Proteínas de seda de araña y métodos para producir proteínas de seda de araña.

Una proteína espidroína de la ampulácea mayor aislada,

caracterizada porque dicha proteína consiste en 150 a 420 residuos de aminoácido y se define mediante la fórmula REP-CT,

en donde

REP es un fragmento de proteína que tiene de 80 a 300 residuos de aminoácido, en donde dicho fragmento se selecciona del grupo de L(AG)nL, L(AG)nAL, L(GA)nL, L(GA)nGL, en donde

n es un número entero de 4 a 8;

cada segmento A individual es una secuencia de aminoácidos de 8 a 18 residuos de aminoácido, en donde de 0 a 3 de los residuos de aminoácido no son Ala, y los residuos de aminoácido restantes son Ala; cada segmento G individual es una secuencia de aminoácidos de 12 a 30 residuos de aminoácido, en donde al menos 40% de los residuos de aminoácido son Gly; y

cada segmento L individual es una secuencia de aminoácidos conectora de 0 a 20 residuos de aminoácido; y

CT es un fragmento de proteína que tiene de 70 a 120 residuos de aminoácido, cuyo fragmento es, o tiene al menos una identidad de 80% con, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 4, residuos de aminoácido 172-269 del SEQ ID NO: 9, y residuos de aminoácido 172-269 del SEQ ID NO: 16.

Proteínas de seda de araña y métodos para producir proteínas de seda de araña Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere al campo de la producción recombinante de proteínas. Más específicamente, la presente invención tiene que ver con la producción recombinante de proteínas de seda de araña. La presente invención proporciona proteínas espidroínas de glándula ampulácea mayor aisladas y proteínas de fusión de espidroína de ampulácea mayor novedosas, así como métodos y moléculas de ácido polinucleico para producir tales proteínas. También se proporcionan polímeros de proteínas espidroinas de ampulácea mayor y métodos para producir tales polímeros.

Antecedentes de la invención

Las sedas de araña son polímeros de la naturaleza de alto rendimiento, que obtienen una dureza extraordinaria debido a una combinación de resistencia y elasticidad. Existen hasta siete glándulas especializadas en las arañas, que producen una variedad de tipos de fibras de seda con diferentes propiedades mecánicas y funciones. La seda Dragline, producida por la glándula ampulácea mayor, es la fibra más dura, y basándose en su peso supera a los materiales elaborados por el ser humano, tales como el acero de alta resistencia a la tensión y el Kevlar. Las propiedades de la seda dragline son atractivas en el desarrollo de nuevos materiales para fines médicos o técnicos.

La seda dragline consiste en dos polipéptidos principales, principalmente referidos como espidroínas de ampulácea mayor (MaSp) 1 y 2, pero ADF-3 y ADF-4 en Araneus diadematus. Estas proteínas tienen masas moleculares aparentes en el intervalo de 2-72 kDa, dependiendo de la edad de la muestra y de las condiciones del análisis, pero todavía no se ha informado sobre el gen completo de la seda de araña dragline. Las propiedades de los polipéptidos de la seda dragline se comentan en Huemmerich, D. et al. Novel assembly properties of recombinant spider dragline silk proteins. Curr. Biol. 14, 27-274 (24). Las espidroínas de seda dragline conocidas están formadas por bloques altamente repetidos de segmentos ricos en alanina alternantes, formando láminas (3 cristalinas en la fibra, y segmentos ricos en glicina que son más flexibles y principalmente carecen de estructura ordenada. La región C-terminal no es repetitiva, está muy conservada entre especies, y adopta una conformación a-helicoidal. La región N-terminal de las proteínas de la seda dragline no ha sido caracterizadas hasta hace muy poco, revelando un dominio N-terminal que está muy conservado entre las diferentes espidroínas, y también entre diferentes especies de arañas (Rising, A. et al. N-terminal nonrepetitive domain common to dragline, flagelliform, y cylindriform spider silk proteins. Biomacromolecules 7, 312-3124 (26)).

Las propiedades mecánicas de la seda dragline varían entre especies; la seda dragline de Euprosthenops sp es más rígida, más fuerte (requiere más fuerza para romperse) y menos extensible que la seda dragline p. ej., de Araneus diadematus o Nephila clavipes. La seda dragline de Euprosthenops sp parece tener una mayor proporción de estructura en lámina (3 cristalina que la seda dragline de Araneus diadematus, muy probablemente debido a que la MaSp de Euprosthenops sp tiene el mayor contenido de polialanina entre todas las especies analizadas hasta ahora (Pouchkina-Stantcheva, N. N. & McQueen-Mason, S. J. Molecular studies of a novel dragline silk from a nursery web spider, Euprosthenops sp. (Pisauridae). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 138, 371-376 (24)).

Los intentos para producir sedas de araña artificiales han empleado fragmentos de genes naturales o sintéticos que codifican proteínas de seda dragline, puesto que no se ha informado todavía sobre el gen completo. Las proteínas de seda dragline recombinantes se han expresado en diversos sistemas incluyendo bacterias, levaduras, células de mamífero, plantas, células de insecto, gusanos de seda transgénicos y cabras transgénicas. Véanse p. ej. Lewis, R. V. et al. Expression and purification of a spider silk protein: a new strategy for producing repetitive proteins. Protein Expr. Purif. 7, 4-46 (1996); Fahnestock, S. R. & Irwin, S. L. Synthetic spider dragline silk proteins y their producción in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 47, 23-32 (1997); Arcidiacono, S. et al. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998); Fahnestock, S. R. & Bedzyk, L. A. Production of synthetic spider dragline silk protein in Pichia pastoris. Appl. Microbiol. Biotechnol. 47, 33-39 (1997); y Lazaris, A. et al. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science 295, 472-476 (22).

El documento WO 24/16651 (The University of York) describe secuencias de ácido nucleico que codifican partes repetitivas internas de proteínas MaSp1 de Euprosthenops sp. No se expresa la proteína.

Huemmerich, D. et al. Primary structure elements of spider dragline silks and their contribution to protein solubility. Biochemistry 43, 1364-13612 (24) describen un gen sintético, "(AQ)i2NR3", que codifica fragmentos ricos en Ala y ricos en Gly/GIn repetitivos y un fragmento no repetitivo, todos derivados de ADF3 de Araneus. El gen es expresado a una proteína soluble (59,8 kD, >528 aa), que se agrega pero no forma polímeros o fibras. El contenido de alanina de la proteína es de 1-15%.

El documento WO 3/57727 describe la expresión de polipéptidos de seda recombinantes solubles en líneas celulares de mamífero y animales. Un polipéptido de seda expresado (ADF-3; 6 kD, 652 aa) consiste en una unidad repetitiva y un dominio hidrófilo no repetitivo. Otro polipéptido de seda expresado (ADF-3 His; 63 kD, 677 aa)

consiste en una unidad repetitiva, un dominio hidrófilo no repetitivo, un epítopo c-myc y una etiqueta de seis Histidinas. La unidad repetitiva tiene un bajo contenido de Ala (1-2%). Los polipéptidos de seda obtenidos muestran una escasa solubilidad en medio acuoso y/o forman precipitados. Puesto que los polipéptidos de seda obtenidos no se polimerizan espontáneamente, se requiere centrifugación para obtener polímeros o fibras.

Varios factores complican la expresión de las proteínas de seda dragline. Debido a la naturaleza altamente repetitiva de los genes, y a la composición de aminoácidos restringida concomitante de las proteínas, se producen errores de transcripción y traducción. El agotamiento de las reservas de ARNt en los sistemas de expresión microbiana, con la subsiguiente traducción discontinua, que conduce a una terminación prematura de la síntesis de proteínas podría ser otra razón. Otras razones comentadas para el truncamiento de la síntesis de proteínas son la formación de la estructura secundaria del ARNm, y la recombinación de los genes. Se ha demostrado que los genes de MaSp nativos más grandes de 2,5 kb son inestables en anfitriones bacterianos. Adicionalmente, existen dificultades en el mantenimiento de las proteínas de seda recombinantes en forma soluble, puesto que los fragmentos de seda dragline obtenidos de forma natural como los copolímeros de bloques diseñados, especialmente las proteínas derivadas de MaSp1/ADF-4, se auto-ensamblan fácilmente en agregados amorfos, causando la precipitación y la pérdida de la proteína. Véase Huemmerich, D. et al. Primary structure elements of spider dragline silks y thelr contribution to protein solubility. Biochemistry 43, 1364-13612 (24) y Lazarls, A. et al. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science 295, 472-476 (22).

El documento WO 3/2916 describe secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas de seda de araña. Las proteínas forman espontáneamente agregados a una concentración elevada, y estos agregados se pueden reunir y centrifugar mecánicamente en fibras macroscópicas utilizando disolventes fuertemente polares.

Sponner, A. et al. The conserved C-termini contribute to the properties of spider silk proteins, Biochem. Biophys. Res. Com. 338, 897-92 (25) proporcionan un análisis de los extremos C de las espidroínas derivadas de la glándula ampulácea mayor de arañas del género Nephila y comentan su posible influencia en la conformación y la solubilidad de las espidroínas nativas.

Compendio de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar una proteína de seda de araña, que puede proporcionar fibras de seda de araña.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una proteína de seda de araña soluble en agua, que se pueda manipular fácilmente para autopollmerlzarse en fibras a voluntad. Esto permite aplicaciones únicas, tales... [Seguir leyendo]

1. Una proteína espidroína de la ampulácea mayor aislada,

caracterizada porque dicha proteína consiste en 15 a 42 residuos de aminoácido y se define mediante la fórmula REP-CT, en donde

REP es un fragmento de proteína que tiene de 8 a 3 residuos de aminoácido, en donde dicho fragmento se selecciona del grupo de L(AG)nL, L(AG)nAL, L(GA)nL, L(GA)nGL, en donde

n es un número entero de 4 a 8;

cada segmento A individual es una secuencia de aminoácidos de 8 a 18 residuos de aminoácido, en donde de a 3 de los residuos de aminoácido no son Ala, y los residuos de aminoácido restantes son Ala;

cada segmento G individual es una secuencia de aminoácidos de 12 a 3 residuos de aminoácido, en donde al menos 4% de los residuos de aminoácido son Gly; y

cada segmento L individual es una secuencia de aminoácidos conectara de a 2 residuos de

aminoácido; y

CT es un fragmento de proteína que tiene de 7 a 12 residuos de aminoácido, cuyo fragmento es, o tiene al menos una identidad de 8% con, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 4, residuos de aminoácido 172-269 del SEQ ID NO: 9, y residuos de aminoácido 172-269 del SEQ ID NO: 16.

2. Una proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde

cada segmento A individual es, o tiene al menos una identidad de 8% con, una secuencia de aminoácidos

seleccionada del grupo de residuos de aminoácido 7-19, 43-56, 71-83, 17-12, 135-147, 171-183, 198-211, 235-

248, 266-279, 294-36, 33-342, 357-37, 394-46, 421-434, 458-47, 489-52, 517-529, 553-566, 581-594, 618-

63, 648-661, 676-688, 712-725, 74-752, 776-789, 84-816, 84-853, 868-88, 94-917, 932-945, 969-981, 999-

113, 128-142 y 16-173 del SEQ ID NO: 3; residuos de aminoácido 31-42, 61-75, 9-14, 122-135 y 153-171 del SEQ ID NO: 9; residuos de aminoácido 31-42 del SEQ ID NO: 14; y los residuos de aminoácido 122-135 del SEQ ID NO: 15; y

cada segmento G individual es idéntico a, o tiene al menos una identidad de 8% con, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de residuos de aminoácido 2-42, 57-7, 84-16, 121-134, 148-17, 184-197, 212-234, 249-265, 28-293, 37-329, 343-356, 371-393, 47-42, 435-457, 471^88, 53-516, 53-552, 567-58, 595-617, 631-647, 662-675, 689-711, 726-739, 753-775, 79-83, 817-839, 854-867, 881-93, 918-931, 946-968, 982-998, 114-127, 143-159 y 174-192 del SEQ ID NO: 3; SEQ ID NOS: 5-7; y los residuos de aminoácido 11- 3, 43-6, 76-89, 15-121 y 136-152 del SEQ ID NO: 9.

3. Una proteína aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho fragmento CT es, o tiene al menos una identidad de 5% con, el SEQ ID NO: 8; o en donde dicho fragmento CT es, o tiene al menos una identidad de 9% con, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 4, residuos de aminoácido 172-269 del SEQ ID NO: 9, y residuos de aminoácido 172-269 del SEQ ID NO: 16.

4. Una proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicho fragmento CT es, o tiene al menos una identidad de 95% con, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 4, residuos de aminoácido 172-269 del SEQ ID NO: 9, y residuos de aminoácido 172-269 del SEQ ID NO: 16.

5. Una proteína aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde n es un número entero de 4 a 6.

6. Una proteína aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 9 y los SEQ ID NOS: 14-16.

7. Una proteína de fusión aislada seleccionada del grupo de X-REP-CT, y REP-CT-X, en donde

REP y CT son fragmentos de proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6; y

X es un fragmento de proteína que comprende un compañero de fusión y un sitio de reconocimiento para el agente de escisión;

en donde el fragmento combinado de proteína REP-CT se acopla a través de dicho sitio de reconocimiento para el agente de escisión a dicho compañero de fusión.

8. Un polímero de una proteína espidroína de ampulácea mayor de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

9. Un polímero de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho polímero tiene la forma de una fibra, una espuma, un gel, una malla o una película.

1. Un polímero de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicho polímero tiene la forma de una fibra.

11. Una composición que comprende una proteína aislada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el contenido de LPS y otros pirógenos es 1 UE/mg de proteína aislada o inferior.

12. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en el SEQ ID NO: 1; secuencias de ácido nucleico que codifican los SEQ ID NOS: 2-16, y sus secuencias de ácido nucleico complementarias; y secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7, y sus secuencias de ácido nucleico complementarias.

13. Un método para producir una proteína de fusión soluble como se define en la reivindicación 7, que comprende las etapas de:

(i) expresar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7 en un anfitrión adecuado; y

(ii) aislar la proteína de fusión soluble obtenida en la etapa (i), que implica opcionalmente la eliminación de los LPS y otros pirógenos.

14. Un método para producir un polímero de una proteína espidroína de ampulácea mayor como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una disolución de una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7 en un medio

líquido,

(ii) añadir a dicho medio líquido un agente de escisión adecuado para lograr la escisión de la proteína de fusión en el sitio de reconocimiento para el agente de escisión, y obtener de ese modo la proteína espidroína de ampulácea mayor;

(iii) permitir que la proteína espidroína de ampulácea obtenida en la etapa (¡i) se polimerice en el medio líquido; y opcionalmente

(iv) aislar el polímero obtenido en la etapa (iii) de dicho medio líquido, que implica opcionalmente la eliminación de los LPS y otros pirógenos.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 14 para producir un polímero de una proteína espidroína de ampulácea mayor como se define en las reivindicaciones 1-6, en donde la etapa (i) de proporcionar una disolución de una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7 consiste en:

(a) expresar una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7 en un anfitrión adecuado;

(b) aislar la proteína de fusión soluble obtenida en la etapa (i), que implica opcionalmente la eliminación de los LPS y otros pirógenos; y

(c) proporcionar una disolución de dicha proteína de fusión soluble obtenida en la etapa (ii) en un medio

líquido.

16. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14-15, en donde dicha etapa (iii) de permitir que la proteína espidroína de ampulácea mayor obtenida en la etapa (ii) se polimerice en el medio líquido, comprende adicionalmente proporcionar una interfase entre dicho medio líquido y otra fase seleccionada del grupo que consiste en una fase gaseosa, una fase líquida y una fase sólida, en donde dicha polimerización se inicia en dicha interfase o en una región que rodea dicha interfase.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicho medio líquido es un medio acuoso y dicha otra fase se selecciona del grupo que consiste en aire y disolventes orgánicos miscibles con agua.

18. El uso de una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 12 para la fabricación de un gen no natural que codifica una proteína de seda de araña.

19. El uso de una proteína espidroína de ampulácea mayor, proteína de fusión, polímero o composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11 para la fabricación de un producto para diseñar tejidos o para la regeneración celular guiada.

2. El uso de un polímero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-1 como soporte para la adherencia y el crecimiento celulares.