Vector dual para la inhibición del virus de la inmunodeficiencia humana.

Un vector de expresión que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico inhibidor capaz de reducir la expresión de un correceptor de VIH,

donde el ácido nucleico inhibidor es un ARN pequeño de interferencia (ARNpi) o un ARN de horquilla corta (ARNhc) que tienen una región bicatenaria, donde la región bicatenaria comprende una secuencia que es sustancialmente idéntica y complementaria a una secuencia de dicho correceptor de VIH, y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH.

Vector dual para la inhibición del virus de la inmunodeficiencia humana Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a los campos de biología molecular y de la virología. En particular, la invención se refiere a vectores de expresión útiles para el tratamiento y prevención de infecciones HIT.

Antecedentes de la invención

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es el agente causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en seres humanos, que hace que el sistema inmunitario falle y aumenta la probabilidad de muerte debido a infecciones oportunistas. La infección por VIH es un gran problema de salud global, tal como se evidencia por su denominación como pandemia por la Organización Mundial de la Salud. La mayoría de las personas que están infectadas por el VIH acaban desarrollando SIDA, que sesga las vidas de más de un millón de personas cada año.

Las terapias antirretrovirales, tales como HAART (terapia antirretroviral altamente activa), que incluye combinaciones de inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de nucleósidos, inhibidores de la proteasa, e inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleósidos, han disminuido de manera drástica las tasas de morbilidad y mortalidad causadas por el VIH/SDIA en las regiones del mundo donde está disponible la terapia. Sin embargo, HAART no cura o elimina completamente todos los síntomas del VIH/SIDA. HAART también está asociada con diversos efectos secundarios, así como con la aparición de cepas de VIH que son resistentes a los inhibidores retrovirales. Por estos motivos, así como el alto coste de HAART y la necesidad de una adhesión estricta, dicha terapia puede ser relativamente ineficaz para un gran número de pacientes.

El documento de Perez E.E. et al., (25), Clinical Immunology, vol.115, págs. 26-32 describe la supresión de la infección por VIH-1 de linfocitos T CD4 tras la transducción con un vector de lentivirus que codifica una proteína inhibidora de la fusión de VIH (C46).

Existe una necesidad en la técnica para desarrollar estrategias mejoradas para tratar y prevenir la infección por VIH. Sumario de la invención

La invención en su sentido más amplio es como se define en las reivindicaciones independientes.

La presente divulgación proporciona una nueva estrategia terapéutica para tratar y/o prevenir la infección por VIH en la que se usan como diana dos etapas diferentes en la infección viral mediante terapia génica. La presente invención proporciona un vector, tal como se describe en las reivindicaciones, que codifica un inhibidor de la entrada viral en una célula hospedadora y un inhibidor de la fusión viral. También se describe en el presente documento un vector que codifica un inhibidor de la replicación viral. Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona un vector de expresión, tal como se describe en las reivindicaciones, que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de un correceptor de VIH y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la fusión del VIH a la célula diana, en el que dicha primera secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a un primer promotor y dicha segunda secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a un segundo promotor. El vector de expresión puede ser un vector viral, tal como un vector retroviral o lentiviral. En algunas realizaciones, la primera y la segunda secuencia de ácido nucleico se transcriben a partir de un solo promotor. En una realización particular, hay presente un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) cadena arriba de la segunda secuencia de ácido nucleico.

En determinadas realizaciones, el vector de expresión comprende además una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la replicación viral. En algunas realizaciones, el tercer ácido nucleico está unido operativamente a un tercer promotor. En otras realizaciones, se transcriben dos de las tres secuencias de ácido nucleico a partir de un solo promotor (es decir, la primera y la segunda secuencia de ácido nucleico o la segunda y la tercera secuencia de ácido nucleico). En otras realizaciones adicionales, las tres secuencias de ácido nucleico se transcriben a partir de un solo promotor. Puede haber presentes uno o más IRES cadena arriba de la segunda y/o tercera secuencia de ácido nucleico.

De acuerdo con la invención, la primera secuencia de ácido nucleico del vector de expresión codifica un ARNpi o ARNhc, que se dirige a un correceptor de VIH. En algunas realizaciones, la molécula de ARNpi o ARNhc comprende una región bicatenaria que tiene una secuencia que es sustancialmente idéntica y complementaria a CCR5. En otras realizaciones, la molécula de ARNpi o ARNhc comprende una región bicatenaria que tiene una secuencia que es sustancialmente idéntica y complementaria a CXCR4.

De acuerdo con la invención, la segunda secuencia de ácido nucleico del vector de expresión codifica una proteína que inhibe la fusión del VIH a la célula diana. La proteína inhibidora de la fusión de VIH es una proteína C46 u otras

proteínas similares que inhiben la fusión del VIH a la superficie celular y se expresan por transgén para que estén situadas en la superficie celular (por ejemplo, T2 y sus proteínas relacionadas, enfuvirtida, CP32M, y sifuvirtida).

En otra realización más de la invención, el vector puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que inhibe la replicación del VIH. Por ejemplo, en algunas realizaciones, esta secuencia de ácido nucleico codifica una proteína TRIM5a o un derivado o fusión de la misma. En determinadas realizaciones, esta secuencia de ácido nucleico codifica una TRIM5a quimérica en la que el dominio amino terminal es de una proteína TRIM5a humana y el dominio PRYSPRY carboxilo terminal es de una proteína TRIM5a de mono rhesus. En otras realizaciones, esta secuencia de ácido nucleico codifica una proteína de fusión TRIM5-ciclofilina.

En una realización de la invención, el vector de expresión comprende una primera, una segunda y una tercera secuencia de ácido nucleico, en el que la primera secuencia de ácido nucleico codifica un ARNpi o ARNhc de correceptor de VIH (por ejemplo, ARNpi para CCR5 o CXCR4), la segunda secuencia de ácido nucleico codifica un inhibidor de la fusión (por ejemplo, C46), y la tercera secuencia de ácido nucleico codifica un inhibidor de la replicación del VIH (por ejemplo, una proteína TRIM5a o un derivado o fusión de la misma).

En algunas realizaciones de la invención, el inhibidor de un correceptor de VIH y el inhibidor de la fusión del VIH a la célula diana o el inhibidor de la replicación del VIH se expresan a partir de diferentes promotores en el vector de expresión. En una realización, el inhibidor de un correceptor de VH (por ejemplo, CCR5 o CXCR4) se expresa a partir de un promotor de ARN polimerasa III, mientras que el inhibidor de la fusión y/o replicación del VIH se expresa a partir de un promotor de ADN polimerasa II. Los dos inhibidores diferentes pueden expresarse en diferentes proporciones a partir de la construcción de expresión.

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los nuevos vectores de expresión tal como se describen en las reivindicaciones. También se describe un método para producir un vector de expresión viral que, cuando está presente en una célula, es capaz de inhibir la unión del VIH a la célula y evita la fusión del VIH a la célula o la replicación del VIH, comprendiendo este método sintetizar un ADNc de un gen que expresa una proteína capaz de prevenir la fusión del VIH a la célula o la replicación del VIH; clonar el ADNc sintetizado en un sitio de restricción en un vector viral; e insertar una unidad de expresión capaz de regular negativamente la expresión de un correceptor de VIH en un sitio de restricción ene I vector-

También se describe en el presente documento un método para tratar o prevenir la infección por VIH en un paciente. En una realización, una composición farmacéutica que comprende un vector de expresión de la invención es para su administración a un paciente. La administración de dicha composición puede conferir resistencia a la infección por las cepas trópicas R5 y X4 de VIH. En una realización, la composición farmacéutica es para su administración a un paciente humano. El paciente puede ser negativo a VIH o positivo a VIH. En algunas realizaciones, el paciente puede no haberse sometido previamente a terapia HAART, estar recibiendo terapia HAART, estar fracasando o haber fracasado la terapia HAART. En otras realizaciones, el paciente puede tener... [Seguir leyendo]

1. Un vector de expresión que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico inhibidor capaz de reducir la expresión de un correceptor de VIH, donde el ácido nucleico inhibidores un ARN pequeño de interferencia (ARNpi) o un ARN de horquilla corta (ARNhc) que tienen una región bicatenaria, donde la región bicatenaria comprende una secuencia que es sustancialmente idéntica y complementarla a una secuencia de dicho correceptor de VIH, y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de la fusión del VIH.

2. El vector de expresión de la reivindicación 1, donde el vector de expresión es un vector viral.

3. El vector de expresión de la reivindicación 2, donde el vector viral es un vector lentiviral o un vector retroviral.

4. El vector de expresión de la reivindicación 3, donde el vector lentiviral es autoinactivante.

5. El vector de expresión de la reivindicación 1, que comprende además una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un inhibidor de la unión viral del VIH a una célula diana o de la replicación viral del VIH.

6. El vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la proteína inhibidora de la fusión del VIH es una proteína C46, una proteína T2, enfuvirtida, CP32M o sifuvirtida.

7. El vector de expresión de la reivindicación 5, en el que el inhibidor de la replicación del VIH se selecciona del grupo que consiste en TRIM5a humana, TRIM5a de mono rhesus, TRIM5a quimérica, una proteína de fusión de TRIM5-ciclofilina humana, ciclofilina, ubiquitina E3, APOBEC3G y antígeno celular estromal de médula ósea 2 (BST-2).

8. El vector de expresión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dichas primera y segunda secuencias de ácido nucleico están unidas operativamente a un promotor.

9. El vector de expresión de la reivindicación 8, en el que dicho promotor es un promotor de ARN polimerasa II o de ARN polimerasa III.

1. El vector de expresión de la reivindicación 8, en el que dicha primera secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a un primer promotor y dicha segunda secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a un segundo promotor.

11. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que dicho primer promotor es un promotor de ARN polimerasa III y en el que dicho segundo promotor es un promotor de ARN polimerasa II.

12. El vector de expresión de la reivindicación 9 o de la reivindicación 11, en el que dicho promotor de ARN polimerasa III es un promotor de pol III de H1 y/o dicho promotor de ARN polimerasa II es un promotor de pol II de Ubiquitina C.

13. El vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho correceptor de VIH es CXCR4.

14. El vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho correceptor de VIH es CCR5.

15. El vector de expresión de la reivindicación 14, en el que el ARNhc tiene una secuencia de SEC ID N2:1.

16. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la célula hospedadora es un monocito, un macrófago, una célula mononuclear de sangre periférica, un linfocito T CD4+, un linfocito T CD8+ o una célula dendrítica.

17. Una célula progenitora/madre hematopoyética que comprende al vector de expresión de la reivindicación 14 o de la reivindicación 15.

18. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ARNhc que tiene una secuencia de SEC ID N2: 1 y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína C46, en el que dicha primera secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a un promotor de pol III de H1 y dicha segunda secuencia de ácido nucleico está unida operativamente a un promotor de pol II de ubiquitina C.

19. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un vector de expresión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o 18 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 19 para su uso en el tratamiento de un paciente infectado por VIH, o un paciente en riesgo de infección por VIH.

21. El vector de expresión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 o 18, o la composición 5 farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 19 para su uso en un método para tratar o prevenir la infección por VIH

en un paciente, comprendiendo el método transducir células hematopoyéticas con el vector de expresión, donde dichas células hematopoyéticas son linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, monocitos/macrófagos, o combinaciones de los mismos, y trasplantar dichas células hematopoyéticas transducidas al paciente, donde dichas células hematopoyéticas transducidas son resistentes a la infección por VIH.

22. El vector de expresión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14,15 o 18 para su uso en un método para tratar o prevenir la infección por VIH en un paciente, comprendiendo el método transducir células progenitoras/madre hematopoyéticas (HPSC) con el vector de expresión, y trasplantar dichas HPSC transducidas al paciente, donde dichas HPSC transducidas son resistentes a la infección por VIH.

23. El vector de expresión o la composición farmacéutica para su uso en un método para tratar o prevenir la infección por VIH en un paciente de acuerdo con la reivindicación 21 o la reivindicación 22, en donde el paciente:

a) no se ha expuesto previamente a HAART;

b) está recibiendo un régimen de HAART; o

c) está fracasando o ha fracasado en un régimen HAART.