MAMIFERO NO HUMANO TRANSGENICO PARA LA REGION CONSTANTE DE LA CADENA PESADA DE LAS INMUNOGLOBULINAS HUMANAS DE CLASE A Y SUS APLICACIONES.

Mamífero no humano transgénico, caracterizado por que comprende un locus IgH modificado mediante sustitución de la secuencia de conmutación Sµ por todo o parte de un transgén constituido por el gen Ca de una inmunoglobulina humana de clase A que incluye al menos el exón que codifica el dominio CH3 y el exón de membrana

Mamífero no humano transgénico para la región constante de la cadena pesada de las inmunoglobulinas humanas de clase A y sus aplicaciones.

La presente invención se refiere a un mamífero no humano transgénico para la región constante de la cadena pesada de las inmunoglobulinas humanas de clase A y a sus aplicaciones para la producción de anticuerpos humanizados de clase IgA.

Las inmunoglobulinas A (IgA) comprenden dos cadenas pesadas idénticas, de isotipo a1 (subclase IgA1) o a2 (subclase IgA2) en el ser humano, asociadas por medio de puentes disulfuro, a dos cadenas ligeras idénticas de isotipo kappa (?) o lambda (?).

La cadena pesada a, que es específica de esta clase de inmunoglobulinas, existe en forma membranaria y en forma secretada. La forma secretada comprende cuatro dominios de aproximadamente 110 aminoácidos: un dominio variable VH tres dominios constantes CH1, CH2 y CH3, así como una región bisagra (H) entre CH2 y CH3 y un octapéptido C-terminal. La cisteína penúltima de este octapéptido puede formar un enlace covalente con la cadena J (o pieza de unión) que sirve para asociar dos cadenas pesadas de IgA para formar IgA diméricas. La forma membranaria comprende además un dominio hidrófobo que permite el anclaje de la proteína en la membrana, así como un dominio intracitoplasmático. La región de la cadena pesada correspondiente a los dominios CH1, CH2, H, CH3 asociados, al octapéptido C-terminal (forma secretada) o al dominio hidrófobo e intracitoplasmático (forma membranaria), se denomina región constante en oposición a la región correspondiente al dominio variable VH, que se denomina región variable.

Las cadenas ligeras ? y ?, que son comunes al conjunto de las clases y subclases de inmunoglobulinas, comprenden dos dominios: un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). En el ser humano, la expresión de las cadenas ? y ? es equivalente, mientras que en ratón la expresión del locus ? es muy reducida de modo que el 95% de las cadenas ligeras son de tipo ?. La región de la cadena ligera correspondiente al dominio CL se denomina región constante en oposición a la región correspondiente al dominio variable VL, que se denomina región variable.

Los genes de las inmunoglobulinas se organizan en loci, un locus para las cadenas pesadas (locus IgH) y un locus para cada una de las cadenas ligeras (locus lambda y kappa).

Los loci de las cadenas ligeras comprenden cada uno genes V y J que codifican el dominio variable y genes C que codifican el dominio constante; durante la diferenciación de los linfocitos B, un gen V se reorganiza con un gen J y un gen C, y la región V sufre además mutaciones somáticas que permiten producir anticuerpos de gran afinidad por el antígeno.

El locus de las cadenas pesadas comprende genes V, D y J que codifican el dominio variable y genes C (Cµ, Cd, C?, Ce y Ca) que codifican los dominios constantes de los isotipos de las diferentes clases de inmunoglobulinas; cada gen C, excepto Cd, viene precedido por una secuencia de conmutación o switch (S). Los genes Ca (Ca1 y Ca2 en el ser humano) contienen intrones que separan los exones que codifican los dominios constantes CH1, CH2 y CH3 y el exón de membrana (mb); la secuencia que codifica la región bisagra está incluida en el exón CH2. Durante la diferenciación de los linfocitos B, un gen V se reorganiza con un gen D y un gen J, y la región V también sufre mutaciones somáticas que permiten producir anticuerpos de gran afinidad por el antígeno. Además, mientras que la respuesta primaria al antígeno está constituida principalmente por IgM, la respuesta secundaria se asocia al mecanismo de conmutación de clase durante el cual la secuencia de conmutación Sµ, situada cadena arriba de Cµ recombina con otra secuencia de conmutación conduciendo de este modo la producción de otra clase de inmunoglobulina (IgG, IgE o IgA).

El locus de las cadenas pesadas de inmunoglobulinas comprende también secuencias reguladoras en 5' (promotor pVH y activador intrónico Eµ) y en 3' (activadores de transcripción Ca3'/hs3 inverso (hs3a), a3'E/hs1-2, hs3 (hs3b) y hs4). Se ha demostrado que la deleción de los dos últimos activadores en 3' (hs3b y hs4) reducía severamente la transcripción de la línea germinal y la conmutación de clase hacia la mayor parte de los isotipos de inmunoglobulinas y también podría afectar a la expresión del gen µ en las células B en reposo (Pinaud et al., Immunity, 2001, 15, 187-199). Además, las secuencias reguladoras 5' y 3' del locus de las cadenas pesadas de ratón se utilizaron para construir un vector de expresión que comprende una casete que permite una expresión estable y eficaz de un transgén, particularmente un ADNc que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina humana en las líneas de células B de ratón que tienen insertada esta casete de expresión en su genoma (Chauveau et al., Gene, 1998. 222, 279-285).

El locus de las cadenas pesadas de inmunoglobulina también puede modificarse mediante recombinación homóloga, particularmente para producir inmunoglobulinas monoclonales de ratón a partir de hibridomas cuyo locus IgH se ha modificado con ayuda de un vector de sustitución universal que comprende regiones de homologías 5' y 3' constituidas respectivamente por el segmento JH-Sµ y un fragmento de ADN en 3' del gen Ca (Ronai et al., Journal of Immunological Methods, 2003, 275, 191-202).

La diversidad de los anticuerpos producidos en respuesta a la estimulación con un antígeno procede de la combinación de varios mecanismos: la multiplicidad de los genes V, la mutación somática de estos genes V, la recombinación somática de los genes V y la recombinación somática de las secuencias de conmutación.

Las IgA existen en el organismo en dos formas diferentes: una IgA sérica y una IgA secretora (s-IgA).

La IgA sérica representa del 15 al 20% de las inmunoglobulinas séricas; más del 80% de la IgA sérica humana está en forma de monómero, mientras que en la mayor parte de las demás especies de mamíferos, ésta está esencialmente en forma de dímero.

La IgA secretora constituye la principal inmunoglobulina de las secreciones (oculares, salivales, mamarias, traqueobronquiales y urogenitales), donde existe en forma de un dímero de IgA asociado a otra proteína, el componente secretor, que está probablemente enrolado alrededor del dímero de IgA y unido mediante puentes disulfuro al dominio CH2 de cada monómero de IgA. Al contrario que la cadena J, la pieza secretora no es sintetizada por los plasmocitos sino por las células epiteliales. La IgA dimérica secretada por los plasmocitos sub-epiteliales se une a los receptores poli-Ig presentes en el polo basal de las células epiteliales. El complejo s-IgA/receptor es entonces incluido por endocitosis y transportado a través de la célula al tiempo que permanece fijado a la membrana de las vesículas de transporte. Éstas se fusionan con la membrana plasmática en la superficie luminal y liberan la IgA dimérica asociada a la pieza secretora que proviene de la escisión del receptor. De este modo, la pieza secretora facilita el transporte de las IgA en las secreciones y las protege de la proteolisis.

Debido a su capacidad para atravesar el epitelio de las mucosas y para impedir la entrada de patógenos como los virus, bacterias, parásitos y toxinas, las IgA juegan un papel fundamental en la inmunidad local: ocular, respiratoria, digestiva y urogenital. El modo de acción de las IgA engloba mecanismos activos (activación del complemento, unión al receptor Fc) y pasivos (bloqueo de los receptores de los patógenos (virus) e inhibición de la motilidad de las bacterias). Se ha demostrado una correlación estrecha entre una respuesta de IgA específica y la protección contra una infección, particularmente por virus (rotavirus, virus de la gripe, poliovirus, citomegalovirus, virus respiratorio sincitial, virus Epstein-Barr). Se han aislado anticuerpos protectores de clase IgA dirigidos contra numerosos patógenos humanos (VIH, virus de la gripe A, bacterias, toxinas, parásitos).

Debido a esta propiedad particular, las IgA tienen aplicaciones específicas para el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades infecciosas y de cáncer. Éstas podrían utilizarse en inmunoterapia pasiva para neutralizar patógenos (seroterapia). También podrían utilizarse en inmunoterapia activa (vacunación) como vector para fijar como objetivo antígenos de tumores o de microorganismos patógenos en las mucosas, para inducir una inmunidad local específica de estos antígenos. Además, son útiles como reactivo fiable, seguro,...

1. Mamífero no humano transgénico, caracterizado por que comprende un locus IgH modificado mediante sustitución de la secuencia de conmutación Sµ por todo o parte de un transgén constituido por el gen Ca de una inmunoglobulina humana de clase A que incluye al menos el exón que codifica el dominio CH3 y el exón de membrana.

2. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con la Reivindicación 1, caracterizado por que es homocigótico para dicho locus IgH modificado.

3. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, caracterizado por que dicho locus IgH se modifica mediante sustitución de la secuencia de conmutación Sµ, por la totalidad del gen Ca.

4. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2, caracterizado por que dicho locus IgH se modifica mediante sustitución de la secuencia de conmutación Sµ, por el segmento del gen Ca que incluye el exón que codifica el dominio CH3 y el exón de membrana.

5. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que dicho gen Ca es Ca1.

6. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que comprende otro transgén que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina humana.

7. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con la Reivindicación 6, caracterizado por que dicha cadena ligera es una cadena kappa.

8. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con la Reivindicación 7, caracterizado por que dicho transgén comprende el activador intrónico Eµ, cadena arriba y el palíndromo hs3a/hs1,2/hs3b cadena abajo.

9. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con la Reivindicación 8, caracterizado por que dicho transgén está bajo el control del promotor de la cadena pesada de inmunoglobulina humana.

10. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 6 a 9, caracterizado por que es dicigótico para dicho transgén.

11. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 6 a 10, caracterizado por que posee un locus endógeno de la cadena kappa inactivado.

12. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con la Reivindicación 11, caracterizado por que es homocigótico para dicho locus endógeno de la cadena kappa inactivado.

13. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por que posee un gen que codifica la cadena J inactivado.

14. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con la Reivindicación 13, caracterizado por que es homocigótico para dicho gen que codifica la cadena J inactivado.

15. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con la Reivindicación 13 o la Reivindicación 14, caracterizado por que comprende otro transgén que codifica una cadena J de inmunoglobulina humana.

16. Mamífero no humano transgénico de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 15, caracterizado por que es un ratón transgénico.

17. Ratón transgénico de acuerdo con la Reivindicación 16, caracterizado por que comprende:

- un locus IgH modificado mediante sustitución de la secuencia de conmutación Sµ por todo el gen Ca1 de una inmunoglobulina humana de clase A, y

- un gen V? completo que comprende el gen V?I reorganizado con un gen J?5, el intrón J?-C? y el gen C?, bajo el control transcripcional del promotor de la cadena pesada humana (pVH) y del activador intrónico Eµ cadena arriba, y del palíndromo hs3a/hs1,2/hs3b cadena abajo.

18. Vector de direccionamiento de recombinación homóloga, caracterizado por que comprende el gen Ca de una inmunoglobulina humana de clase A o un segmento de este gen que incluye al menos el exón que codifica el dominio CH3 y el exón de membrana, flanqueado por fragmentos de secuencias del locus IgH de un mamífero no humano que son adyacentes a la secuencia Sµ.

19. Vector de direccionamiento de acuerdo con la Reivindicación 18, caracterizado por que comprende una casete de expresión de un marcador de selección apropiado, adyacente a dicho gen Ca o a un segmento de dicho gen.

20. Vector de direccionamiento de acuerdo con la Reivindicación 19, caracterizado por que dicha casete de expresión está flanqueada por secuencias de recombinación específicas de sitio.

21. Vector de direccionamiento de acuerdo con la Reivindicación 19, caracterizado por que dichas secuencias son las secuencias LoxP de la recombinasa Cre.

22. Vector de direccionamiento de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 18 a 21, caracterizado por que dichos fragmentos de secuencias que son adyacentes a la secuencia Sµ son de origen murino.

23. Vector de direccionamiento de acuerdo con la Reivindicación 22, caracterizado por que el gen Ca o el segmento de dicho gen está flanqueado, respectivamente en 5' y en 3', por fragmentos correspondientes a las posiciones 131281 a 136441 y 140101 a 145032 en la secuencia del cromosoma 12 murino (número de entrada AC073553 en la base de datos EMBL/Genbank).

24. Célula embrionaria de mamífero no humano, modificada con un vector de direccionamiento de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 18 a 23.

25. Utilización de un mamífero no humano transgénico de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 16 o de un ratón transgénico de acuerdo con la Reivindicación 17, para la producción de anticuerpos humanizados de clase IgA o de fragmentos de estos anticuerpos.

26. Procedimiento de preparación de anticuerpos humanizados de clase IgA o de fragmentos de estos anticuerpos, caracterizado por que comprende al menos las siguientes etapas:

- la inmunización de un mamífero no humano transgénico de acuerdo con una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 16 o de un ratón transgénico de acuerdo con la Reivindicación 17, y

- la obtención mediante cualquier medio apropiado, de anticuerpos humanizados de clase IgA o de fragmentos de estos anticuerpos, a partir del suero, de las secreciones o de los linfocitos B de dicho mamífero no humano transgénico previamente sacrificado.

27. Anticuerpo humanizado de clase IgA que puede obtenerse mediante el procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 26, caracterizado por que comprende una cadena pesada quimérica cuyos dominios constantes son de origen humano y una cadena ligera humana cuyo dominio variable está codificado por V?I-J?5.

28. Fragmento de un anticuerpo humanizado de clase IgA de acuerdo con la Reivindicación 27, caracterizado por que comprende un fragmento de dichas cadenas pesadas y ligeras.

29. Fragmento de anticuerpo humanizado de clase IgA de acuerdo con la Reivindicación 28, caracterizado por que se selecciona entre el grupo constituido por los fragmentos Fab, Fab'2 y Fc.

30. Medicamento, caracterizado por que comprende un anticuerpo humanizado de clase IgA de acuerdo con la Reivindicación 27 o un fragmento de este anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 28 o la Reivindicación 29.

31. Reactivo de diagnóstico, caracterizado por que comprende un anticuerpo humanizado de clase IgA de acuerdo con la Reivindicación 27 o un fragmento de este anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 28 o la Reivindicación 29.

32. Composición inmunógena o de vacuna, caracterizada por que comprende al menos un anticuerpo humanizado de clase IgA de acuerdo con la Reivindicación 27 o un fragmento de este anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 28 o la Reivindicación 29, asociado a un antígeno.

33. Composición farmacéutica, caracterizada por que comprende al menos un anticuerpo humanizado de clase IgA de acuerdo con la Reivindicación 27 o un fragmento de este anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 28 o la Reivindicación 29, asociado mediante cualquier medio apropiado a un principio activo.

34. Utilización de un anticuerpo humanizado de clase IgA de acuerdo con la Reivindicación 27 o de un fragmento de este anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 28 o la Reivindicación 29, para la preparación de un medicamento para la prevención y el tratamiento de enfermedades infecciosas y de cáncer.

35. Utilización de un anticuerpo humanizado de clase IgA de acuerdo con la Reivindicación 27 o de un fragmento de este anticuerpo de acuerdo con la Reivindicación 28 o la Reivindicación 29, para la preparación de un reactivo para el diagnóstico de enfermedades infecciosas y de cáncer.