Identificación multiplexada de ácidos nucleicos diana por escisión de sonda basada en estructura.

Un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra,

que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una muestra que comprende un ácido nucleico diana con:

(i) un par de cebadores oligonucleotídicos, en el que un primer cebador oligonucleotídico comprende una secuencia complementaria de una región en una cadena de la secuencia de ácido nucleico diana y ceba la síntesis de un primer producto de extensión, y en el que un segundo cebador oligonucleotídico comprende una secuencia complementaria de una región en el primer producto de extensión y ceba la síntesis de una cadena de ácido nucleico complementaria del primer producto de extensión, y

(ii) una sonda oligonucleotídica que comprende al menos dos partes distintas, una primera parte que comprende nucleótidos estándar con o sin análogos nucleotídicos que comprende una secuencia que es al menos parcialmente complementaria de una región de la secuencia del ácido nucleico diana en la que la primera parte se asocia a la secuencia del ácido nucleico diana unida por el par de cebadores de oligonucleotídicos, y en la que la primera parte está bloqueada en el extremo 3' para prohibir la extensión por una polimerasa de ácido nucleico; y una segunda parte unida al extremo 5' de la primera parte que comprende nucleótidos o no nucleótidos o tanto nucleótidos como no nucleótidos, y comprende una secuencia que no es complementaria de la secuencia de ácido nucleico diana; en la que la segunda parte está separada de la primera parte mediante un conector no nucleotídico derivado de una única unidad o de múltiples unidades separadas por enlaces fosfato, en la que el conector crea una región desestabilizada en la unión de la primera parte y la segunda parte;

(b) amplificar la secuencia de ácido nucleico diana con una polimerasa de ácido nucleico que tiene actividad nucleasa en dirección 5' a 3' en condiciones que permiten la hibridación del par de cebadores oligonucleotídicos y la sonda oligonucleotídica con la secuencia de ácido nucleico diana y la síntesis de productos de extensión del cebador a partir del par de cebadores oligonucleotídicos mientras que la actividad nucleasa en dirección 5' a 3' de la polimerasa de ácido nucleico es capaz de escindirse y liberarse de la sonda oligonucleotídica hibridada, comprendiendo un fragmento predominante la segunda parte de la sonda oligonucleotídica, el conector no nucleotídico y un único nucleótido en el extremo 5' de la primera parte de la sonda oligonucleotídica; y

(c) detectar la presencia o ausencia del fragmento predominante por espectrometría de masas, detectando 35 de este modo la presencia o ausencia de la secuencia de ácido nucleico diana en la muestra.