Vacunas combinadas contra Neisseria meningitidis.

Una composición inmunogénica que comprende sacáridos capsulares de :

a) al menos los grupos serológicos A y C de N.meningitidis, en donde la proporción (p/p) de sacárido MenA:sacárido MenC es mayor que 1; y/o b) grupo serológico Y y uno o ambos de los grupos serológicos C y W135, en donde la proporción (p/p) de sacárido MenY:sacárido MenW135 es mayor que 1 y/o la proporción (p/p) de sacárido MenY:sacárido MenC es menor de 1; y en donde los sacáridos capsulares están conjugados con proteína(s) vehículo.

Campo técnico [0001] La presente invención pertenece al campo de las vacunas, en particular frente a la infección y enfermedad por meningococos.

Técnica anterior

Neisseria meningitidis es un patógeno humano Gram negativo. Coloniza la faringe, provocando meningitis y, ocasionalmente, septicemia en ausencia de meningitis. Está estrechamente relacionado con N. gonorrhoeae, aunque una característica que diferencia meningococos claramente es la presencia de una cápsula de polisacáridos que está presente en todos los meningococos patógenos.

Se han identificado doce grupos serológicos de N. meningitidis (A, B, C, H, I, K, L, 29E, W135, X y Z) de acuerdo con el polisacárido capsular del organismo. El grupo A es el patógeno implicado más frecuentemente en enfermedades epidémicas en el África sub-Sahariana. Los grupos serológicos B y C son responsables de la gran mayoría de casos en EE. UU. Y en la mayoría de países desarrollados. Los grupos serológicos W135 e Y son responsables de los casos restantes en EE.UU. y países desarrollados.

Los polisacáridos capsulares de N. meningitidis se preparan generalmente mediante un procedimiento que comprende las etapas de precipitación del polisacárido (p.ej. utilizando un detergente catiónico) , fraccionamiento en etanol, extracción fría de fenol (para eliminar proteínas) y ultracentrifugación (para eliminar LPS) [p.ej. referencia 1].

Una vacuna tetravalente de los polisacáridos de los grupos serológicos A, C, Y, y W135 se conoce hace años [2, 3] y se ha autorizado para uso humano. Aunque efectiva en adolescentes y adultos, induce una respuesta inmune pobre y corta duración de la protección y no se puede utilizar en niños [p.ej. 4]. Esto es porque los polisacáridos son antígenos independientes de la célula T que inducen una respuesta inmune débil que no se puede estimular. Los polisacáridos en esta vacuna no están conjugados y están presentes a una relación 1:1:1:1 [5] MENCEVAX ACWYTM contiene 50 µg de cada polisacárido purificado una vez reconstituido de su forma liofilizada.

Se han aprobado también los oligosacáridos del grupo serológico C conjugados para su utilización en humanos [p.ej. MenjugateTM; referencia 6]. Sin embargo, se mantiene la necesidad de realizar mejoras en las vacunas conjugadas contra los grupos serológicos A, W135 e Y, y en su manufactura.

Descripción de la invención [0007] La invención proporciona composiciones inmunogénicas de acuerdo con la reivindicación 1 y procedimientos de acuerdo con la reivindicación 8.

La divulgación proporciona un procedimiento para la purificación de un polisacárido capsular bacteriano, que comprende las etapas de (a) precipitación de dicho polisacárido, seguida de (b) disolución del polisacárido precipitado utilizando etanol. El polisacárido se puede utilizar para preparar vacunas, tales como vacunas conjugadas, en particular contra los grupos serológicos A, W135 e Y de N. meningitidis.

Precipitación y disolución por etanol

Se conocen en el campo muchas técnicas para la precipitación de polisacáridos solubles. Los procedimientos preferidos utilizan uno o más detergentes catiónicos. Los detergentes tienen preferiblemente la siguiente fórmula general:

en la que:

R1, R2 y R3 son iguales o diferentes y cada uno significa alquilo o arilo; o R1 y R2 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico saturado de 5-ó 6-miembros, y R3 significa

alquilo o arilo; o R1, R2 y R3 junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico de 5-ó 6-miembros insaturado en el átomo de nitrógeno,

R4 significa alquilo o arilo, y

X− significa un anión.

Los detergentes preferidos particularmente para la utilización en el procedimiento son sales de tetrabutilamonio y cetiltrimetilamono (p. ej. las sales de bromuro) . Se prefiere particularmente el bromuro de cetiltrimetilamonio (“CTAB”) [8]. CTAB se conoce también como bromuro de hexadeciltrimetilamonio, bromuro de cetrimonio, Cetavlon y Centimida. Otros detergentes incluyen bromuro de hexadimetrina y sales de miristiltrimetrilamonio.

Los polisacáridos capsulares se liberan al medio durante el cultivo. Por consiguiente, el material de partida para la precipitación será generalmente el sobrenadante de un cultivo bacteriano centrifugado o será un cultivo concentrado.

La etapa de precipitación puede ser selectiva para polisacáridos, pero se coprecipitarán generalmente otros componentes (p. ej. proteínas, ácidos nucleicos, etc.) .

El polisacárido precipitado se puede recoger por centrifugación antes de su disolución.

Tras su precipitación, el polisacárido (típicamente en la forma de un complejo con el detergente catiónico) se disuelve. Se prefiere la utilización de un disolvente que sea relativamente selectivo para los polisacáridos con el fin de minimizar los contaminantes (p. ej. proteínas, ácidos nucleicos, etc.) . Se ha encontrado que el etanol es ventajoso a este respecto, y es altamente selectivo para el complejo CTAB-polisacárido. Se pueden utilizar otros alcoholes inferiores (p. ej. metanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butan-1-ol, butan-2-ol, 2-metil-propan-1-ol, 2-metilpropan-2-ol, dioles, etc.) .

Preferiblemente se añade etanol al polisacárido precipitado para obtener una concentración final de etanol (en base al contenido total de etanol y agua) de entre el 50% y 95% (p. ej. alrededor del 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, o alrededor del 90%) , y preferiblemente entre 75% y 95%. La concentración final óptima de etanol puede depender del grupo serológico de la bacteria de la que se obtiene el polisacárido.

El etanol se puede añadir al polisacárido precipitado en forma pura o se puede añadir en una forma diluida con un disolvente miscible (p. ej. agua) . Las mezclas de disolventes preferidas son mezclas de etanol: agua, en una relación preferida de entre alrededor de 70:30 y alrededor de 95:5 (p. ej. 75:25, 80:20, 85:15, 90:10) .

Comparado con el procedimiento convencional para preparar polisacáridos capsulares, el procedimiento de precipitación en dos etapas seguido por extracción con etanol es más rápido y más simple.

Contrastando con el procedimiento descrito en la referencia 9, el procedimiento utiliza detergentes catiónicos en lugar de detergentes aniónicos. A diferencia del procedimiento de la referencia 10, el polisacárido se redisuelve utilizando etanol, en lugar de por intercambio de cationes utilizando sales de calcio o magnesio. A diferencia del procedimiento de la ref. 11, la precipitación no requiere un soporte inerte poroso. Además, a diferencia de los procedimientos anteriores del campo, se utiliza alcohol para redisolver el polisacárido en lugar de precipitarlo.

El polisacárido capsular bacteriano será generalmente de Neisseria. Preferiblemente de N. meningitidis, que incluye los grupos serológicos A, B, C, W135 e Y. Los grupos serológicos preferidos son A, W135 e Y.

El procedimiento es válido también para preparar polisacáridos capsulares de Haemophilus influenzae (particularmente tipo B, o “Hib”) o Streptococcus pneumoniae (neumococo) .

Procesamiento adicional del polisacárido disuelto [0021] El polisacárido se puede tratar adicionalmente para eliminar contaminantes tras su disolución. Esto es particularmente importante en situaciones en las que incluso una contaminación menor no es aceptable (p. ej. para la producción de vacunas humanas) . Esto requerirá generalmente uno o más etapas de filtración.

Se puede utilizar filtración de profundidad. Ésta es particularmente útil para la clarificación.

Se puede utilizar filtración a través de carbón activado. Ésta es útil para eliminar pigmentos y trazas de compuestos orgánicos. Se puede repetir hasta, por ejemplo, DO275nm< 0, 2.

Se puede utilizar filtración por tamaño o ultrafiltración.

Una vez filtrado para eliminar contaminantes, el polisacárido se puede precipitar para su tratamiento adicional y/o procesamiento. Esto se puede llevar a cabo convenientemente por intercambio de cationes (p. ej. por la adición de calcio o sales de sodio) .

El polisacárido se puede modificar químicamente. Por ejemplo, se puede modificar para reemplazar uno o más grupos hidroxilo con grupos bloqueantes. Esto es particularmente útil para MenA [12]. Los polisacáridos del grupo serológico B se pueden N-propionilar [13].

El polisacárido (modificado opcionalmente) se hidrolizará generalmente para formar oligosacáridos. Esto se realiza preferiblemente para dar un grado medio final de polimerización (GP)... [Seguir leyendo]

1. Una composición inmunogénica que comprende sacáridos capsulares de : a) al menos los grupos serológicos A y C de N.meningitidis, en donde la proporción (p/p) de sacárido MenA:sacárido MenC es mayor que 1; y/o b) grupo serológico Y y uno o ambos de los grupos serológicos C y W135, en donde la proporción (p/p) de sacárido MenY:sacárido MenW135 es mayor que 1 y/o la proporción (p/p) de sacárido MenY:sacárido MenC es menor de 1; y en donde los sacáridos capsulares están conjugados con proteína (s) vehículo.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde los sacáridos capsulares son oligosacáridos.

3. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la composición comprende sacáridos de los grupos serológicos C e Y.

4. La composición de cualquier reivindicación anterior, en donde la composición comprende sacáridos de los grupos serológicos C, W135 e Y.

5. La composición de cualquier reivindicación anterior, en donde la composición comprende sacáridos de los serogrupos A, C, W135 e Y.

6. La composición de la reivindicación 5, en donde las proporciones (p/p) para los sacáridos de los grupos serológicos A:C:W135:Y son 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2; o 2:2:2: 1.

7. El procedimiento de cualquier reivindicación anterior, en donde la composición comprende además proteínas del grupo serológico B.

8. Un procedimiento para hacer una composición inmunogénica que comprende:

purificar un polisacárido capsular bacteriano, que comprende los pasos de (i) precipitación del polisacárido, seguido por (ii) solubilización del polisacárido precipitado usando un alcohol; y mezclar con antígenos de sacáridos de cepas de N.meningitidis A, C, W135 y/o Y para proporcionar una composición inmunogénica que comprende sacáridos capsulares de: a) al menos los grupos serológicos A y C de N.meningitidis, en donde la proporción (p/p) de sacárido MenA: sacárido MenC es mayor que 1; y/o b) serogrupo Y y uno o ambos de los grupos serológicos C y W135, en donde la proporción (p/p) de sacárido MenY:sacárido MenW135 es mayor que 1 y/o la proporción (p/p) de sacárido MenY:sacárido MenC es menor de 1; y en donde los sacáridos capsulares están conjugados con proteína (s) vehículo.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en donde el polisacárido capsular bacteriano es de N.meningitidis.

10. El procedimiento de la reivindicación 8, en donde el polisacárido capsular bacteriano es de Haemophilus influenzae o Streptococcus pneumoniae.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 8-10, que comprende además el paso de hidrólisis del polisacárido capsular bacteriano para formar oligosacáridos.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 8-11, que comprende además el paso de conjugación del polisacárido capsular bacteriano con una proteína vehículo.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 8-12, que comprende además el paso (s) de formulación de vacuna.

14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 8-13, en donde el paso (s) de formulación de vacuna comprende mezclas el antígeno (s) de sacáridos con un adyuvante.