Vectores mutacionales de oligodesoxinucleótidos de cadena sencilla.

Uso in vitro de un compuesto para realizar un cambio genético predeterminado en un gen cromosómico fijado como diana de una célula animal,

en el que el compuesto es un oligodesoxinucleótido de cadena sencilla que tiene un nucleótido del extremo 3', un nucleótido del extremo 5', que tiene al menos 25 desoxinucleótidos y no más de 65 desoxinucleótidos, y que tiene una secuencia que comprende al menos dos regiones cada una de al menos 8 desoxinucleótidos que son idénticas a al menos dos regiones, respectivamente, del gen cromosómico fijado como diana, regiones que, juntas, tienen al menos 24 nucleótidos de longitud, y regiones que están separadas por al menos un nucleótido en la secuencia del gen fijado como diana y en la secuencia del oligodesoxinucleótido por una región mutadora que tiene una secuencia que tiene la misma longitud que la secuencia que separa las regiones homólogas en la secuencia diana, pero que tiene una secuencia diferente.

Vectores mutacionales de oligodesoxinucleótidos de cadena sencilla.

1. CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a oligodesoxinucleótidos de cadena sencilla, a algunos derivados de los mismos y a métodos de su uso para introducir un cambio predeterminado en una ubicación predeterminada en un gen diana en una célula viva. La célula puede ser una célula de mamífero, insecto, pez, gusano o ave, en un medio de cultivo artificial o en un organismo, una célula bacteriana o una célula vegetal. El gen diana puede ser un gen cromosómico o un gen extracromosómico, es decir en un cromosoma artificial bacteriano.

2.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se han descrito técnicas de realización de un cambio predeterminado en una ubicación predeterminada en una secuencia de ácido nucleico diana de una célula. Estas técnicas utilizan las enzimas de la célula que conciernen a la reparación y a la recombinación homóloga del ADN. En estas técnicas se sintetiza un oligonucleótido o análogo de oligonucleótido que contiene dos regiones que tienen la secuencia del gen diana que flanquean a una región, denominada una "región mutadora", que difiere del gen diana. En esta solicitud dichos oligonucleótidos y análogos se denominarán de forma genérica "vectores mutacionales". Dichos vectores mutacionales pueden introducir cambios genéticos predeterminados en un gen diana mediante un mecanismo que se cree que implica recombinación homóloga y/o escisión y reparación de nucleótidos.

Las Patentes de Estados Unidos Nº 5.565.350 y Nº 5.731.181 de Kmiec describen vectores mutacionales que contienen cadenas complementarias en las que una primera cadena comprende análogos de ribonucleótidos que forman pares de bases de Watson-Crick con desoxirribonucleótidos de una segunda cadena. La Patente de Estados Unidos Nº 6.004.804 de Kumar y Metz describe ciertas mejoras en vectores mutacionales de cadena doble, que incluyen una variante en la que la región mutadora está presente solamente en una de las dos cadenas. Es uso de vectores mutacionales de tipo Kmiec en sistemas de mamíferos se describe en la Patente de Estados Unidos Nº

5.760.012 y, junto con vehículos macromoleculares, en la Publicación de Patente Internacional WO 98/49350 de Kren et al., y en la Solicitud de Patente de Estados Unidos relacionada Nº de Serie 09/108.006. Descripciones adicionales del uso de vectores mutacionales de tipo Kmiec pueden encontrarse en los documentos Cole-Strauss et al., 1996, Science 273: 1386; Kren et al., 1998, Nature Med. 4: 285; y Bandyopadhyay et al., 1999, J. Biol. Chem.

274: 10163.

El uso de vectores mutacionales de tipo Kmiec en células vegetales se describe en las Publicaciones de Patente Internacional WO 99/25853 de Pioneer Hi-Bred International, WO 99/07865 de Kimeragen, Inc. y WO 98/54330 de Zeneca Ltd. Las publicaciones científicas que describen el uso de vectores de tipo Kmiec en plantas incluyen los documentos Beetham et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8774 y Zhu, et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8768.

El uso de vectores mutacionales de tipo Kmiec y variantes de los mismos, que son de cadena doble, se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 6.004.804 de Kumar y Metz. La solicitud de Kumar y Metz enseña, entre otras cosas, que los vectores de tipo Kmiec y variantes de los mismos pueden usarse en células bacterianas.

El uso de oligodesoxinucleótidos de cadena sencilla como vectores mutacionales para realizar cambios en un gen cromosómico en la levadura, S. cerevisiae, se describió en informes del laboratorio del Dr. F. Sherman, Universidad de Yale. Moerschell et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 524-528 y Yamamoto et al., 1992, Yeast 8: 935-948. La longitud óptima de los vectores mutacionales usados en estos estudios era de 50 nucleótidos.

Un informe aislado del uso de un polinucleótido de cadena sencilla y de cadena doble de 160 nucleótidos en un intento de realizar alteraciones en un gen cromosómico puede encontrarse en el documento Hunger-Bertling, 1990, Mol. Cell. Biochem. 92: 107-116. Los resultados para polinucleótidos de cadena sencilla fueron ambiguos debido a que solamente se analizó el producto de los experimentos que usaban polinucleótidos de cadena doble.

El uso de un fragmento de ADN de cadena sencilla de 488 pares de bases para realizar cambios específicos en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística ha sido descrito por Goncz et al., 1998, Hum. Mol. Genetics 7: 1913; y Kunzelmann et al., 1996, Gene Ther. 3: 859.

Se usaron oligodesoxinucleótidos de cadena sencilla de aproximadamente 40 nucleótidos de longitud en células de mamífero como control para estudios de genes episomales en los que el oligodesoxinucleótido se unió covalentemente a un oligonucleótido que forma una triple cadena y que el oligodesoxinucleótido en solitario dio como resultado tasas de cambio genético predeterminado del gen episomal de aproximadamente 1 por 5 x 104, o menos. Chan et al., 1999, J. Biol. Chem. 74: 11541. Un informe anterior del uso de un oligodesoxinucleótido de

cadena sencilla para realizar cambios predeterminados en un gen episomal en una célula de mamífero se encuentra en el documento Campbell et al., 1989, The New Biologist 1: 223.

Un aspecto de la descripción se refiere a oligodesoxinucleótidos que han sido modificados mediante la unión de un colorante de indocarbocianina. Se sabe que los colorantes de indocarbocianina son excelentes fluoróforos. La síntesis de indocarbocianina P cianoetil N, N diisopropil fosforamiditas bloqueadas que son adecuadas para su uso en síntesis de nucleótidos en fase sólida se describe en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.556.959 y Nº

5.808.044.

Un segundo aspecto de la descripción se refiere a una composición que comprende un oligonucleótido de cadena sencilla que codifica un cambio genético predeterminado y a un vehículo macromolecular que comprende un ligando para un receptor en la superficie de la célula diana. Una composición que comprende una poli-L-lisina, un ligando para el receptor de asialoglucoproteínas y un oligodesoxinucleótido antisentido de entre 21 y 24 nucleótidos se describe en la Publicación de Patente Internacional WO 93/04701.

Un tercer aspecto de la descripción se refiere a una modificación de un oligodesoxinucleótido mediante la unión de un nucleótido unido en 3'-3'. La Patente de Estados Unidos Nº 5.750.669 enseña dicho oligodesoxinucleótido modificado.

La citación o identificación de cualquier referencia en la Sección 2, o en cualquier sección de esta solicitud no debe interpretarse como una admisión de que dicha referencia está disponible como técnica anterior a la presente invención.

3. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en el inesperado descubrimiento de que los oligodesoxinucleótidos de cadena sencilla, particularmente cuando se modifican apropiadamente o se colocan en una composición con un vehículo molecular adecuado, pueden ser tanto o más eficaces en la realización de cambios genéticos predeterminados a genes diana en células que la técnica anterior, es decir vectores mutacionales de tipo Kmiec. Un oligodesoxinucleótido de cadena sencilla adecuado para su uso de acuerdo con la presente invención se denomina en lo sucesivo en este documento un Vector Mutacional de Oligodesoxinucleótido de Cadena Sencilla o un SSOMV.

En una realización, la descripción proporciona una composición para su uso para realizar cambios en los genes cromosómicos de células animales, por ejemplo células de mamífero, constituida por el oligodesoxinucleótido que codifica el cambio genético y un vehículo macromolecular. El vehículo puede ser un policatión, una vesícula lipídica con núcleo acuoso o una nanoesfera lipídica. En una realización adicional que es adecuada para uso in vivo, el vehículo comprende además un ligando que se une a un receptor de la superficie celular que es internalizado, tal como un ligando para un receptor en un pozo recubierto de clatrina, por ejemplo, el receptor de asialoglucoproteínas, el receptor de ácido fólico o el receptor de transferrina. En realizaciones preferidas, el oligodesoxinucleótido se modifica mediante la unión de sustituyentes de bloqueo en 3' y 5' tales como un nucleótido citosina unido en 3'-3' y un colorante de indocarbocianina unido en 5. En una realización alternativa, la modificación puede consistir en la sustitución del enlace fosfodiéster internucleotídico más en 3 y/o más en 5' por un enlace no hidrolizable, tal como un enlace fosforotioatodiéster o un enlace fosforamidato.

En una segunda realización, la descripción proporciona... [Seguir leyendo]

1. Uso in vitro de un compuesto para realizar un cambio genético predeterminado en un gen cromosómico fijado como diana de una célula animal, en el que el compuesto es un oligodesoxinucleótido de cadena sencilla que tiene un nucleótido del extremo 3, un nucleótido del extremo 5, que tiene al menos 25 desoxinucleótidos y no más de 65 desoxinucleótidos, y que tiene una secuencia que comprende al menos dos regiones cada una de al menos 8 desoxinucleótidos que son idénticas a al menos dos regiones, respectivamente, del gen cromosómico fijado como diana, regiones que, juntas, tienen al menos 24 nucleótidos de longitud, y regiones que están separadas por al menos un nucleótido en la secuencia del gen fijado como diana y en la secuencia del oligodesoxinucleótido por una región mutadora que tiene una secuencia que tiene la misma longitud que la secuencia que separa las regiones homólogas en la secuencia diana, pero que tiene una secuencia diferente.

2. Uso de un compuesto para realizar un cambio genético predeterminado en un gen fijado como diana en una célula vegetal, en el que el compuesto es un oligodesoxinucleótido de cadena sencilla que tiene un nucleótido del extremo 3 y un nucleótido del extremo 5, que tiene al menos 21 desoxinucleótidos y no más de 55 desoxinucleótidos; y que tiene una secuencia que comprende al menos dos regiones cada una de al menos 8 desoxinucleótidos que son idénticas a al menos dos regiones, respectivamente, del gen fijado como diana, regiones que, juntas, tienen al menos 20 nucleótidos de longitud, y regiones que están separadas por al menos un nucleótido en la secuencia del gen fijado como diana y en la secuencia del oligodesoxinucleótido por una región mutadora que tiene una secuencia que tiene la misma longitud que la secuencia que separa las regiones homólogas en la secuencia diana, pero que tiene una secuencia diferente.

3. Uso in vitro de una composición para realizar un cambio genético predeterminado en un gen cromosómico fijado como diana de una célula animal, comprendiendo dicha composición;

(a) un compuesto para realizar un cambio genético predeterminado en un gen cromosómico fijado como diana de una célula animal, en el que el compuesto es un oligodesoxinucleótido de cadena sencilla que tiene un nucleótido del extremo 3, un nucleótido del extremo 5, que tiene al menos 25 desoxinucleótidos y no más de 65 desoxinucleótidos, y que tiene una secuencia que comprende al menos dos regiones cada una de al menos 8 desoxinucleótidos que son idénticas a al menos dos regiones, respectivamente, del gen cromosómico fijado como diana, regiones que, juntas, tienen al menos 24 nucleótidos de longitud, y regiones que están separadas por al menos un nucleótido en la secuencia del gen fijado como diana y en la secuencia del oligodesoxinucleótido por una región mutadora que tiene una secuencia que tiene la misma longitud que la secuencia que separa las regiones homólogas en la secuencia diana, pero que tiene una secuencia diferente, y;

(b) un vehículo macromolecular seleccionado entre el grupo constituido por

(i) una vesícula lipídica con núcleo acuoso, en la que el núcleo acuoso contiene el oligodesoxinucleótido de cadena sencilla,

(ii) una nanoesfera lipídica, que comprende una sal lipófila del oligodesoxinucleótido de cadena sencilla, y

(iii) un policatión que tiene un peso molecular medio de entre 500 daltons y 1, 3 Md en el que el policatión forma una sal con el oligodesoxinucleótido de cadena sencilla.

4. El uso de la reivindicación 3, en el que la longitud del oligodesoxinucleótido de cadena sencilla es al menos 31 desoxinucleótidos y no más de 59 desoxinucleótidos.

5. El uso de la reivindicación 3, en el que el vehículo macromolecular comprende además un ligando para un receptor internalizable de la célula, ligando que está fijado a la superficie del vehículo macromolecular.

6. El uso de la reivindicación 5, en el que el receptor se selecciona entre el grupo constituido por el receptor de asialoglucoproteína, el receptor de transferrina y el receptor del factor de crecimiento epidérmico.

7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el enlace internucleotídico unido al nucleótido del

extremo 3 y/o el nucleótido del extremo 5' es un enlace fosforotioato.

8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el hidroxilo 5 del nucleótido del extremo 5 está unido a un sustituyente de bloqueo en 5 y/o el hidroxilo 3 del nucleótido del extremo 3 está unido a un sustituyente de bloqueo en 3.

9. El uso de la reivindicación 8, en el que el sustituyente de bloqueo en 5 es un colorante de indocarbocianina N-hidroxialquilo sustituido y 3, 3, 3, 3-tetra sustituido, que está unido mediante un enlazador al hidroxilo 5 del nucleótido del extremo 5,

opcionalmente, el colorante de indocarbocianina y el enlazador juntos son una N-hidroxipropil, N-fosfatidilpropil 3, 3, 3, 3-tetrametil indomonocarbocianina; u opcionalmente en el que el enlace internucleotídico unido al nucleótido del extremo 3 es un enlace fosforotioato.

10. El uso de la reivindicación 8, en el que el sustituyente de bloqueo en 3 es un nucleótido de bloqueo que está unido e.

3. 3 al hidroxilo 3 del nucleótido del extremo 3.

11. El uso de la reivindicación 7, en el que el enlace internucleotídico unido al nucleótido del extremo 5 es un enlace fosforotioato y/o en el que el enlace internucleotídico unido al nucleótido del extremo 3 es un enlace fosforotioato o en el que un nucleótido de desoxicitidina o de timidina está unido e.

3. 3' al hidroxilo 3 del nucleótido del extremo 3 o ambos.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 2,

en el que el hidroxilo 5 del nucleótido del extremo 5 está unido a un sustituyente de bloqueo en 5 y el hidroxilo 3 del nucleótido del extremo 3 está unido a un sustituyente de bloqueo en 3 y;

en el que

(a) el sustituyente de bloqueo en 5 es un colorante de indocarbocianina N-hidroxialquilo sustituido y 3, 3, 3, 3tetra sustituido, que está unido mediante un enlazador al hidroxilo 5 del nucleótido del extremo 5, opcionalmente en el que el colorante de indocarbocianina y el enlazador juntos son una N-hidroxipropil, N-fosfatidilpropil 3, 3, 3, 3-tetrametil indomonocarbocianina; y

(b) el sustituyente de bloqueo en 3 es un nucleótido de bloqueo, opcionalmente desoxicitidina o timidina, que está unido e.

3. 3 al hidroxilo 3' del nucleótido del extremo 3 y; opcionalmente, el oligodesoxinucleótido de cadena sencilla tiene al menos 25 desoxinucleótidos y no más de 35 desoxinucleótidos de longitud.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 2 en el que

(a) el hidroxilo 5 del nucleótido del extremo 5 está unido a un sustituyente de bloqueo en 5 opcionalmente un colorante de indocarbocianina N-hidroxialquilo sustituido y 3, 3, 3, 3-tetra sustituido, que está unido mediante un enlazador al hidroxilo 5 del nucleótido del extremo 5; y

(b) el enlace internucleotídico unido al nucleótido del extremo 3 es un enlace fosforotioato.

14. El uso de la reivindicación 1 ó 3, en el que la célula animal se selecciona entre el grupo constituido por una célula de mamífero, una célula de ave, una célula de insecto, una célula de gusano y una célula de pez.

15. Una composición para uso en un método terapéutico de realizar un cambio genético predeterminado en un gen cromosómico fijado como diana en un tejido, opcionalmente el hígado, de un sujeto membrana, que comprende una cantidad eficaz de una composición, composición que comprende:

(a) un oligodesoxinucleótido de cadena sencilla que tiene un nucleótido del extremo 3, un nucleótido del extremo 5, que tiene al menos 25 desoxinucleótidos y no más de 65 desoxinucleótidos, y que tiene una secuencia que comprende al menos dos regiones cada una de al menos 8 desoxinucleótidos que son idénticas a al menos dos regiones, respectivamente, del gen cromosómico fijado como diana, regiones que, juntas, tienen al menos 24

nucleótidos de longitud, y regiones que están separadas por al menos un nucleótido en la secuencia del gen cromosómico fijado como diana y en la secuencia del oligodesoxinucleótido por una región mutadora que tiene una secuencia que tiene la misma longitud que la secuencia que separa las regiones homólogas en la secuencia diana, pero que tiene una secuencia diferente; y (b) un vehículo macromolecular seleccionado entre el grupo constituido por (i) una vesícula lipídica con núcleo acuoso, en la que el núcleo acuoso contiene el oligodesoxinucleótido de cadena sencilla, (ii) una nanoesfera lipídica, que comprende una sal lipófila del oligodesoxinucleótido de cadena sencilla, y (iii) un policatión que tiene un peso molecular medio de entre 500 daltons y 1, 3 Md en el que el policatión forma una sal con el oligodesoxinucleótido de cadena sencilla.