Identificación de ácidos nucleicos diana por escisión de sonda basada en estructura.

Un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra,

que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra que comprende un ácido nucleico diana con

(i) un par de cebadores oligonucleotídicos unido cada uno con un marcador de afinidad, en el que un primer cebador oligonucleotídico comprende una secuencia complementaria de una región en una cadena de la secuencia de ácido nucleico diana y ceba la síntesis de un primer producto de extensión, y en el que un segundo cebador oligonucleotídico comprende una secuencia complementaria de una región en dicho primer producto de extensión y ceba la síntesis de una cadena de ácido nucleico complementaria de dicho primer producto de extensión, y

(ii) una sonda oligonucleotídica que comprende al menos dos partes distintas,

en la que una primera parte compuesta de nucleótidos estándar con o sin análogos nucleotídicos que comprende una secuencia que es al menos parcialmente complementaria de una región de la secuencia del ácido nucleico diana en la que dicha primera parte hibrida dentro de la secuencia de ácido nucleico diana unida por dicho par de cebadores oligonucleotídicos, y en la que dicha primera parte comprende además un marcador de afinidad, una modificación resistente a exonucleasas en o cerca del extremo 3' para evitar la escisión por una exonucleasa en dirección 3' a 5' y está bloqueada en el extremo 3' para prohibir la extensión por una polimerasa de ácido nucleico; y

una segunda parte unida al extremo 5' de la primera parte compuesta de nucleótidos o no nucleótidos o tanto nucleótidos como no nucleótidos, y que comprende una secuencia que no es complementaria de la secuencia de ácido nucleico diana, en la que dicha segunda parte también comprende una modificación resistente a exonucleasas;

(b) amplificar dicha secuencia de ácido nucleico diana en una mezcla de reacción que comprende nucleótidos trifosfato y una polimerasa de ácido nucleico que tiene actividad nucleasa en dirección 5' a 3' en condiciones que permiten la hibridación de dicho par de cebadores oligonucleotídicos y dicha sonda oligonucleotídica con la secuencia de ácido nucleico diana y la síntesis de productos de extensión del cebador a partir de dicho par de cebadores oligonucleotídicos mientras que la actividad nucleasa en dirección 5' a 3' de dicha polimerasa de ácido nucleico puede escindir y liberar de la sonda oligonucleotídica hibridada fragmentos que contienen la segunda parte de la sonda oligonucleotídica con o sin nucleótidos adicionales de la primera parte de la sonda oligonucleotídica;

(c) someter la mezcla de reacción a una matriz de afinidad que reconoce y se une al marcador de afinidad en dicho par de cebadores oligonucleotídicos y en dicha sonda oligonucleotídica, retirando de este modo el exceso de cebadores oligonucleotídicos y las sondas oligonucleotídicas no escindidas;

(d) tratar dichos fragmentos que contienen la segunda parte de la sonda oligonucleotídica con una exonucleasa en dirección 3' a 5' que escinde dichos fragmentos hasta la modificación resistente a exonucleasas produciendo de este modo un único fragmento que tiene un tamaño único de masa distinguible; y

(e) detectar la presencia o ausencia del fragmento único, detectando de este modo la presencia o ausencia de la secuencia de ácido nucleico diana en la muestra.