STXBP1 como biomarcador psiquiátrico en un sistema de modelo murino y sus usos.

Un ratón transgénico que tiene un polinucleótido que codifica un polipéptido de STXBP1 (proteína de unión a sintaxina 1),

polinucleótido que está unido operativamente a un promotor EAAT3 (transportador de aminoácidos excitadores 3), en donde dicho ratón transgénico tiene una expresión del polipéptido de STXBP1 mayor que la de tipo silvestre en al menos una región cerebral seleccionada entre: corteza, cuerpo estriado, hipocampo y cerebelo.

STXBP1 como biomarcador psiquiátrico en un sistema de modelo murino y sus usos Campo de la invención

La presente invención se refiere a un marcador de enfermedades psiquiátricas, particularmente esquizofrenia y trastorno bipolar, en modelos murinos que utilizan el marcador y a los métodos para explorar agentes que afectan al marcador y que pueden tener potencial terapéutico.

Antecedentes de la invención

Los trastornos psiquiátricos tales como esquizofrenia se están convlrtiendo en uno de los problemas de salud pública más importantes a escala global. Las causas de la enfermedad aún se comprenden mal, aunque los factores genéticos tienen Indudablemente un papel importante en su etiología. Además, esta enfermedad no se desarrolla debido a la alteración de un solo gen, sino más probablemente debido a cambios en un grupo de genes, lo que la convierte en una enfermedad multifactorial.

De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, aproximadamente 24 millones de personas padecen actualmente esquizofrenia, lo que se aproxima al 1 % de la población mundial, y su prevalencia es similar en hombres y mujeres. La esquizofrenia aparece por lo general al final de la adolescencia o al principio de la edad adulta, y produce Importantes cambios en los procesos cognitivos, en la percepción y en las emociones. Su evolución varía, y puede Ir desde un único episodio con recuperación completa a un grave deterioro y al suicidio. Aunque los pacientes con esquizofrenia representan menos del 4 % de los que necesitan hospitalización psiquiátrica, la morbilidad y cronicidad experimentadas por los pacientes con esquizofrenia significa que esta se ha convertido en la enfermedad mental más grave e incapacitante de la vida adulta temprana e intermedia. De hecho, se ha estimado que el coste directo de la esquizofrenia en países industrializados está entre el 1,6 y el 2,6 % del gasto sanitario total [Rossler, 25],

La hipótesis neurobiológica clásica para explicar la esquizofrenia invoca la hiperactividad del sistema dopaminérgico del cerebro. Los fármacos antipsicóticos producirían su efecto terapéutico, por tanto, antagonizando estos receptores de la dopamina. Esta hipótesis se refinó posteriormente sugiriendo que la hipoactividad del sistema glutamatérgico cortical sería responsable de la hiperactividad dopaminérgica observada en la esquizofrenia. De hecho, el control del sistema dopaminérgico cortical mediante el sistema glutamatérgico cortical podría ser consistente con los postulados clásicos. Estudios recientes han demostrado importantes deficiencias neuronales y/o gliales en la corteza, posiblemente vinculadas en el desarrollo temprano del sistema nervioso asociado con la esquizofrenia. Es por tanto más probable que la esquizofrenia está causada por conexiones neuronales anómalas en lugar de la pérdida neuronal [Horner, 22],

Los estudios genéticos han identificado numerosos genes susceptibles vinculados a la esquizofrenia [Weinberger, 25], A pesar de esto, en la actualidad se carece de marcadores fiables para la esquizofrenia. Uno de los sustratos moleculares candidatos para un tipo de conectividad neuronal anómala es un grupo de proteínas neuronales conocidas como SNARE (factores sensibles a N-etilmaleimida de unión a receptores de proteínas), que sirven como elementos fundamentales en el control molecular de la neurotransmisión [Sollner, 1993a; Sollner, 1993b]. Este proceso de neurotransmisión se avanza en respuesta a una entrada de Ca2+ activada mediante un potencial de acción que provoca la fusión de las vesículas sinópticas que contienen los neurotransmisores con las membranas presinápticas y la liberación de su contenido en la hendidura sinóptica, desde donde estas moléculas se difunden hacia la terminal post-sináptica. Se han identificado dos tipos de proteínas SNARE dependiendo de su ubicación subcelular: a) proteínas v-SNARE, que se describieron por primera vez en las vesículas de neurotransmisores y que incluyen la proteína VAMP/sinaptobrevina; y b) proteínas t-SNARE, que se describieron por primera vez en la región presináptica de la membrana plasmática diana e incluye sintaxina y la proteína asociada al sinaptosoma de 25 kDa, o SNAP25. Este grupo de proteínas se caracteriza por tener una región conservada de aproximadamente 6 aminoácidos, conocido como el motivo SNARE, y tiene por lo general una región implicada en el anclado a la membrana. Se cree actualmente que las proteínas SNARE están muy implicadas en la fusión de membranas, aunque necesitan para su actividad de otras proteínas auxiliares. Estas proteínas auxiliares incluyen el factor sensible a N-etilmaleimida o NSF (una ATPasa asociada a varias actividades celulares) y la familia de proteínas SM, que contiene la proteína Seclp y la proteína Munc-18 (también conocidas como proteína de unión a sintaxina 1 (STXBP1)). Estas proteínas son esenciales en la fusión de membranas, ya que este evento es mucho más lento in vitro en su ausencia. El papel de STXBP1 en la liberación de neurotransmisores ha quedado claramente demostrado por una serie de experimentos que muestran que no se produce transmisión sinóptica vesicular durante el desarrollo de animales que no expresan el gen que codifica esta proteína [Verhage, 2]. El modelo más aceptado para explicar el mecanismo molecular de la liberación vesicular de neurotransmisores sugiere que STXBP1 se une a la sintaxina inhibiendo de esta forma la unión de esta proteína al resto del complejo SNARE. Cuando STXBP1 se libera de su asociación con la sintaxina, esta última puede interactuar con SNAP25 y VAMP para formar el complejo SNARE. Cuando se acopla con un aumento en el calcio intracelular, este complejo es responsable de promover el anclado de las vesículas a la membrana plasmática, induciendo de esta forma la liberación de neurotransmisores

desde las vesículas slnáptlcas [Voets, 21],

Algunos estudios recientes han demostrado que algunas enfermedades psiquiátricas y neurodegenerativas muestran cambios en la expresión (tanto en el ARN mensajero como en la proteína) de algunos componentes del complejo SNARE. Por ejemplo, se han descubierto cambios en los niveles las proteínas VAMP y SNAP-25 post- mortem en la corteza cerebral prefrontal de pacientes humanos con esquizofrenia [Honer, 22; Hallm, 23], De manera similar, se han descubierto niveles anómalos de SNAP-25 post-mortem en el hipocampo y en el cerebelo de cerebros esquizofrénicos [Young, 1998; Fatemi, 21; Mukaetova-Landlska, 22], y otros grupos han descubierto niveles anómalos de SNAP-25 en el líquido cefalorraquídeo de pacientes con diagnóstico de esquizofrenia [Thompson, 23], Sin embargo, no se han descubierto cambios significativos asociados con la esquizofrenia en las proteínas NSF, que también están asociadas al complejo SNARE [Imai, 21; Gray, 26], Se ha notificado un aumento en la expresión de STXBP1 en microdominios de membrana en la corteza dorsolateral prefrontal procedente de pacientes esquizofrénicos [Behan, 28 y 29], Sin embargo, se ha notificado la infrarregulación de STXBP1 en ratas postpubertales lesionadas en el hipocampo ventral durante el nacimiento (nVH), un modelo de neurodesarrollo muy utilizado de conductas de tipo esquizofrénico [Vercauteren, 27],

La expresión de MUNC-18 murino 1 (un homólogo de STXBP1) insertado con el promotor unc-18 endógeno corrigió los defectos neuronales en mutantes de Caenorhabditis elegans unc-18 (discapacidad locomotora grave, resistencia a inhibidores de la colinesterasa, e hipersensibilidad a los agonistas del receptor colinérgico) [GENGyO-ANDO 1996],

Los ratones que tienen mutaciones sin sentido en el gen DISC1 (perturbado en la esquizofrenia) muestran rasgos conductuales que se pueden asociar con la esquizofrenia y se pueden utilizar como un modelo murino de la esquizofrenia [LOW 27],

Los modelos en ratón que imitan el espectro fenotípico de un trastorno psiquiátrico, tal como esquizofrenia, son virtualmente imposibles. Sin embargo, es factible cierta recreación de componentes fenotípicos, y los modelos animales de la esquizofrenia a menudo intentan imitar algunos de los síntomas positivos/negativos del trastorno. En este contexto, los modelos animales tienen un papel fundamental para descubrir las causas de los trastornos psiquiátricos y nuevos tratamientos mecanicistas [Arguello y Gogos, 26]. Se desean animales transgénicos como método para estudiar las funciones de los genes en un organismo vivo, o como modelo animal para desarrollar agentes terapéuticos. Sin embargo, es difícil preparar un modelo que refleje una enfermedad humana que tiene un mecanismo de desarrollo desconocido, tal como la esquizofrenia. Además, los hallazgos en animales que se correlacionan con síntomas positivos de esquizofrenia (tales... [Seguir leyendo]

1. Un ratón transgénico que tiene un polinucleótido que codifica un polipéptido de STXBP1 (proteína de unión a sintaxina 1), polinucleótido que está unido operativamente a un promotor EAAT3 (transportador de aminoácidos excitadores 3), en donde dicho ratón transgénico tiene una expresión del polipéptido de STXBP1 mayor que la de tipo silvestre en al menos una región cerebral seleccionada entre: corteza, cuerpo estriado, hipocampo y cerebelo.

2. Un ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido está presente con un número de copias mayor que el tipo silvestre.

3. Un ratón transgénico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho polinucleótido codifica:

(i) un polipéptido de STXBP1 que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 8 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2;

(ii) un polipéptido de STXBP1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2

(i¡¡) un polipéptido de STXBP1 que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 8 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 4;

(iv) un polipéptido de STXBP1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 4; o

(v) un fragmento activo de uno o más de (i)-(iv) que tiene al menos 2 aminoácidos,

y en el que dicho polipéptido de STXBP1 o uno cualquiera de (i)-(iv) o dicho fragmento activo de (v) pueden unirse a un polipéptido de sintaxina.

4. Un ratón transgénico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el promotor de EAAT3 comprende un polinucleótido que tiene al menos un 8 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEC ID N°: 6 o un polinucleótido que tiene la secuencia de la SEC ID N°: 6.

5. Un ratón transgénico de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que tiene al menos un 1 % más de expresión del polipéptido de STXBP1 en dicha al menos una región cerebral, tal como se ha medido mediante transferencia de Western, inmunofluorescencia y/o cPCR de un ARNm de STXBP1.

6. Un método para producir un ratón transgénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende

introducir un vector en una o más células del ratón en estado embrionario; y

opcionalmente, extraer posteriormente el ADN del animal para confirmar la incorporación del polinucleótido en el genoma del animal,

donde dicho vector comprende: un polinucleótido que codifica un polipéptido de STXBP1 unido operativamente a un promotor EAAT3 y opcionalmente secuencias reguladoras adicionales.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho polinucleótido de dicho vector codifica:

(i) un polipéptido de STXBP1 que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 8 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de la SEC ID N°: 2;

(ii) un polipéptido de STXBP1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 2

(¡ii) un polipéptido de STXBP1 que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 8 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de la SEC ID N°: 4;

(¡v) un polipéptido de STXBP1 que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N°: 4; o (v) un fragmento activo de uno o más de (i)-(iv) que tiene al menos 2 aminoácidos,

y en el que dicho polipéptido de STXBP1 o uno cualquiera de (i)-(iv) o dicho fragmento activo de (v) pueden unirse a un polipéptido de sintaxina.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en el que el promotor de EAAT3 de dicho vector comprende un polinucleótido que tiene al menos un 8 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEC ID N°: 6 o un polinucleótido que tiene la secuencia de la SEC ID N°: 6.

9. Un método in vivo para identificar un agente para su uso en el tratamiento de una enfermedad neuropsiquiátrica, particularmente esquizofrenia y/o trastorno bipolar, que comprende:

(i) administrar un agente de ensayo a un ratón transgénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y posteriormente medir, directa o indirectamente, la expresión de un polipéptido de STXBP1 en al menos una región del cerebro con respecto a la expresión del polipéptido de STXBP1 en al menos una región del cerebro de un ratón transgénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que no se ha expuesto al compuesto de ensayo; y/o

(ii) administrar un agente de ensayo a un ratón transgénico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y posteriormente evaluar la presencia y/o la gravedad de una o más conductas relacionadas con la esquizofrenia en el animal transgénico con respecto a una o más conductas relacionadas con la esquizofrenia en un ratón

transgénico control de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que no se ha expuesto al agente de ensayo, en donde una reducción de dicha expresión en (i) y/o dichas una o más conductas relacionadas con la esquizofrenia en (ii) debido al agente de ensayo indica que el agente de ensayo es potencialmente útil en el tratamiento de enfermedades neuropsiquiátricas, particularmente esquizofrenia y trastornos bipolares.

1. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dichas una o más conductas relacionadas con la esquizofrenia se pueden seleccionar entre: reducción de la actividad motora en una prueba de campo abierto; reducido tiempo pasado en los brazos abiertos de un laberinto elevado; interacción social reducida; aumento en el índice de reconocimiento en una tarea de reconocimiento de objetos novedosos; y disminución de la inhibición

prepulso de una respuesta inicial.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 1, en el que se encuentra que el agente de ensayo reduce dicha expresión en (i) y/o en dichas una o más conductas relacionadas con la esquizofrenia en (ii).