Ungulados inmunodeprimidos.

Un método de prueba de la respuesta inmunitaria de un animal a un antígeno que comprende proveer un animal porcino genéticamente modificado que carece de expresión de la inmunoglobulina de la cadena pesada porcina funcional del antígeno y evaluar una respuesta del animal al antígeno,

en el que el porcino tiene una alteración elegida como diana en ambos alelos de la región de unión J6 de la cadena pesada porcina, que produce una ausencia de producción de linfocitos B en el porcino.

Ungulados inmunodeprimidos Descripción

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Se desvelan animales, en particular animales porcinos, tejido y órganos, además de células y líneas celulares derivadas de tales animales que carecen de expresión de inmunoglobulinas endógena funcional. Estos animales son útiles para el desarrollo de nuevos agentes farmacéuticos y biológicos. Además, se desvelan métodos para preparar tales animales.

ANTECEDENTES

Se necesitan modelos para estudiar ciertas características de enfermedad. En la investigación de enfermedades infecciosas y el desarrollo de vacunas, es importante estudiar la respuesta inmunitaria celular y humoral, ambas juntas y por separado. Un informe de 2006 por la Organización Mundial de la Salud estableció "Hay evidencia que sugiere que tanto las respuestas inmunitarias celulares como humorales contribuyen a la protección en seres humanos, y así es necesario el desarrollo de métodos de laboratorio y modelos animales para la evaluación de nuevas vacunas/combinaciones de pertussis acelular que detecten ambos tipos de respuesta inmunitaria".

Los ratones son el modelo animal de investigación más comúnmente usado ya que son fáciles de mantener, se reproducen fácilmente y son menos caros de alojar y cuidar que modelos animales grandes. Además, la capacidad para modificar fácilmente genéticamente el genoma del ratón ha permitido la creación de muchas líneas de ratón con fenotipos específicos que son útiles para investigación (Malakoff, 2000) . Hay numerosos modelos de ratón inmunodeficiente existentes.

Los ratones inmunodeficientes con mutaciones espontáneas se caracterizaron por primera vez en 1966-68 (nude) y 1983 (scid) . La mutación nude produce un fallo de la mayoría de los linfocitos T para desarrollarse a partir de sus células precursoras tímicas, aunque están presentes algunos linfocitos T, linfocitos B y linfocitos NK. Por tanto, el ratón nude no es un ratón inmunológicamente inerte, aunque se ha usado ampliamente en investigación. Los ratones homocigóticos para la mutación scid (ratones SCID) no tienen linfocitos B o T, sin embargo tienen linfocitos NK. Además, frecuentemente tienen un fenotipo "con fugas" en el que se producen inmunoglobulinas (Bosma et al. (1989) Curr Top Microbiol Immunol 152, 1-263, Bosma & Carroll, (1991) Ann. Rev. Immunol. 9, 323-350) . También se ha desarrollado un ratón deficiente en Rag-1 o Rag-2 (Mombaerts et al., (1992) Cell 68, 869-877, Shinkai, et al. (1992) Cell 68, 855-867, documento US 5859307) . Los ratones deficientes en Rag-1 y Rag-2 no pueden iniciar el reordenamiento V (D) J y, por tanto, carecen de linfocitos maduros. Se han usado ratones mutantes SCID y nulos en Rag-1 y Rag-2 ampliamente en estudios con ratones atímicos deficientes en linfocitos T en protocolos de preacondicionamiento, trasplante y exposición a patógenos.

Una forma de la que el cuerpo reacciona a antígenos es produciendo anticuerpos. Los anticuerpos (también llamados inmunoglobulinas o "Ig") son proteínas que se fabrican por los linfocitos B y circulan en la sangre para detectar antígenos extraños. Cuando un vertebrado se encuentra por primera vez con un antígeno, presenta una respuesta inmunitaria humoral primaria, en la que se activan linfocitos B, que generan anticuerpos altamente específicos para el antígeno y se diferencian en células "efectoras" para secretar los anticuerpos. Si el animal se encuentra con el mismo antígeno de nuevo después de un corto tiempo, la respuesta inmunitaria es más rápida y tiene una mayor magnitud que la primera respuesta. El encuentro inicial hace que ciertos linfocitos B proliferen y se diferencien. Los linfocitos de progenie incluyen no solo células efectoras, sino también células de memoria, que retienen la capacidad para producir células efectoras tras la posterior estimulación por el antígeno original. Las células efectoras viven durante solo algunos días, pero las células de memoria seguirán activas durante un periodo prolongado, incluso durante toda la vida del animal, y pueden ser reactivadas por una segunda estimulación con el mismo antígeno. Así, cuando se encuentran de nuevo con un antígeno, las células de memoria producen rápidamente células efectoras, que rápidamente producen anticuerpos.

Para examinar la función de los linfocitos B en respuestas inmunitarias, se han hecho ratones deficientes en linfocitos B por agotamiento de anticuerpos (Gordon, 1979) , reconstitución de linfocitos T de ratones SCID (Ronchese y Hausmann, 1993; Sunshine et al., (1991) J Exp Med 174, 1653-1656) , o por rotura genética del locus de Ig (Kitamura et al., (1991) Nature 350, 423-426; Jakobovits et al., (1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90, 2551-2555; Chen et al., (1993) Int Immunol 5, 647-656) .

El uso de ratones deficientes en linfocitos B, en estudios paralelos con ratones no mutantes, ratones SCID, nulos en Rag-1 o Rag-2, ha permitido estudiar respuestas de linfocitos T (celulares) por separado de respuestas de linfocitos B (humorales) para muchas enfermedades. Por ejemplo, se han estudiado respuestas inmunitarias por ratones deficientes en linfocitos B para las enfermedades bacterianas Salmonella, Bordetella y tularemia (Ugrinovic et al., (2003) Infect Immun 71, 6808-6819, Leef et al., (2000) J Exp Med 191, 1841-1852, Chen et al., (2004) Microbial Pathogenesis 36, 311-318) , la enfermedad viral de la viruela (Wyatt et al., (2004) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 4590-4595) , las enfermedades parasíticas Leishmania

(Brown y Reiner, (1999) Infect Immun 67, 266-270, Miles et al., (2005) J Exp Med 201, 747-754, Ronet et al., (2008) J Immunol 180, 4825-4835.) y malaria (Weidanz et al., (2005) Exp Parasitol 111, 97-104) , y para enfermedad inflamatoria del intestino (Ma et al., (1995) J Exp Med 182, 1567-1572) . En realidad, los artículos que detallan la producción de tres líneas diferentes de ratones deficientes en linfocitos B Hc KO producidos en los años 90 (Kitamura et al., (1991) Nature 350, 423-426; Chen et al., (1993) Int Immunol 5, 647-656; Jakobovits et al., (1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90, 2551-2555) han sido citados hasta la fecha por más de 1000 publicaciones científicas (fuente: motor de búsqueda Google Scholar) . Además de estudiar la respuesta inmunitaria básica a una exposición a patógeno, estos animales también se han usado para probar vacunas para eficacia (Wyatt et al., (2004) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 4590-4595) . El uso de ratones transgénicos deficientes en linfocitos B también permitió la determinación de la función crítica para linfocitos B en el fenotipo de autoinmunidad sistémica asociada a lupus (Chan et al., (1999) Immunol Rev 169, 107-121) .

Aunque los ratones se usan ampliamente, hay pocos ejemplos en la bibliografía del uso de otras especies como modelos animales inmunodeficientes para la investigación de enfermedades humanas. La mayoría de éstos son muy especializados en relación con el animal elegido y la enfermedad que se modela. Se han inmunosuprimido ratas por administración de dexametasona antes de la infección por Aspergillus para probar la eficacia de fármacos profilácticos (Ulmann et al., (2007) J Antimicrob Chemother 60, 1080-1084) . Se utilizó un apéndice de conejo libre de gérmenes ligado para estudiar respuestas inflamatorias relacionadas con enfermedad inflamatoria del intestino (Shanmugam et al., (2005) Inflamm Bowel Dis 11, 992-996) .

La publicación PCT Nº WO06/047603 y las publicaciones de patente de EE.UU. relacionadas U.S. 2006/0130157 y U.S. 2008/0026457 describen cierta disposición de la secuencia de genes de la línea germinal de inmunoglobulina de ungulado, además de secuencias genómicas que codifican el sitio de la cadena pesada de inmunoglobulina de ungulado, y células, tejidos y animales ungulados que carecen de un alelo de un gen de inmunoglobulina de la cadena pesada o ligera nativa, y específicamente describen métodos de rotura dirigida de las secuencias de genes de Ig porcinos individuales, además de la sustitución con genes Ig humanos. Los animales genéticamente modificados resultantes se describen como útiles para producir anticuerpos policlonales humanos como terapéuticos.

Se han modificado genéticamente ratones para hacerlos modelos más apropiados para la infección con patógenos humanos. Por ejemplo, existen ligandos/receptores específicos de especie para infecciones tales como Listeria. Estos receptores se han introducido como transgenes en ratones. Estos ratones transgénicos expresan entonces el receptor y se... [Seguir leyendo]

1. Un método de prueba de la respuesta inmunitaria de un animal a un antígeno que comprende proveer un animal porcino genéticamente modificado que carece de expresión de la inmunoglobulina de la cadena pesada porcina funcional del antígeno y evaluar una respuesta del animal al antígeno, en el que el porcino tiene una alteración elegida como diana en ambos alelos de la región de unión J6 de la cadena pesada porcina, que produce una ausencia de producción de linfocitos B en el porcino.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el porcino tiene una alteración en al menos un gen nativo adicional en 10 su genoma.

3. El método de la reivindicación 2, en el que el porcino carece de o tiene una respuesta inmunitaria celular reducida.

4. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el que el porcino incluye adicionalmente al menos un gen 15 xenógeno o transgén.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el porcino expresa adicionalmente al menos una proteína xenógena.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la proteína adicional es una molécula de bloqueo coestimulante. 20

7. El método de la reivindicación 6, en el que la molécula de bloqueo coestimulante es la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA4) .

8. El método de la reivindicación 7, en el que CTLA4 está fusionada con una molécula de inmunoglobulina (Ig) . 25

9. Un método de prueba de la utilidad de un profiláctico o terapéutico contra un agente infeccioso que comprende exponer un animal porcino genéticamente modificado que carece de expresión de la inmunoglobulina de la cadena pesada porcina funcional al agente infeccioso; tratar el porcino con el profiláctico o terapéutico; y evaluar la respuesta inmunitaria y evolución de la infección en el porcino; en el que el porcino tiene una alteración elegida como diana en ambos alelos de la región de unión J6 de la cadena pesada porcina, que produce una ausencia de producción de linfocitos B en el porcino.

10. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 9, en el que el porcino se expone a un agente infeccioso o antígeno de superficie del mismo. 35

11. El método de la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que la evaluación incluye examen de respuestas celulares y humorales.

12. El método de la reivindicación 10, en el que el agente infeccioso es un virus. 40

13. El método de la reivindicación 9, en el que el profiláctico o terapéutico es una vacuna.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, en el que el animal expresa adicionalmente una

proteína exógena. 45

15. El método de la reivindicación 14, en el que la proteína adicional es una inmunoglobulina humana o fragmento de la misma.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el porcino tiene una deleción elegida 50 como diana de la región de unión J6 del gen de Ig de la cadena pesada porcina.