CONTROL DE LA SINTESIS DE ALMIDON.
Planta de tomate cultivada que comprende un genoma de Lycopersicon esculentum comprendiendo dicho genoma una introgresión derivada de un Lycopersicon spp.
de tipo natural, comprendiendo dicha introgresión un alelo que codifica para una subunidad grande (LS 1) de la ADPGPPasa, expresando dicha introgresión dicha subunidad grande (LS 1) de la ADPGPPasa en el fruto de la planta de tomate cultivada a niveles superiores que en Lycopersicon esculentum
Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W9900396IL.
Solicitante: STATE OF ISRAEL-MINISTRY OF AGRICULTURE.
Nacionalidad solicitante: Israel.
Dirección: VOLCANI RESEARCH CENTER P.O. BOX 6,IL-50 250 BET DAGAN.
Inventor/es: SCHAFFER,ARTHUR,A, LEVIN,ILAN, PETREIKOV,MARINA, BAR,MOSHE.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 9 de Septiembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- A01H1/04 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS. › A01H 1/00 Procedimientos de modificación de los genotipos (A01H 4/00 tiene prioridad). › Procedimientos de selección.
- C12N9/12B7B
Clasificación PCT:
- A01H1/04 A01H 1/00 […] › Procedimientos de selección.
- A01H5/00 A01H […] › Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica.
- C12N15/82 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para células vegetales.
- C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
- C12N9/12 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › transfieren grupos que contienen fósforo, p. ej. Quinasas (2.7).
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Clasificación antigua:
- A01H1/04 A01H 1/00 […] › Procedimientos de selección.
- A01H5/00 A01H […] › Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica.
- C12N15/54 C12N 15/00 […] › Transferasas (2).
- C12N15/82 C12N 15/00 […] › para células vegetales.
- C12N5/10 C12N 5/00 […] › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
- C12N9/12 C12N 9/00 […] › transfieren grupos que contienen fósforo, p. ej. Quinasas (2.7).
- C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Fragmento de la descripción:
Control de la síntesis de almidón.
Sector de la técnica
La presente invención se refiere a un método de producción de tomates con un contenido en almidón aumentado en el fruto joven y posteriormente un contenido en sólidos solubles aumentado en el fruto maduro. Además, se refiere al uso de genes que aumentan el almidón en el tomate.
Estado de la técnica
El contenido en sólidos del fruto de tomate maduro es un determinante principal de su calidad. El aumento del contenido en sólidos solubles (en gran parte azúcares y ácidos orgánicos) y de ese modo la mejora del valor de los tomates para la industria y del sabor de los tomates en el mercado de productos frescos han sido el objetivo de proyectos de investigación durante muchos años. Se han tomado diversos enfoques para mejorar los niveles de sólidos, abarcando manipulaciones tanto agrotécnicas como genéticas.
El contenido en sólidos solubles del fruto de tomate está comprendido fundamentalmente por azúcares, ácidos orgánicos y sales. Conjuntamente, el contenido en sólidos solubles es un determinante principal de la calidad del fruto, tanto para uso industrial como para su consumo en el mercado de productos frescos. La fracción de azúcar aporta aproximadamente la mitad del contenido en sólidos solubles que, en todos los cultivos convencionales de Lycopersicon esculentum, consiste en azúcares que se reducen a monosacáridos glucosa y fructosa en concentraciones aproximadamente equimolares.
Se han explorado diversas estrategias para aumentar la concentración de azúcar en el fruto de tomate maduro. Las manipulaciones genéticas incluyen la transferencia de cteres no definidos de sólidos altamente solubles a partir de especies de tipo natural de Lycopersicon (Rick C. M. 1974. Hilgardia 42:493-510; y Hewitt J. D., Dinar M. y Stevens M. A. 1982. J. Am. Soc. Hort. Sci. 107:896-900) y más recientemente la transferencia del carácter genético de acumulación de sacarosa a partir de Lycopersicon chmielewskii de tipo natural (Yelle S., Hewitt J. D., Robinson N. L., Damon N. S. y Bennett A. B. 1988. P1. Physiol. 87:737-740; y Yelle S., Chetelat R. T., Dorais M., Devema J. W. y Bennett A. B. 1991. P1. Physiol. 95:1026-1035.) y L. hirsutum (Miron D. y Schaffer, A. A. 1991. P1. Physiol. 95:623-627), así como la transferencia del carácter genético de la razón alta de fructosa con respecto a glucosa en el fruto maduro, a partir de L. hirsutm (solicitud de patente estadounidense 08/530.216). El último enfoque se hizo posible mediante el estudio de los componentes del metabolismo de hidratos de carbono en el desarrollo del tejido del fruto de tomate con el fin de identificar las etapas bioquímicas cuya modificación puede conducir a un contenido en hidratos de carbono solubles aumentado en el fruto (Yelle et al., 1988, 1991. Miron y Schaffer, 1991). Una vez identificados, estos procesos bioquímicos podrían entonces dirigirse para la modificación mediante medios genéticos clásicos, ayudados mediante la selección del carácter bioquímico genotípico o mediante estrategias de genética molecular.
El fruto de tomate joven en desarrollo se caracteriza por una acumulación de almidón transitoria que puede aportar más del 25% del peso seco del tejido del fruto. La concentración de almidón empieza a aumentar en el plazo de días tras la antesis y alcanza concentraciones pico antes de la fase verde maduro (Schaffer, A. A. y Petreikov, M. 1997a. Plant Physiology 113:739-746). En la fase madura este almidón está prácticamente ausente en el tejido del fruto de tomate. Se ha planteado como hipótesis que el almidón acumulado de manera transitoria sirva como depósito de hidratos de carbono para la acumulación posterior de azúcares solubles en el fruto maduro (Dinar M. y Stevens M. A. 1981. J. Am. Soc. Hort. Sci. 106:415-418). Dinar y Stevens prepararon el trabajo de base para esta hipótesis en su estudio comparando siete genotipos de tomate cuyos valores de sólidos solubles totales (TSS) en el fruto maduro abarcaba el espectro de desde 4,6 hasta 6,3 ºBrix. Encontraron que los valores de TSS en el fruto maduro se correlacionaban positivamente con el contenido en almidón en el fruto joven inmaduro y propusieron que los productos de la hidrólisis del almidón contribuyen a la acumulación de azúcares solubles.
La planta de tomate traslada fotosintato hasta el fruto en forma de sacarosa (Walker L. J. y Ho L. C. 1977. Ann. Bot. 41:813-823) y, por tanto, se supone que la acumulación temporal de almidón se determinará mediante cambios temporales en las actividades de enzimas clave implicadas en el metabolismo de sacarosa a almidón. Se ha estudiado y descrito la ruta enzimática de la síntesis de almidón en el fruto de tomate joven (Schaffer, A. A. y Petreikov, M. 1997a. Plant Physiology 113:739-746; Schaffer, A. A. y Petreikov, M. 1997b. Physiologia Plantarum 101:800-806). Se identificaran cuatro enzimas que limitan potencialmente la acumulación de almidón en estos frutos, basándose en sus actividades absolutas, así como en los cambios en el desarrollo en sus actividades que se correlacionan temporalmente con los cambios en el desarrollo en los niveles de almidón. Estas enzimas incluyen aquéllas que catalizan las etapas iniciales del metabolismo de sacarosa en el fruto joven (sacarosa sintasa, E.C. 2.4.1.13, y fructocinasa, E.C. 2.7.1.4) así como las últimas etapas de la síntesis de almidón (ADP-glucosa pirofosforilasa, E.C. 2.7.7.27, y almidón sintasa, E.C., 2.4.1.21). Además, Schaffer y Petreikov han mostrado que la acumulación de almidón es específica de tejido, localizada principalmente en los tejidos de la columela y el pericarpio interno, y sugirieron que contribuciones relativas de estos tejidos al volumen del fruto podría causar impacto en el contenido en almidón del fruto.
La investigación ha mostrado claramente que una de las enzimas mencionadas anteriormente, ADPGPPasa (ADP-glucosa pirofosforilasa), puede ser limitativa para la síntesis de almidón en el fruto de tomate, así como en otros tejidos que acumulan almidón, tales como tubérculos de patata. En Stark D. M., Barry G. F. y Kishore G. M. 1996. Ann. NY Cad Sci 792:26-36, se desarrollaron plantas de patata y plantas tomate transgénicas con una forma de mutante bacteriana de la ADPGPPasa (E. coli, G1gC16, un superproductor de glicógeno). Los tomates transgénicos mostraron un contenido en almidón superior en el fruto inmaduro y un contenido en azúcar aumentado en el fruto maduro. Los tubérculos de patata transgénicos con el mismo constructo génico bacteriano también mostraron un aumento en el contenido en almidón. De manera recíproca, la inhibición de la actividad ADPGPPasa redujo el contenido en almidón de tubérculos de patata transgénicos, indicando además la importancia de la ADPGFPasa en el control de la acumulación de almidón.
El uso de un gen para ADPGPPasa de origen bacteriano requiere manipulaciones genéticas moleculares con el fin de que el gen funcione en un tejido vegetal eucariota. Por ejemplo, requiere que se desarrolle un constructo génico artificial que codificará para un polipéptido de fusión que contiene un péptido de tránsito aminoterminal específico, que no está presente en el gen procariota, así como otras adiciones de secuencias de ADN que provocarán en células vegetales la terminación transcripcional, y la adición de nucleótidos poliadenilados al extremo 3' de la secuencia de ARN. En comparación, el uso de un gen vegetal para transformaciones similares no requiere estas manipulaciones.
Además, el desarrollo de plantas con actividad aumentada o modificada de estas enzimas, basándose en la transferencia natural a través de técnicas de producción clásicas de alelos que se producen de manera natural de estos genes, puede beneficiarse de varias ventajas. Por ejemplo, las técnicas de producción clásicas conducen al posicionamiento del alelo deseado en la posición natural del gen de interés, conduciendo a la estabilidad genética y obviando los efectos de una "posición" impredecible característica del desarrollo de organismos transgénicos. Además, con respecto a preferencias del consumidor, existen ventajas obvias de un producto comercial derivado de manera natural tal como un fruto de tomate, en comparación con un fruto de tomate derivado transgénicamente.
Con respecto a fructocinasa, dos genes del fruto de tomate se han identificado, clonado y secuenciado (Kanayama, Y. et al. 1997. Plant Physiology 113:1379-1384). Uno de estos genes, FK2, está implicado particularmente en la ruta metabólica asociada con la síntesis de almidón (Kanayama et al....
Reivindicaciones:
1. Planta de tomate cultivada que comprende un genoma de Lycopersicon esculentum comprendiendo dicho genoma una introgresión derivada de un Lycopersicon spp. de tipo natural, comprendiendo dicha introgresión un alelo que codifica para una subunidad grande (LS 1) de la ADPGPPasa, expresando dicha introgresión dicha subunidad grande (LS 1) de la ADPGPPasa en el fruto de la planta de tomate cultivada a niveles superiores que en Lycopersicon esculentum.
2. Planta de tomate cultivada según la reivindicación 1, en la que dicho alelo comprende una secuencia de nucleótidos tal como sigue:
3. Planta de tomate cultivada según la reivindicación 1, en la que dicho alelo codifica para una secuencia de aminoácidos tal como sigue:
4. Método de producción de plantas genéticamente transformadas que tienen un contenido en almidón elevado, que comprende las etapas de:
- a) insertar en el genoma de una célula vegetal una molécula de ADN bicatenario recombinante que comprende:
- b) obtener células vegetales transformadas; y
- c) regenerar a partir de las células vegetales transformadas plantas genéticamente transformadas con un contenido en almidón elevado.
5. Método según la reivindicación 4, en el que dicha célula vegetal se selecciona del grupo que consiste en una célula de tomate, una célula de patata, una célula de una planta solanácea, una célula de legumbre y una célula de cultivo de cereal.
6. Método según la reivindicación 4, en el que dicho promotor se selecciona del grupo que consiste en un promotor de fruto inmaduro, un promotor de tubérculo y un promotor de semilla.
7. Método según la reivindicación 4, en el que dicha etapa de regeneración comprende regenerar plantas genéticamente transformadas con un contenido en almidón elevado en un fruto inmaduro.
8. Método según la reivindicación 4, en el que dicha etapa de regeneración comprende regenerar plantas genéticamente transformadas con un contenido en almidón elevado en un tubérculo.
9. Método según la reivindicación 4, en el que dicha etapa de regeneración comprende regenerar plantas genéticamente transformadas con un contenido en almidón elevado en una semilla.
10. Método según la reivindicación 4 y que comprende adicionalmente la etapa de propagación de dichas plantas genéticamente transformadas.
11. Método según la reivindicación 10, en el que la etapa de propagación incluye la etapa de propagación vegetativa.
12. Método según la reivindicación 10, en el que la etapa de propagación incluye la etapa de propagación mediante semilla.
13. Planta transgénica que expresa una secuencia de ácido nucleico exógena de un gen de LS1 de la ADPGPPasa de Lycopersicon spp. de tipo natural, teniendo dicha planta transgénica un contenido en almidón elevado.
14. Fruto transgénico de la planta transgénica según la reivindicación 13.
15. Semilla transgénica que cuando se cultiva proporciona una planta transgénica según la reivindicación 13.
16. Método según la reivindicación 4, en el que dicha secuencia de ADN estructural es la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 2.
17. Método según la reivindicación 4, en el que dicha proteína de LS1 de la ADPGPPasa tiene una secuencia de aminoácidos según la reivindicación 3.
18. Planta transgénica según la reivindicación 13, en la que dicho ácido nucleico exógeno es la secuencia de nucleótidos según la reivindicación 2.
19. Planta transgénica según la reivindicación 13, en la que dicha secuencia de ácido nucleico codifica para una proteína de LS1 de la ADPGPPasa que tiene una secuencia de aminoácidos según la reivindicación 3.
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