptidos en niveles altos será el producto aritmético de las proporciones para transgenes individuales. Por tanto la proporción de tales líneas celulares recombinantes oscila desde uno de cada 2.500 hasta uno de cada 10.000. Para proteínas multiméricas con tres o más subunidades, las proporciones disminuyen adicionalmente. Estas líneas celulares de alta producción deben identificarse y aislarse posteriormente del resto de la población. Los métodos requeridos para seleccionar estas líneas celulares de alta expresión poco comunes llevan mucho tiempo y son caros.

Una alternativa a la transfección simultánea de dos ácidos nucleicos que portan transgenes es la transfección secuencial. En este caso la proporción de clones de alto rendimiento será la suma de las proporciones para transgenes individuales, es decir el 2-4%. Sin embargo la transfección secuencial tiene desventajas (importantes) , incluyendo altos costes y mala estabilidad. Los altos costes resultan de diversos factores: en particular, el tiempo y los recursos requeridos para seleccionar líneas celulares de alta expresión se duplican, puesto que debe seleccionarse por separado la alta expresión de cada subunidad. La mala estabilidad global de células hospedadoras que expresan dos polipéptidos es una consecuencia de la inestabilidad inherente de cada uno de los dos transgenes.

(2) El silenciamiento de la expresión transgénica durante el cultivo de células hospedadoras prolongado es un fenómeno comúnmente observado. En células de vertebrados puede provocarse mediante la formación de heterocromatina en el locus del transgén, que previene la transcripción del transgén. El silenciamiento transgénico

es estocástico; puede producirse poco después de la integración del transgén en el genoma, o sólo tras varias divisiones celulares. Esto da como resultado poblaciones de células heterogéneas tras un cultivo prolongado, en las que algunas células continúan expresando niveles altos de proteína recombinante mientras que otras expresan niveles bajos o indetectables de la proteína (Martin y Whitelaw, 1996, McBurney et al., 2002) . Una línea celular que se usa para la producción de proteínas heterólogas se deriva de una única célula, sin embargo a menudo se aumenta la escala, y se mantiene durante periodos de tiempo largos, a densidades celulares de más de diez millones de células por mililitro en cultivadores de 1.000 litros o más. Estas poblaciones de células grandes (1014 -1016 células) son propensas a graves disminuciones en la productividad debido al silenciamiento transgénico (Migliaccio et al., 2000, Strutzenberger et al., 1999) .

La inestabilidad de la expresión de células hospedadoras recombinantes es particularmente grave cuando se amplifican los números de copias de transgenes en un intento por aumentar los rendimientos. La amplificación transgénica se logra por ejemplo incluyendo un gen de marcador seleccionable tal como dihidrofolato reductasa (DHFR) con el transgén durante la integración (Kaufman, 2000) . Concentraciones aumentadas del agente de selección (en el caso de DHFR, el fármaco metotrexato) seleccionado para células que han amplificado el número de genes DHFR en el cromosoma (Kaufinan y Sharp 1982) . Puesto que el transgén y DHFR están ubicados conjuntamente en el cromosoma, el número de copias del transgén también aumenta. Esto se correlaciona con un aumento en el rendimiento de la proteína heteróloga (Kaufman, 1990) . Sin embargo, las repeticiones en tándem de transgenes que resultan de la amplificación son sumamente susceptibles al silenciamiento (Garrick et al., 1998, Kaufman, 1990, McBurney et al., 2002) .

Existe por tanto una necesidad clara de una tecnología de expresión de proteínas (heterólogas) alternativa y específicamente un método de expresión de proteínas que supera los problemas explicados anteriormente. Se necesita aún más un sistema de expresión que i) proporcione alta previsibilidad de la expresión, permitiendo la expresión balanceada de múltiples cadenas, ii) proporcione altos rendimientos y, iii) proporcione... [Seguir leyendo]

1. Unidad de expresión de proteína que comprende funcionalmente unidos de 5' a 3': i) un promotor, ii) un marco de lectura abierto que codifica para una proteína de interés y iii) una secuencia señal de terminación de la transcripción, caracterizada por que dicha unidad de expresión de proteína comprende además al menos una segunda secuencia señal de terminación de la transcripción ubicada en el sentido de 3' de dicho marco de lectura abierto, en la que dicha segunda secuencia señal de terminación de la transcripción está en orientación opuesta de la primera secuencia señal de terminación de la transcripción, y en la que dicha segunda secuencia señal de terminación de la transcripción se escoge de las secuencias presentadas en la tabla 1.

2. Unidad de expresión de proteína según la reivindicación 1, comprendiendo además dicha unidad de expresión de proteína una tercera secuencia señal de terminación de la transcripción en el sentido de 5' de dicho promotor, en la que dicha segunda secuencia señal de terminación de la transcripción se escoge de las secuencias presentadas en la tabla 1.

3. Unidad de expresión de proteína según la reivindicación 1 ó 2, comprendiendo además dicha unidad de expresión de proteína al menos una secuencia anti-represora estabilizante (STAR) presentada en la tabla 2, escogida de STAR4, STAR6, STAR7, STAR12, STAR18, STAR35 y STAR40.

4. Unidad de expresión de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo además dicha unidad de expresión de proteína al menos dos secuencias anti-represoras estabilizantes (STAR) presentadas en la tabla 2, escogidas de STAR4, STAR6, STAR7, STAR12, STAR18, STAR35 y STAR40.

5. Unidad de expresión de proteína según la reivindicación 4, en la que dichas al menos dos secuencias STAR están dispuestas de manera que dichas secuencias STAR flanquean la combinación formada por dicho promotor, marco de lectura abierto y señal de terminación de la transcripción.

6. Unidad de expresión de proteína según la reivindicación 5, que comprende en el siguiente orden:

a) una secuencia señal de terminación de la transcripción, escogida de las secuencias presentadas en la tabla 1, b) una secuencia STAR, c) la combinación formada por dicho promotor, marco de lectura abierto y señal de terminación de la transcripción, d) una secuencia STAR, y e) una secuencia señal de terminación de la transcripción en orientación opuesta, escogida de las secuencias presentadas en la tabla 1.

7. Unidad de expresión de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha proteína de interés es una cadena de inmunoglobulina o una parte funcional, derivado y/o análogo de la misma.

8. Unidad de expresión de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo dicha unidad de expresión de proteína un gen monocistrónico que comprende funcionalmente unidos de 5' a 3': i) un promotor, ii) el marco de lectura abierto que codifica para dicha proteína de interés y iii) una señal de terminación de la transcripción.

9. Unidad de expresión de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, comprendiendo dicha unidad de expresión de proteína un gen bicistrónico que comprende funcionalmente unidos de 5' a 3': i) un promotor, ii) el marco de lectura abierto que codifica para dicha proteína de interés, iii) un marcador de selección y iv) una señal de terminación de la transcripción, y preferiblemente dicho gen bicistrónico comprende un sitio de iniciación de la traducción de proteínas con eficacia de traducción reducida ubicado en el sentido de 3' de dicho marco de lectura abierto.

10. Unidad de expresión de proteína según la reivindicación 9, en la que dicho sitio de iniciación de la traducción de proteínas con eficacia de traducción reducida comprende un sitio interno de entrada al ribosoma.

11. Método para la expresión de al menos una proteína de interés en una célula que comprende proporcionar a dicha célula al menos una unidad de expresión de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

12. Método según la reivindicación 11, que comprende además proporcionar a dicha célula una segunda

unidad de expresión de proteína.

13. Célula que comprende al menos una unidad de expresión de proteína según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

14. Célula según la reivindicación 13, que es una célula vegetal o una célula de mamífero.

15. Método para producir una proteína de interés que comprende cultivar una célula según la reivindicación 13 ó 14 y recoger dicha proteína de interés del cultivo correspondiente.

16. Método para identificar una secuencia señal de terminación de la transcripción que comprende

- proporcionar a una célula un ácido nucleico que comprende

- una secuencia promotora

una secuencia intermedia (IV) en el sentido de 3' de dicho promotor, que comprende una supuesta secuencia señal de terminación de la transcripción una secuencia cuyo producto es detectable y cuya secuencia se ubica en el sentido de 3' de dicha IV

- determinar la cantidad de dicho producto detectable y comparar dicha cantidad con la cantidad de

producto obtenido en una célula que está provista de un ácido nucleico de control sin dicha supuesta 15 secuencia señal de terminación de la transcripción.

17. Método según la reivindicación 16, en el que dicho ácido nucleico comprende además un marcador de selección ubicado fuera de la combinación de dicho promotor, IV, secuencia señal de terminación de la transcripción supuesta y dicha secuencia cuyo producto es detectable y que comprende además seleccionar una célula mediante dicho marcador de selección de dicho ácido nucleico, obteniendo de ese modo una célula que comprende dicho ácido nucleico.

18. Método según la reivindicación 16 ó 17, en el que dicha secuencia cuyo producto es detectable es un gen suicida, preferiblemente codA o codA::upp.