Sustancia proteínica que tiene estructura de hélice triple y método de producción de la misma.

Una proteína recombinante que tiene una estructura de hélice triple,

que comprende una proteína codificada por un polinucleótido que comprende (i) a (v) a continuación en orden desde el terminal amino:

(i) un gen de dominio de péptido de señalización de colectina humana;

(ii) un gen de domino rico en cisteína de colectina humana;

(iii) un gen de dominio de colágeno de colágeno humano;

(iv) un gen de dominio de cuello de colectina humana; y

(v) un gen de dominio de reconocimiento de carbohidratos de colectina humana.

Sustancia proteínica que tiene estructura de hélice triple y método de producción de la misma Campo técnico

La presente invención se relaciona con proteínas que tienen una estructura de hélice triple y métodos para producirlas. Más específicamente, la presente invención se relaciona con análogos de colágeno tipo humano y métodos para producirlos. Un objetivo de la presente invención es proveer análogos de colágeno compuestos de proteínas recombinantes tipo humano que son seguras para los organismos vivos y pueden ser purificadas y obtenidas fácilmente, y métodos para producirlas. Más específicamente, la presente invención provee métodos para producir análogos de colágeno compuestos de una proteína recombinante en la cual los genes introducidos son todos de tipo humano, en donde el método es llevado a cabo mediante la transducción estable de un vector de expresión en mamíferos insertado con un ADNc de una proteína recombinante que comprende colágeno tipo humano en células de ovario de hámster chino (CHO).

Técnica antecedente

En años recientes, un ejemplo de los materiales más importantes en la medicina regenerativa es el colágeno. El colágeno es una proteína representativa distribuida en casi todos los tejidos (piel, huesos, cartílagos y similares) en organismos vivos, y es bien conocido que tiene funciones importantes en los organismos vivos tales como mantener la estructura de los tejidos y órganos biológicos convirtiéndose en un soporte para las células. Además, tiene diversas funciones fisiológicas que regulan la proliferación, diferenciación y migración de las células. A partir de estos hechos, está recibiendo atención en el campo de la medicina regenerativa a través de su uso junto con células, factores de crecimiento y similares en la medicina de la ingeniería de tejidos. Hasta ahora, el colágeno ha sido usado ampliamente en el campo médico como implantes de órganos artificiales (Documento de Patente 1), matrices de liberación de fármacos sostenida (Documento de Patente 2), piel artificial (Documento de Patente 3), y componentes de materiales biocompatibles para uso en matrices de vendajes para heridas y matrices para el tratamiento de heridas (Documento de Patente 4).

Cuarenta por ciento de todo el colágeno de un organismo vivo está en la piel, y el 70 por ciento o más del peso seco de la plel/tendones es colágeno. Por lo tanto, el colágeno es importante en el desarrollo de la piel artificial. En particular, el colágeno es utilizado como un biomaterial para reparar daños en organismos. Por ejemplo, se utiliza como material de recubrimiento para sitio de lesiones de piel, tales como una quemadura, y se ha reportado curación y mejora (Documentos no Patente 1 y 2). Esto significa que se pueden tener grandes esperanzas para aplicaciones en el campo actual significativamente avanzado de la medicina regenerativa. Además, se utiliza como un material útil en técnicas para el cultivo de células y órganos (Documentos de Patente 5 y 6). Además, se ha señalado que la Ingestión oral de colágeno (colágeno tipo 2) y similares puede ser utilizada para suprimir la artritis reumatolde (Documento no Patente 3). Además, se ha reportado que es posible tratar diseñando un gen de expresar un péptldo parcial de colágeno humano (colágeno tipo Vil), e Introducir un gen de colágeno de bajo peso molecular en las células de la epldermóllsls bulosa (Documento no Patente 4).

Muchos de los colágenos usados actualmente son derivados de especies de mamíferos no humanos tales como bovinos o cerdos. Se ha reportado que cuando estos colágenos son trasplantados a humanos, se presenta reacción alérgica en aproximadamente el 3% de los pacientes (Documentos no Patentes 5 y 6). Adlclonalmente, en años recientes, el riesgo de contaminación del colágeno derivado de especies de mamíferos no humanos con prlones o patógenos se ha convertido en un problema principal. Por lo tanto, se desea fuertemente un sistema para producir colágenos tipo humano seguros con baja antlgenlcldad y libres de riesgo de contaminación por patógenos.

Para evitar tales problemas, algunos Inventores han Inventado un método para producir colágeno humano recomblnante que tiene una estructura de hélice triple equivalente a la del cuerpo humano Infectando células de Insectos con un virus recomblnante Insertado con un ADNc que codifica colágeno humano, y han solicitado una patente (Documento de Patente 7). Adlclonalmente, también se han diseñado métodos para producir colágeno humano utilizando células de mamíferos o células de levadura (Documento de Patente 8).

[Documentos de la técnica anterior]

[Documentos de Patente]

[Documento de Patente 1] Solicitud de Patente Japonesa de Kokal Publicación No. (JP-A) 2007-204881 (Solicitud de Patente Japonesa no examinada, publicada)

[Documento de Patente 2] JP-A (Kokal) 2001-316282

[Documento de Patente 3] JP-A (Kokal) 2005-314

[Documento de Patente 4] JP-A (Kokai) 2007-160092 [Documento de Patente 5] JP-A (Kokai) 2002-142753

[Documento de Patente 6] Solicitud de Patente Japonesa de Saikohyo Publicación No. (JP-A) 2005-014774 (Publicación de fase nacional Japonesa no examinada correspondiente a una publicación internacional Japonesa)

5 [Documento de Patente 7] JP-A (Kokai) 8-23979

[Documento de Patente 8] Solicitud de Patente Japonesa de Kohyo Publicación No. (JP-A) 7-501939 (Publicación de fase nacional Japonesa no examinada correspondiente a una publicación internacional no Japonesa).

[Documentos no Patente]

[Documento no Patente 1] Surg. Forum, 10, 303 (1960)

10 [Documento no Patente 2] J. Surg. Forum, 10, 485-491 (1960)

[Documento no Patente 3] Science, 261, 1727-1730 (1993)

[Documento no Patente 4] THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 275, No. 32, Expedido Agosto

11 11, pp. 24429-24435, 2000

[Documento no Patente 5] J. Immunol. 136:877-882, 1986 15 [Documento no Patente 6] Biomaterials 11:176-180, 1990 Resumen de la invención [Problemas para ser resueltos por la invención]

De esta manera, el colágeno es una sustancia útil como un producto farmacéutico o un biomaterial para trasplante de donantes vivos o medicina regenerativa; sin embargo, el colágeno utilizado convencionalmente, es derivado de 20 tejidos de especies de mamíferos no humanas tales como cerdos y ganado. El colágeno es originalmente una proteína con baja ¡nmunogenicidad, y está siendo trasplantado, embebido o administrado en el cuerpo humano como un biomaterial. Sin embargo, aunque en baja frecuencia, hay reportes de que se evocan reacciones inmunes por parte del colágeno derivado de tejidos de especie de mamíferos no humanos (J. Immunol., 136, 877-882 (1986); Biomaterials, 11, 176-180 (1990)). Adicionalmente, debido a la posibilidad de contaminación con priones sugerida en 25 el caso del ganado, no es posible utilizar colágeno derivado de ganado. Además, no hay garantía de que contaminantes desconocidos (virus patogénicos y similares) como la contaminación por priones no estén contenidos en mamíferos tales como los cerdos que se utilizan actualmente para la purificación y extracción de colágeno, y han ¡do surgiendo problemas de seguridad con el uso de colágeno derivado de mamíferos no humanos para humanos. Adlclonalmente, un problema con el colágeno derivado biológicamente es que se hace necesaria una purificación de 30 etapas múltiples durante la purificación debido a la inclusión de gran cantidad de proteínas contaminantes, y el método de purificación se hace complicado.

A la luz de los problemas antes mencionados, el colágeno derivado de humanos es deseable como biomaterial para ser utilizado directamente en humanos. El colágeno derivado de humanos puede ser purificado a partir de fuentes humanas (tales como placenta humana) (Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,002,071 y 5,428,022). Sin 35 embargo, hay varios problemas en el uso de colágenos derivado de humanos (1) puesto que el material es tejido humano, el material tiene suministro limitado; (2) no se puede eliminar completamente la posibilidad de la contaminación con virus patogénicos tales como virus de hepatitis y virus de inmunodeficiencia humana (HIV); (3) los tipos de colágeno recolectados de la placenta son desproporcionados y las calidades no son completamente Idénticas; y (4) hay problemas éticos concernientes a la extracción y purificación de colágeno a partir de humanos. El 40 problema cualitativo también existe puesto que la purificación se hace difícil debido a la formación de puentes no especificados en el colágeno obtenido.

Hasta el momento, se han investigado métodos que utilizan técnicas de ingeniería genética para producir colágeno para... [Seguir leyendo]

1. Una proteina recombinante que tiene una estructura de hélice triple, que comprende una proteina codificada por un polinucleótido que comprende (i) a (v) a continuación en orden desde el terminal amino:

(i) un gen de dominio de péptido de señalización de colectina humana;

(ii) un gen de domino rico en cisterna de colectina humana;

(iii) un gen de dominio de colágeno de colágeno humano;

(iv) un gen de dominio de cuello de colectina humana; y

(v) un gen de dominio de reconocimiento de carbohidratos de colectina humana.

2. La proteina recombinante que tiene una estructura de hélice triple de la reivindicación 1, en donde ei gen dei dominio de péptido de señalización de la colectina humana es un gen de dominio de péptido de señalización de una proteina D surfactante humana (SP-D) y es un polinucleótido que consiste de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4.

3. La proteina recombinante que tiene una estructura de hélice triple de la reivindicación 1, en donde el gen del dominio rico en cisteína de colectina humana es un gen de dominio rico en cisterna de proteina D surfactante humana (SP-D) y es un polinucleótido que consiste de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 5.

4. La proteina recombinante que tiene una estructura de hélice triple de la reivindicación 1, en donde el gen de dominio de cuello de la colectina humana es un gen de dominio de cuello de lectina de enlazamiento al manano humana (MBL) y es un polinucleótido que consiste de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6.

5. La proteina recombinante que tiene una estructura de hélice triple de la reivindicación 1, en donde el gen de dominio de reconocimiento de carbohidratos de la colectina humana es un gen de dominio reconocimiento de carbohidratos de la lectina de enlazamiento a manano humana (MBL) y es un polinucleótido que consiste de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 7.

6. La proteina recombinante que tiene una estructura de hélice triple de la reivindicación 1, en donde el gen de dominio de colágeno humano

I) comprende al menos uno o más tipos de genes de dominio de colágeno de colágenos humanos de cadena a o

II) es un gen de dominio de colágeno de un colágeno tipo I humano que consiste de un colágeno humano de cadena a.

7. La proteina recombinante que tiene una estructura de hélice triple de la reivindicación 6, en donde el gen de dominio del colágeno de un colágeno humano de cadena a es un polinucleótido que consiste de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 8.

8. La proteina recombinante que tiene una estructura de hélice triple de la reivindicación 1, que comprende una proteina que consiste de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

9. La proteina recombinante que tiene una estructura de hélice triple de la reivindicación 1, en donde el polinucleótido es un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3.

10. Un método para producir una proteina que tiene una estructura de hélice triple, en donde el método comprende las etapas de:

(a) Introducir un vector en un polinucleótido que comprende de (I) a (v) a continuación en orden desde el terminal amino:

(I) un gen de dominio de péptido de señalización de colectina humana;

(II) un gen de domino rico en cisteína de colectina humana;

(III) un gen de dominio de colágeno de colágeno humano;

(IV) un gen de dominio de cuello de colectina humana; y

(V) un gen de dominio de reconocimiento de carbohidratos de colectina humana;

(b) transformar una célula anfltrlona por Introducción genética utilizando el vector; y

(c) cultivar o hacer crecer el transformante, y recolectar una proteina que tiene una estructura de hélice triple a partir de la célula o de su sobrenadante de cultivo.

11. El método de la reivindicación 10, en donde el gen de dominio de péptldo de señalización de colectlna humana 5 es un gen de dominio de péptldo de señalización de proteina D surfactante humana (SP-D) y es un pollnucleótldo consistente de la secuencia de nucleótldos de SEQ ID NO: 4.

12. El método de la reivindicación 10, en donde el gen de dominio rico en cisterna de colectlna humana es un gen de dominio rico en cisterna de proteina D surfactante humana (SP-D) y es un pollnucleótldo que consiste de la secuencia de nucleótldos de SEQ ID NO: 5.

13. El método de la reivindicación 10, en donde el gen de dominio de cuello de la colectlna humana es un gen de dominio de cuello de la lectlna de enlazamlento a manano humana (MBL) y es un pollnucleótldo que consiste de la secuencia de nucleótldos de SEQ ID NO: 6.

14. El método de la reivindicación 10, en donde el gen de dominio de reconocimiento de carbohidratos de la colectlna humana es un gen de dominio de reconocimiento de carbohidratos de la lectlna de enlazamlento a manano humana (MBL) y es un pollnucleótldo que consiste de la secuencia de nucleótldos de SEQ ID NO: 7.

15. El método de la reivindicación 10, en donde el gen de dominio de colágeno de colágeno humano

I) comprende al menos uno o más tipos de genes de dominio de colágeno de colágenos humanos de cadena a o

II) es un gen de dominio de colágeno de colágeno tipo I humano que consiste de un colágeno humano de cadena a.

16. El método de la reivindicación 15, en donde el gen de dominio de colágeno de un colágeno humano de cadena a 20 es un pollnucleótldo que consiste de nucleótldos de SEQ ID NO: 8.

17. El método de la reivindicación 10, en donde el vector usado en la etapa (a) es pNC1 de SEQ ID NO: 2 o pDC6/CF de SEQ ID NO: 9.