Variantes de fitasa de Hafnia.

Método para producir una variante de fitasa de una fitasa de referencia o progenitora,

con propiedades mejoradas con respecto al perfil de pH y con al menos 90 % de identidad con SEQ ID N.º:2, donde dicha variante muestra al menos una sustitución, inserción o deleción en una o varias de las posiciones: 92, 48, 26, 45, 49, 68, 100, 162, 217, 228, 304, 308 y 358, donde las posiciones corresponden a las posiciones de la fitasa con los aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.º:2, el método comprende

a) mutación del ADN o gen que codifica la fitasa progenitora de una manera por la cual el ADN o el gen codifican para dicha sustitución, inserción y/o deleción,

b) conexión operativa de dicho ADN o gen a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la fitasa en un huésped de expresión adecuado para crear un constructo de ADN o un vector de expresión recombinante,

c) transferencia de dicho constructo o vector a un huésped adecuado,

d) cultivo de dicho huésped para producir la variante de fitasa y

e) recuperación de la fitasa.

Variantes de fitasa de Hafnia

Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a una fitasa que tiene al menos 90% de identidad con una fitasa derivada de Hafnia alvei, cuya secuencia de aminoácidos se muestra en el listado de secuencias anexo como SEQ ID N.°: 2 y comprende al menos una modificación tal y como se define en las reivindicaciones anexas en comparación con esta fitasa (es decir, es una variante de la misma). La invención también se refiere al ADN que codifica estas fitasas, constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huéspedes que comprenden los polinucleótidos al igual que métodos de su producción, al igual que su uso, por ejemplo, en alimento para animales y aditivos de alimento para animales.

Antecedentes de la invención

Estado de la técnica

[0002] Las fitasas son enzimas bien conocidas, como lo son las ventajas de añadirlas a productos alimenticios para animales, incluidos seres humanos. Las fitasas se han aislado de muchas fuentes, incluidas varias cepas fúngicas y bacterianas.

[0003] Un objeto de la presente invención es proporcionar polipéptidos alternativos con actividad de fitasa (fitasas) y polinucleótidos que codifiquen los polipéptidos. Las variantes de fitasa de la invención exhiben propiedades modificadas o alteradas preferiblemente mejoradas en comparación con la fitasa progenitora. Ejemplos no limitativos de tales propiedades son: estabilidad (tal como estabilidad del ácido, estabilidad térmica, estabilidad de vapor, estabilidad de granulación y/o estabilidad de proteasa, en particular estabilidad de pepsina), perfil de temperatura, perfil de pH, actividad específica, especificidad de sustrato, rendimiento en alimento para animales (tal como una liberación y/o degradación mejoradas de fitato), susceptibilidad para glicación y/o modelo de glicosilación.

[0004] Se conocen varias estructuras tridimensionales de fitasas del tipo fosfato de ácido de histidina (HAP). (por ejemplo, Lim et al. Nature struct. biol. 7, 108-113 (2000). Estas fitasas están estructuralmente relacionadas, pero hay diferencias bastante grandes en las secuencias de aminoácidos.

[0005] W02008116878 divulga la secuencia de aminoácidos de la fitasa HAP de tipo salvaje de Hafnia alvei DSM 19197 (es decir, SEQ ID N.°:2 en la presente), como SEQ ID N.°:10 en WO2008116878. La estructura tridimensional de la fitasa HAP de tipo salvaje de Hafnia alvei DSM 19197 también está descrita en W02008116878. La estructura se corresponde correctamente con las estructuras conocidas.

[0006] Es un objeto de la invención proporcionar fitasas de propiedades modificadas, preferiblemente, mejoradas en comparación con la fitasa progenitora o de referencia de las cuales éstas fueron derivadas.

Resumen del listado de secuencias

[0007] En el listado de secuencias, SEQ ID N.°:1 y 2 proporcionan ADN y secuencias de aminoácidos para la fitasa de Hafnia alvei DSMZ 19197.

Resumen de ejemplos

[0008] En la especificación se proporcionan los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1: preparación de variantes y determinación de actividad

Ejemplo 2: actividad específica

Ejemplo 3: estabilidad de temperatura

Ejemplo 4: termoestabilidad

Ejemplo 5: perfil de temperatura

Ejemplo 6: perfil de pH

Ejemplo 7: estabilidad de vapor

Ejemplo 8: actividad residual de glicación

Ejemplo 9: pruebas de estabilidad de granulación

Ejemplo 10: rendimiento en el alimento para animales en un modelo in vitro para pollo para consumo Ejemplo 11: rendimiento en una prueba de cerdo in vivo

Resumen de la invención

[0009] La presente invención se refiere a un método para producir una variante de la fitasa de una fitasa de referencia o progenitora, con propiedades mejoradas con respecto al perfil de pH y teniendo al menos 90% de identidad con SEQ ID N.°:2, donde dicha variante muestra al menos una sustitución, inserción o deleción en una o más de las posiciones: 92, 48, 26, 45, 49, 68, 100, 162, 217, 228, 304, 308, y 358, donde las posiciones corresponden a las posiciones de la fitasa con los aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.°:2. El método comprende

a) mutación del ADN o gen que codifica la fitasa progenitora de una manera que por la cual el ADN o el gen codifican para dicha sustitución, inserción y/o deleción,

b) la conexión operativa de dicho ADN o gen a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la fitasa en un huésped de expresión adecuado para crear un constructo de ADN o un vector de expresión recombinante,

c) transferencia de dicho constructo o vector a un huésped adecuado,

d) cultivo de dicho huésped para producir la fitasa variante y recuperación de la fitasa.

[0010] La invención además se refiere a una variante de fitasa con al menos 90% de identidad a SEC ID NO:2 y

teniendo propiedades mejoradas respecto al perfil de pH como se determina a 37°C midiendo la actividad relativa hasta la actividad máxima, se mejora en comparación con el perfil de pH de la fitasa de SEC ID NO:2, y producida según el método indicado arriba, con la condición de que la fitasa no sea la fitasa de Hafnia alvei con los aminoácidos 1-413 de SEC ID NO:2 y que comprenden al menos una modificación en al menos una posición seleccionada de las siguientes: 92, 48, 26, 45, 49, 68, 100, 162, 217, 228, 304, 308, y 358; y al menos otra modificación en al menos una posición seleccionada de las siguientes: 1, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 16, 18, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40,

41, 45, 48, 49, 54, 55, 59, 63, 64, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 89, 91, 92, 93, 95, 96, 97,

98, 100, 101, 103, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 128, 130,

131, 132, 133, 134, 136,137.138, 139, 140, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158,

159, 160, 161, 162, 163, 168, 172, 173, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 189, 190, 192,

193, 194, 195, 196, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 211, 215, 217, 219, 221, 224, 227, 228,

230, 233, 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 251, 256, 258, 259, 260, 261, 266,

268, 270, 279, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 301, 303, 304, 308, 310, 312,

313, 314, 316, 318, 319, 320, 322, 324, 325, 326, 331, 335, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 354, 355, 356, 358, 360, 362,

363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 378, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390,

391, 394, 395, 396, 397, 400, 401, 403, 404, 406, 408, 409, 411, 412, y 413, con la condición de que la fitasa no sea la fitasa con los aminoácidos 1-413 de SEC ID NO:2..

[0011] La invención específicamente se refiere a un método como se ha indicado anteriormente, donde las modificaciones son seleccionadas de las siguientes sustituciones o inserciones: 92Y, 48H,W,N, 26R,Q,H, 49L, 100W, 162N.R, 217S.G, 304V, 308A, y 358C.

[0012] La variante de fitasa de la invención puede comprender al menos una modificación seleccionada de las siguientes: 228C, 325C, 358C, y 363C, o al menos un conjunto de modificaciones seleccionadas de las siguientes: 325C/358C, y 228C/363C.

[0013] Las variantes de fitasa descritas presentan propiedades modificadas o alteradas preferiblemente mejoradas en comparación con la fitasa progenitora. Ejemplos no limitativos de tales propiedades son: estabilidad (tal como estabilidad al ácido, estabilidad térmica, estabilidad de vapor, y/o estabilidad de proteasa, en particular estabilidad de pepsina), perfil de temperatura, perfil de pH, actividad específica, especificidad de sustrato, rendimiento en alimento para animales (tal como una liberación mejorada y/o degradación de fitato), susceptibilidad a glicación, y/o modelo de glicosilación. Las variantes de fitasa de la invención presentan propiedades mejoradas respecto al perfil de pH.

[0014] La invención también se refiere a ADN que codifica estas fitasas, métodos de su producción, al igual que el uso de los mismos, por ejemplo, en el alimento para animales y aditivos de alimento para animales.

Descripción detallada de la invención

[0015] En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para producir una variante de fitasa de una fitasa de referencia o progenitora, con propiedades mejoradas con respecto al perfil de pH y con al menos 90 % de identidad con SEQ ID N.°:2, donde dicha variante muestra al menos una sustitución, inserción o deleción en una o más de... [Seguir leyendo]

1. Método para producir una variante de fitasa de una fitasa de referencia o progenitora, con propiedades mejoradas con respecto al perfil de pH y con al menos 90 % de identidad con SEQ ID N.°:2, donde dicha variante muestra al menos una sustitución, inserción o deleción en una o varias de las posiciones: 92, 48, 26, 45, 49, 68, 100, 162, 217, 228, 304, 308 y 358, donde las posiciones corresponden a las posiciones de la fitasa con los aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.°:2, el método comprende

a) mutación del ADN o gen que codifica la fitasa progenitora de una manera por la cual el ADN o el gen codifican para dicha sustitución, inserción y/o deleción,

b) conexión operativa de dicho ADN o gen a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la fitasa en un huésped de expresión adecuado para crear un constructo de ADN o un vector de expresión recombinante,

c) transferencia de dicho constructo o vector a un huésped adecuado,

d) cultivo de dicho huésped para producir la variante de fitasa y

e) recuperación de la fitasa.

2. Método según la reivindicación 1, donde las modificaciones son seleccionadas de las siguientes sustituciones o inserciones:. 92Y, 48H,W,N, 26R,Q,H, 49L, 100W, 162N.R, 217S.G, 304V, 308A, y 358C.

3. Variante de fitasa con al menos 90% de identidad con SEQ ID N.°:2 y con propiedades mejoradas con respecto al perfil de pH según se determiina a 37° C, midiendo la actividad con respecto a la actividad máxima, es mejorada en comparación con el perfil de pH de la fitasa de SEQ ID N°:2 y producida según la reivindicación 1 o 2 con la condición de que la fitasa no sea la fitasa de Hafnia alvei con los aminoácidos 1-413 de SEQ ID N.°:2

4. Fitasa según la reivindicación 3, que comprende al menos una modificación seleccionada de las siguientes: 228C, 325C, 358C, y 363C.

5. Fitasa según la reivindicación 4, que comprende al menos un conjuntos de modificaciones seleccionado de las

siguientes: 325C/358C y 228C/363C.

6. Fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 3-5, que comprende al menos una modificación seleccionada de 1, 4,

5, 6, 7, 9, 10, 12, 16, 18, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 37 ,38, 39, 40, 41, 45, 48, 49, 55, 59, 64, 68, 69, 70, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 89, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98, 100, 103, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 128, 130, 131, 132, 133, 134, 136, 137 ,138, 140, 144, 145, 146, 147, 148,

149, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 168, 173, 175, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187,

189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 198, 199, 200, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 211, 215, 217, 219, 221, 227,

230, 233, 234, 235, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 251, 256, 258, 260, 261, 266, 268, 270,

279, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 301, 303, 304, 308, 310, 312, 313, 314,

316, 318, 319, 320, 322, 324, 335, 344, 345, 346, 347, 348, 354, 355, 356, 360, 362, 364, 365, 366, 367, 369, 371, 372,

373, 375, 376, 378, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 394, 395, 396, 397, 400, 401, 403, 404, 406, 408,

409, 411, 412 und 413:.

7. Fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 3-6, que comprende al menos una modificación seleccionada de las siguientes: 49L.

8. Fitasa según la reivindicación 3-7, que comprende al menos una modificación seleccionada de las siguientes: T35C, P36C, F63C, L172C, S177C, P178C, F224C, H228C, A236C, Q326C, P331C, T358C, L368C, y A374C.

9. Fitasa según la reivindicación 8, que comprende al menos un conjunto de modificaciones seleccionadas de las siguientes: F8C/D343C, P178C/D33C, F63C/L368C, F224C/A236C, P331C/Q326C, T358C/G325C, H228C/H363C, and L368C/A374C.

10. Fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 7-9, que comprende al menos una modificación seleccionada de la siguiente:. I49L.

11. Fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 6-10, que comprende al menos una modificación seleccioinada de las siguientes: Q162N, and A304V.

12. Secuencia de ácidos nucleicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 3-11.

13. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 12 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la fitasa en un huésped de expresión adecuado.

14. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 13.

15. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 13 y/o el vector de expresión según la reivindicación 14.

16. Composición que comprende al menos una fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 3-11 y

(a) al menos una vitamina liposoluble;

(b) al menos una vitamina hidrosoluble y/o

(c) y/o al menos un oligoelemento.

17. Composición según la reivindicación 16 que comprende además al menos una enzima seleccionada del siguiente grupo de enzimas: amilasa, fitasa, fosfatasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa y/o beta- glucanasa.

18. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 16-17 que es un aditivo de pienso.

19. Método para producir un producto de fermentación, que comprende (a) fermentación usando un microorganismo termentador de un material que contiene carbohidrato en presencia de una fitasa según cualquiera de las reivindicaciones 3-11 y (b) producción del producto de fermentación o coproducto de fermentación del material que contiene carbohidrato fermentado.

20. Método según la reivindicación 19, carecterizado por el hecho de que el producto de fermentación es etanol, cerveza, vino, o granos secos de destilería (DDG).