Vectores para la administración de proteínas sensibles a la luz y métodos para su utilización.

Un ácido nucleico recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína sensible a la luz unido operativamente a un fragmento de una secuencia reguladora del receptor de glutamato metabotrópico 6 (mGluR6),

en el que el fragmento comprende la secuencia de la Figura 6 o una secuencia que es al menos un 80% idéntica a la secuencia de la Figura 6, en el que el fragmento es de menos de 2.000 pares de bases, y en el que el ácido nucleico se encapsida dentro de un virus adenoasociado recombinante (AAV) de serotipo AAV2 que comprende una proteína de la cápside Y444F mutado o encapsidado dentro de una AAV recombinante de serotipo AAV8 que comprende una proteína de la cápside Y733F mutado y en el que el ácido nucleico es capaz de ser expresado específicamente en una célula bipolar de la retina.

Vectores para la administración de proteínas sensibles a la luz y métodos para su utilización ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Una terapia de entrega de genes para tratar una enfermedad o trastorno independiente del tratamiento de una mutación subyacente podría tener un valor potencial. Los métodos capaces de controlar, regular, y / o conducir los circuitos neuronales específicos así como para mediar respuestas neuronales naturalistas y percepción de alta resolución y de control también podrían ser de enorme valor terapéutico potencial. Las neuronas son un ejemplo de un tipo de célula que utiliza las corrientes eléctricas creadas por la despolarización para generar señales de comunicación (por ejemplo, los impulsos nerviosos). Otras células eléctricamente excitables incluyen el músculo esquelético, músculo cardiaco, y las células endocrinas. Las neuronas utilizan la despolarización rápida para transmitir señales por todo el cuerpo y para diversos fines, tales como el control motor (por ejemplo, contracciones musculares), las respuestas sensoriales (por ejemplo, el tacto, el oído y otros sentidos) y funciones de cálculo (por ejemplo, las funciones cerebrales). Al facilitar o Inhibir el flujo de Iones positivos o negativos a través de las membranas celulares, la célula puede despolarizarse brevemente, despolarizarse y mantenerse en ese estado, o hiperpolarlzarse. Por lo tanto, el control de la despolarizaron de las células puede ser beneficioso para un número de propósitos diferentes, incluyendo el control visual, muscular y sensorial. Los canales de proteínas sensibles a la luz, bombas, y receptores pueden permitir un control óptico de precisión de milisegundos a las células. Aunque las proteínas sensibles a la luz en combinación con la luz se pueden utilizar para controlar el flujo de iones a través de membranas celulares, la focalización y entrega aún no se han abordado para enfermedades específicas, trastornos y circuitos.

Un artículo de Lagali, P.S. et al (28) titulado, "Light-activated channels targeted to ON bipolar cells restore visual function in retinal degeneraron" en nature neuroscience vol. 11, n° 6, páginas 667-675 describe un estudio en el que los autores seleccionan genéticamente un canal catiónico activado por luz, canalrodopsina-2, a neuronas de segundo orden, células bipolares ON, de retinas degenerados in vivo en el modelo de ratón Pde6brd1 (también conocidos como RD1).

La W27 / 13118 describe vectores de ácidos nucleicos que codifican los canales de membrana selectivos de cationes activados por luz, en particular canalrodopsina-2 (Chop2), neuronas de retina interiores convertidas en células fotosensibles en la retina degenerada en fotorreceptores en un modelo animal.

Un artículo de Bi A et al (26) titulado "Ectopic Expression of a Microbial-Type Rhodopsin Restores Visual Responses in Mice with Photoreceptor Degeneration" en la revista Neuron vol. 5, n° 1, páginas 23-33, describe que la entrega por un vector viral adeno-asociado resulta en la expresión a largo plazo de una rodopsina de tipo microbiana, canalrodopsina-2 (ChR2) se puede lograr en neuronas de la retina interna de roedores in vivo.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En un aspecto de la presente invención, se proporciona un ácido nucleico recombinante tal como se expone en la reivindicación 1. En una realización, la proteína sensible a la luz se puede seleccionar del grupo que consiste de ChR1, ChR2, VChR1, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos / quimeras ChRI-ChR2, Chd, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR, melanopsina. En otra realización, la proteína sensible a la luz es ChR2 o una proteína sensible a la luz que es al menos aproximadamente 7%, al menos aproximadamente 8%, al menos aproximadamente 9% o al menos aproximadamente 95% idéntica a ChR2. En otra realización, el fragmento de secuencia reguladora mGluR6 comprende menos de aproximadamente 1, menos de aproximadamente 75, menos de aproximadamente 5, menos de aproximadamente 25, o menos de aproximadamente 1 pares de bases. En una realización relacionada, la secuencia reguladora mGluR6 o fragmento de la misma es un promotor o potenciador de mGluR6. En una realización relacionada específica el ácido nucleico comprende además una proteína fluorescente verde.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las características novedosas de la invención se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención se obtendrá por referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en que se utilizan los principios de la invención, y los dibujos adjuntos de los mismos:

La Figura 1 describe la secuencia de ácido nucleico de ChR1.

La Figura 2 describe la secuencia de ácido nucleico de ChR2.

La Figura 3 describe la secuencia de ácido nucleico de NpHR.

La Figura 4 describe la secuencia de ácido nucleico de melanopsina.

La Figura 5 describe la secuencia de ácido nucleico de ChR2 que está optimizado al codón de mamífero y que codifica una ChR2 fusionada con la proteína fluorescente verde (GFP).

La Figura 6 describe un fragmento de la secuencia de ácido nucleico regulador de la GRM6 (receptor de glutamato metabotróplco 6) capaz de regular la expresión de una manera específica de la célula bipolar.

La Figura 7 describe una secuencia de ácido nucleico regulador smCBA.

La Figura 8 describe: neuronas que expresan ChR2 y su activación. (A) neuronas que expresan ChR2 con estimulación de la luz; (B) neuronas activadas en respuesta a trenes de alta velocidad de los pulsos de luz azul.

La Figura 9 describe: entrega de AAV a las células bipolares de la retina. La columna 1 muestra la expresión de GFP en células bipolares de la retina después de una inyección subretiniana con el vector de AAV7-CBAGFP después de 8 semanas de edad. La columna 2 muestra la tinción PKCa (un anticuerpo que es específico para células bipolares), la columna 3 muestra la tinción DAPI para los núcleos celulares, y la columna 4 muestra imágenes fusionadas de la expresión de GFP, tinción de PKCa y DAPI. La primera fila es magnificación 2X y la segunda fila es magnificación 4X.

La Figura 1 describe: Expresión de la proteína fusionada ChR2-GFP en células bipolares de la retina rdl, rho -/-, y rd16. En cada imagen se muestra el epitelio del pigmento retiniano (RPE), células bipolares o capa nuclear interna (INL), la capa plexiforme Interna (IPL), y la capa de células ganglionares (GCL). Las áreas blancas brillantes muestran la expresión de GFP. Hay rizos de expresión en las células bipolares de la INL (excepto para la inyección intravítrea de AAVS).

La Figura 11 describe: el análisis de la expresión de EGFP en las secciones de retina congeladas mediante inmunohistoquímica 1 mes después de las inyecciones subretinianas con los vectores AAV mutantes de tirosina. Ejemplos de las secciones que representan la propagación y la intensidad de fluorescencia de EGFP en toda la retina después de la transducción con el serotipo 2 Y444 (a) o serotipo 8 Y733 (b). Las imágenes están orientadas con el vitreo hacia la parte inferior y la capa de fotorreceptores hacia la parte superior. Fluorescencia EGFP en los fotorreceptores, células RPE y ganglionares ojos de ratón inyectados subretinalmente con el serotipo 2 Y444 (c) fluorescencia EGFP en fotorreceptores, células de Muller y RPE después de la administración del serotipo 8 Y733 (d) procesos de detección de células de Muller (rojo) por inmunotinción con un anticuerpo de glutaminasintetasa (GS) (e) imagen fusionada que muestra la colocalización de fluorescencia EGFP (verde) y la tinción GS (rojo) en las secciones de la retina de los ojos tratados con serotipo 8 Y733 (f) Barra de calibración 11pM. gcl, capa de células ganglionares; ipl, capa plexiforme interna; inl, capa nuclear interna; onl, nuclear externa; os, segmento externo; rpe, epitelio pigmentario de la retina.

La Figura 12 describe: entrenamiento de ratones en un laberinto de agua. (A) Un diagrama esquemático del laberinto de agua utilizado para medir el umbral escotópico (Hayes y Balkema, 1993). (B) Tiempo que tardó cada grupo de ratones (retina degenerada - tratada, retina degenerada - no tratada, y de tipo salvaje) para encontrar el objetivo (plataforma negra + matriz de LED) como función de las sesiones de entrenamiento. (C) Tiempo que tardó cada grupo de ratones (tratados con rd1, tratados con rd16, tratados con rho - / -, retina degenerada no tratada, y el tipo salvaje) para encontrar el objetivo (plataforma negra + matriz de LED) como función de las diferentes intensidades de luz.

La Figura 13 describe: dispositivo similar a gafas asociado... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica una protema sensible a la luz unido operativamente a un fragmento de una secuencia reguladora del receptor de glutamato metabotrópico 6 (mGluR6), en el que el fragmento comprende la secuencia de la Figura 6 o una secuencia que es al menos un 8% Idéntica a la secuencia de la Figura 6, en el que el fragmento es de menos de 2. pares de bases, y en el que el ácido nucleico se encapsida dentro de un virus adenoasociado recombinante (AAV) de serotipo AAV2 que comprende una proteína de la cápside Y444F mutado o encapsidado dentro de una AAV recombinante de serotipo AAV8 que comprende una proteína de la cápside Y733F mutado y en el que el ácido nucleico es capaz de ser expresado específicamente en una célula bipolar de la retina.

2. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la proteína sensible a la luz se selecciona de entre el grupo que consiste en ChRI, ChR2, VChRI, ChR2 C128A, ChR2 C128S, ChR2 C128T, híbridos / quimeras ChR1-ChR2, ChD, ChEF, ChF, ChIEF, NpHR, eNpHR y melanopsina.

3. El ácido nucleico de la reivindicación 1 en donde la proteína sensible a la luz es ChR2 o una proteína sensible a la luz que es al menos un 7%, al menos un 8%, al menos un 9% o al menos un 95% idéntica a ChR2.

4. El ácido nucleico de la reivindicación 1 en el que el fragmento comprende menos de 1. pares de bases, menos de 75 pares de bases, menos de 5 pares de bases o menos de 25 pares de bases.

5. Un AAV que comprende el ácido nucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 encapsidado como se define en las reivindicaciones 1-4 para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que sufre de una enfermedad o trastorno del ojo, comprendiendo dicho método introducir dicho AAV en un ojo afectado.

6. El AAV para su uso de acuerdo con la reivindicación 5 en el que la enfermedad o trastorno está provocada por la degeneración de las células fotorreceptoras.

7. El AAV para su uso según la reivindicación 5 en el que el fragmento de secuencia reguladora mGluR6 está representado por la secuencia en la Figura 6.

8. El AAV para su uso según la reivindicación 5 en el que el AAV se introduce mediante inyección intravítrea, inyección subretiniana y / o desprendimiento de ILM.

9. El AAV para uso de acuerdo con la reivindicación 5 en el que el AAV se introduce en una célula bipolar de la retina.

1. El AAV para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el método comprende además utilizar un dispositivo de generación de luz externa al ojo.

11. El AAV que comprende el ácido nucleico recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 encapsidads como se define en las reivindicaciones 1-4 para su utilización en terapia.