Un replicón de ARN, que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una región 5' no traducida que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº:

1, una secuencia de codificación de una proteína núcleo que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 2, una secuencia de codificación de la proteína E1 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 3, una secuencia de codificación de la proteína E2 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 4, una secuencia de codificación de la proteína NS2 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 5, una secuencia de codificación de la proteína NS3 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 6, una secuencia de codificación de la proteína NS4A que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 7, una secuencia de codificación de la proteína NS4B que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 8, una secuencia de codificación de la proteína NS5A que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 9, una secuencia de codificación de la proteína NS5B que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 10, una región 3' no traducida que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 11, al menos un gen marcador seleccionable y/o al menos un gen indicador, y al menos una secuencia IRES, en el que dicho al menos un gen marcador seleccionable y/o al menos un gen indicador, y dicha al menos una secuencia IRES se colocan entre la región 5' no traducida y la secuencia de codificación de la proteína núcleo en este orden en la dirección 5' a 3', en el que dicho replicón de ARN tiene capacidad de replicación autónoma y capacidad de producción de partículas de virus

Construcción de ácidos nucleicos que contiene el genoma de longitud completa del virus de la hepatitis C humana; célula replicante del genoma de longitud completa de virus recombinante que tiene la construcción de ácidos nucleicos transferida al anterior y procedimiento para construir partículas víricas de la hepatitis C.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un replicón de ARN que comprende una secuencia de nucleótidos específica, al menos un gen marcador y/o al menos un gen indicador seleccionables, un procedimiento para producir una célula que replica un replicón de ARN y produce una partícula de virus, una célula que replica un replicón de ARN y produce una partícula de virus para cribar una sustancia contra el virus de la hepatitis C, una vacuna de la hepatitis C, un procedimiento para producir una vacuna de la hepatitis C, un procedimiento in vitro para producir partículas del virus de la hepatitis C y el uso de las partículas del virus de la hepatitis C producidas.

Antecedentes de la técnica

El virus de la hepatitis C (VHC) pertenece a la familia Flaviviridae y es un virus que tiene un genoma de ARN de sentido directo (+) de cadena única y es conocido por producir la hepatitis C.

El VHC produce hepatitis crónica por infección persistente. Actualmente, la principal causa de hepatitis crónica observada mundialmente es la infección persistente por VHC. En la actualidad, alrededor del 50% de individuos con infección persistente desarrolla hepatitis crónica. La hepatitis crónica en aproximadamente un 20% de estos pacientes evoluciona a cirrosis hepática en el curso de 10 a 20 años, y algunos de estos pacientes experimentan adicionalmente condiciones patológicas letales avanzadas tales como cáncer hepático.

La hepatitis C se trata actualmente principalmente mediante terapia usando interferón-a o interferón-ß, o una terapia que usa una combinación de interferón-a y ribavirina, un derivado nucleósido de purina. Sin embargo incluso cuando se llevan a cabo estas terapias, se observan efectos terapéuticos en solo un 60% de los pacientes tratados. Cuando cesan las terapias después que se observan los efectos, se recrudece la enfermedad en más de la mitad de los pacientes.

Es una importante meta desarrollar agentes terapéuticos o agentes profilácticos eficaces contra la hepatitis C. La tasa de incidencia de la hepatitis C, que produce finalmente graves consecuencias, es elevada en países industriales, y no está actualmente disponible un tratamiento causal. Por tanto, se desea el desarrollo de terapias específicas de VHC y terapias de vacunas. Un objetivo para el desarrollo de un agente dirigido contra el VHC puede ser la supresión de la replicación de VHC o la supresión de la infección de las células con VHC.

Recientemente, se han preparado sistemas de replicones de ARN subgenómico de VHC, en forma de ARN replicable autónomamente derivado de VHC (véanse, los Documentos de Patente 1,2 y 3, los Documentos No de Patente 1-4). En los sistemas de replicones de ARN subgenómico de VHC, el replicón de ARN de VHC en el que se eliminan y sustituyen los genes estructurales del genoma de VHC con un gen marcador seleccionable de fármaco, se prepara e introduce en células cultivadas, y por tanto, el replicón de ARN se replica autónomamente en las células. Usando estos sistemas llega a ser posible analizar el mecanismo de replicación de VHC. Sin embargo, este es un sistema experimental en el que únicamente se evalúa la replicación del ARN vírico en el proceso de la proliferación y la replicación del virus VHC, y no se puede analizar el proceso de formación de las partículas del virus VHC en las células infectadas y la liberación extracelular de la infección en otras células.

En la actualidad, se puede evaluar únicamente el proceso de formación de partículas del virus VHC y la liberación extracelular así como la infección en otras células en los sistemas experimentales que usan animales tales como chimpancés (Documento No de Patente 5). Sin embargo, los sistemas experimentales que usan organismos vivos tales como animales son complicados y muy difíciles de analizar. Por tanto, con el fin de analizar el proceso de formación de partículas del virus VHC y la liberación extracelular, así como la infección en otras células, y para producir un agente dirigido contra VHC que tendrá el mecanismo de acción de inhibir este proceso, es necesario establecer un sistema experimental muy simplificado que reproduzca este proceso, es decir, un sistema de producción de partículas del virus VHC en sistemas experimentales de cultivo celular.

Adicionalmente, una vez que se pueden proporcionar de manera estable partículas del virus VHC usando el sistema de cultivo celular, es posible atenuar el virus o producir virus VHC no infeccioso usando técnicas de biología molecular, y se pueden usar éstas en vacunas.

Documento de Patente 1: Publicación de patente japonesa (kokai) Nº 2001-17187

Documento de Patente 2: Solicitud de Patente Internacional PCT/JP03/15038

Documento de Patente 3: Solicitud de Patente japonesa Nº 2003-329082

Documento No de Patente 1: Lohmann y col., Science, (1999) 285, p. 110-113

Documento No de Patente 2: Blight y col., Science, (2000) 290, p 1972-1974

Documento No de Patente 3: Friebe y col., J. Virol., (2001) 75(24): p. 12047-12057

Documento No de Patente 4: Ikeda y col., Science, (1977) 277, p. 2997-3006

Documento No de Patente 5: Kolykhalov y col., Science, (1977) 277, p. 570-574

Documento No de Patente 6: Kato y col., Gastroenterology, (2003) 125, p. 1808-1817

Documento No de Patente 7: Yanagi y col., Proc. Natl. Acad. Sci., (1997) 96(16): p. 8738-8743

Documento No de Patente 8: Okamoto y col., J. Gen. Virol. (1991) 73, p. 2697-26704

Documento No de Patente 9: Aoyagi y col., J. Clin. Microbiol., (1999) 37(6); p. 1802-1808

Divulgación de la invención

El objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para replicar eficazmente el ARN que contiene las secuencias genómicas del VHC de longitud completa y un procedimiento para producir partículas del virus VHC que contengan el replicón de ARN del VHC de longitud completa o el ARN genómico del VHC de longitud completa en un sistema de cultivo celular. El objetivo de la presente invención no se ha conseguido nunca hasta el momento.

Como resultado de intensos estudios para conseguir el anterior objeto, los presentes inventores han desarrollado un procedimiento para producir partículas del virus VHC en un sistema de cultivo celular. Esto es, la presente invención proporciona un replicón de ARN de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 y 3. En las reivindicaciones 4 a 13 se definen las materias sujeto de la presente invención.

1. Un replicón de ARN, que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende una región 5' no traducida que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 1, una secuencia de codificación de una proteína núcleo que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 2, una secuencia de codificación de la proteína E1 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 3, una secuencia de codificación de la proteína E2 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 4, una secuencia de codificación de la proteína NS2 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 5, una secuencia de codificación de la proteína NS3 que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 6, una secuencia de codificación de la proteína NS4A que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 7, una secuencia de codificación de la proteína NS4B que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 8, una secuencia de codificación de la proteína NS5A que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 9, una secuencia de codificación de la proteína NS5B que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 10, una región 3' no traducida que comprende una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC DE ID Nº: 11, al menos un gen marcador seleccionable y/o al menos un gen indicador, y al menos una secuencia IRES, en el que dicho al menos un gen marcador seleccionable y/o al menos un gen indicador, y dicha al menos una secuencia IRES se colocan entre la región 5' no traducida y la secuencia de codificación de la proteína núcleo en este orden en la dirección 5' a 3', en el que dicho replicón de ARN tiene capacidad de replicación autónoma y capacidad de producción de partículas de virus.

2. El replicón de ARN de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos comprende la región 5' no traducida, el al menos un gen marcador seleccionable y/o el al menos un gen indicador, y la al menos una secuencia IRES, y la secuencia de codificación de la proteína núcleo, la secuencia de codificación de la proteína E1, la secuencia de codificación de la proteína E2, la secuencia de codificación de la proteína NS2, la secuencia de codificación de la proteína NS3, la secuencia de codificación de la proteína NS4A, la secuencia de codificación de la proteína NS4B, la secuencia de codificación de la proteína NS5A, la secuencia de codificación de la proteína NS5B, y la región 3' no traducida en este orden en la dirección 5' a 3'.

3. El replicón de ARN de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende el ARN (a) o (b) siguiente:

4. Un procedimiento para producir una célula que replica un replicón de ARN y produce una partícula de virus, que comprende introducir el replicón de ARN de acuerdo con una cualquiera de de las reivindicaciones 1 a 3 en una célula.

5. Una célula que replica un replicón de ARN y produce una partícula de virus, que comprende el replicón de ARN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

6. La célula de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la célula es una célula derivada de hígado humano, una célula derivada de cuello uterino humano o una célula derivada de riñón fetal humano.

7. La célula de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la célula es una célula Huh7, una célula HepG2, una célula IMY-N9, una célula HeLa o una célula 293.

8. Un procedimiento para producir una partícula de virus de la hepatitis C, que comprende cultivar la célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 para permitir a la célula producir la partícula de virus.

9. Una partícula de virus de la hepatitis C que comprende el replicón de ARN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

10. Un procedimiento para cribar una sustancia contra el virus de la hepatitis C, que comprende cultivar, en presencia de una sustancia de ensayo, al menos una seleccionada entre el grupo constituido por (a), y (b) siguientes:

y detectar el replicón de ARN o las partículas de virus en el cultivo resultante.

11. Una vacuna de la hepatitis C, que comprende la partícula de virus de la hepatitis C de acuerdo con la reivindicación 9 o una parte de la misma.

12. Un procedimiento para producir una vacuna de la hepatitis C usando la partícula de virus de la hepatitis C de acuerdo con la reivindicación 9 o una parte de la misma como un antígeno.

13. Uso del replicón de ARN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la producción de partículas de virus de la hepatitis C en células cultivadas.