Producción de policétidos.

Un compuesto de fórmula:**Fórmula**

donde:

x ≥ enlace o CH2,

o -GHR6-x-CHR5-- es**Fórmula**

R15 ≥**Fórmula**

R1 ≥ OH, OCH3;

R2 ≥ H, OH, OCH3;

R3 ≥ F, Cl y R4 ≥ H, OH, CH3, F, Cl; o

R4 ≥ F, Cl y R3 ≥H, OH, CH3, F, Cl, OCH3;

R16 ≥ OH, OCH3;

R17 ≥ Cl, F;

R5 ≥ H, OH;

R6 ≥ H, OH;

R8 y R9 en conjunto son ≥O o H, H; e

y ≥ enlace, CH2.

Producción de policétidos Campo de la invención

La presente invención se refiere a la producción de policétidos y otros productos naturales y a bibliotecas de compuestos y nuevos compuestos individuales. Un área importante es el aislamiento y uso potencial de nuevos análogos de ligandos de FKBP y células hospedadoras que producen estos compuestos. La invención se refiere en particular a métodos para la transformación eficaz de cepas que producen análogos de FKBP y células recombinantes en las que se expresan genes o clonados o casetes de genes para generar nuevos compuestos tales como análogos de ligandos FKBP policétidos (especialmente rapamicina), y a procesos para su preparación, y a medios usados en los mismos (por ejemplo, ácidos nucleicos, vectores, casetes de genes y cepas modificadas genéticamente).

Antecedentes de ¡a invención

La rapamicina (sirolimus) (Figura 1) es un macrólido lipófilo producido por NRRL 5491 de Sfrepfomyces /rygroscop/cus (Sehgal et al., 1975; Vézina et al., 1975; documento de Patente de Estados Unidos N° 3.929.992; documento de Patente de Estados Unidos N° 3.993.749) con un resto de 1,2,3-tricarbonilo unido a una lactona del ácido pipecólico (Paiva et al., 1991). Otros macrólidos relacionados (Figura 2) incluyen FK506 (tacrolimus) (Schreiber y Crabtree, 1992), FK520 (ascomicina o inmunomicina) (Wu et al., 2000), FK525 (Hatanaka H, et al., 1989, FK523 (Hatanaka, H., et al., 1988), antascomicinas (Fehr, T., et al., 1996) y meridamicina (Salituro et al., 1995). Para el propósito de la presente invención, la rapamicina se describe con la convención de numeración de McAlpine et al. (1991) con preferencia a las convenciones de numeración de Findlay et al. (1980) o Chemical Abstracts (11'^ Cumulative Index, 1982-1986 p60719CS).

El modo versátil de acción de la rapamicina demuestra el valor farmacológico del compuesto y hace hincapié en la necesidad de aislar nuevos derivados del fármaco. La rapamicina muestra actividad antifúngica moderada, principalmente frente a especies de Cand/da, y además frente a hongos filamentosos (Baker et al., 1978; Sehgal et al., 1975;. Vézina et al., 1975; documento de Patente de Estados Unidos N° 3.929.992; documento de Patente de Estados Unidos N° 3.993.749). La rapamicina Inhibe la proliferación celular mediante la orientación de las vías de transducclón de señales en varios tipos de células, por ejemplo, mediante la inhibición de las vías de señalización que permiten la progresión desde la Gi, a la fase S del ciclo celular (Kuo et al., 1992). En los linfocitos T, la rapamicina Inhibe la señalización del receptor de IL-2 y la posterior autoproliferación de los linfocitos T resultantes en la ¡nmunosupreslón. Los efectos Inhibidores de la rapamicina no se limitan a los linfocitos T, ya que la rapamicina Inhibe la proliferación de muchos tipos de células de mamíferos (Brunn et al., 1996). La rapamicina es, por lo tanto, un potente ¡nmunosupresor con aplicaciones terapéuticas establecidas o predichas en la prevención del rechazo de alolnjertos de órganos y en el tratamiento de enfermedades autolnmunes (Kahan et al., 1991). Parece que causa menos efectos secundarlos que los tratamientos convencionales contra el rechazo (Navia, 1996). La 40-O-(2- hldroxl)et¡l-rapam¡c¡na (SDZ RAD, Certlcan, Everollmus) es un análogo semlslntétlco de la rapamicina que muestra efectos farmacológicos ¡nmunosupresores (Sedrani, R. et al., 1998; documento de Patente de Estados Unidos N° 5.665.772). La eficacia clínica del fármaco en la actualidad está en Investigación en ensayos clínicos de Fase III (Kirchner et al., 2000). El éster de rapamicina, CCI-779 (Wyeth-Ayerst) Inhibe el crecimiento celular /n v/fro e inhibe el crecimiento del tumor /n v/vo (Yu et al., 2001). En la actualidad, el fármaco se encuentra en ensayos clínicos de Fase III. El valor de la rapamicina en el tratamiento de la psoriasis con placas crónica (Kirby y Griffiths, 2001), el uso potencial de efectos tales como la estimulación del crecimiento de neuritas en células PC12 (Lyons et al., 1994), el bloque de las respuestas prollferatlvas a cltoqulnas por las células vasculares y del músculo liso después de lesión mecánica (Gregory et al., 1993) y su papel en la prevención de la flbrosis por aloinjerto (Waller y Nicholson, 2001) son áreas de Intensa Investigación (Kahan y Camardo, 2001). Informes recientes revelan que la rapamicina está asociada con menor incidencia de cáncer en pacientes con aloinjerto de órganos en la terapia inmunosupresora a largo plazo que los de otros regímenes ¡nmunosupresores, y que esta reducción de la incidencia del cáncer se debe a la Inhibición de la anglogénesls (Guba et al., 2002). Se ha informado que las actividades neurotróficas de los ligandos de ¡nmunoflllna son independientes de su actividad inmunosupresora (Steiner et al., 1997) y que la estimulación de crecimiento nervioso está promovida por la interrupción del complejo del receptor de esteroides madura como se describe en la solicitud de patente W001/03692. Se han informado efectos secundarios tales como hiperllpldemla y trombocitopenia, así como posibles efectos teratógenos (Hentges et al., 2001;. Kahan y Camardo, 2001).

La estructura principal de policétido de rapamicina se sintetiza mediante condensación de cabeza a cola de un total de siete unidades de propionato y siete unidades de acetato a una unidad iniciadora de ácido ciclohexano carboxílico derivada de shikimato (Paiva et al., 1991). El aminoácido derivado de L-lisina, el ácido pipecólico, se condensa mediante un enlace amida en el último acetato de la estructura principal de policétido (Paiva et al., 1993) y va seguido de lactonación para formar el macrociclo. Se ha secuenciado una región genómica de 107 kb que contiene el grupo de genes biosintéticos (Schwecke et al., 1995). El análisis de los marcos de lectura abiertos reveló tres grandes genes que codifican la policétido sintasa modular (PKS) (Aparicio et al., 1996; Schwecke et al., 1995). Entre

los genes de PKS se encuentra embebido el gen rapP que codifica una proteina con similitud de secuencia a dominios de activación de péptldo slntetasas no rlbosómlcas y se cree que actúa de forma análoga (Konlg et al.,

1997). La reglón que codifica los genes de PKS está flanqueada en ambos lados con 24 marcos de lectura abierta adicionales que codifican enzimas que se cree que son necesarias para la biosintesi de la rapamlclna (Molnar et al., 1996). Estos Incluyen las siguientes enzimas de modificación post-pollcétldo: dos P-450 monooxlgenasas citocromo, denominadas RapJ y RapN, una ferredoxlna RapO asociada y tres posibles potenciales 0-metlltransferasas dependientes de SAM, RAPL, RAPM y RapQ. Otros genes adyacentes tienen papeles supuestos en la reglamentación y la exportación de la rapamlclna (Molnar et al., 1996). El grupo también contiene el gen rapL cuyo producto RAPL se propone para catalizar la formación del ácido L-p¡pecól¡co precursor de rapamlclna a través de la clclodesamlnaclón de la L-Ilslna (Khaw et al., 1998; Palva et al., 1993). La Introducción de una mutación de desplazamiento de marco en rapL dio lugar a un mutante Incapaz de producir cantidades significativas de rapamicina y la alimentación de ácido L-pIpecólIco a los niveles de tipo silvestre restaurados del medio de crecimiento de la producción de rapamlclna (Khaw et al., 1998). Los precursores bloslntétlcos para el anillo de ciclohexano de rapamlclna se origina a partir de la ruta del ácido shlkímlco (Lowden et al., 1996; Lowden et al., 2001). Otros macrólldos estrechamente relacionados, tales como FK506 (tacrollmus) (Schreiber y Crabtree, 1992), FK520 (ascomlclna o ¡nmunomlclna) (Wu et al., 2000), antascomlclna (Fehr, T., et al., 1996) y meridamicina (Salìturo et al.,

1995) comparten un farmacóforo común que ¡nteractúa con las proteínas de unión FK506 (FKBP) (Figura 2). Por lo tanto, la rapamlclna y compuestos relacionados por ejemplo, pero no se limitan a, FK506, FK520, 'hyg', FK523, meridamicina, antascomlclna, FK525 y tsukubamlclna se pueden considerar "ligandos de FKBP ". Se ha publicado la secuencia parcial del grupo de genes FK506 (Motamedi et al., 1996; Motamedì et al., 1997; Motamedì y Shafiee,

1998) , el grupo hyg' (Ruan et al., 1997) y la secuencia completa del grupo de genes FK520 (Wu et al., 2000; documento de Patente de Estados Unidos N° 6.150.513). Existe una homología significativa entre genes dentro de estos grupos y el grupo de genes bloslntétlcos de rapamicina y similitud en la función enzimàtica (Motamedì et al.,

1996).

Se cree que las acciones farmacológicas de la rapamicina caracterizadas hasta la fecha están mediadas por la Interacción con receptores cltosóllcos denominados FKBP o inmunofilinas.... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto de fórmula:

donde:

x = enlace o CH2, o -GHR6-X-CHR5-- es

R15 =

R1 = OH, OCH3;

R2 = H, OH, OCH3;

R3 = F, Cl y R4 = H, OH, CH3, F, Cl; o R4 = F, Cl y R3 =H, OH, CH3, F, Cl, OCH3; R16 = OH, OCH3;

R17 = Cl, F;

R5 = H, OH;

Re = H, OH;

Rs y R9 en conjunto son =O o H, H; e

y = enlace, CH2.

2. Un compuesto de fórmula:

donde:

x = enlace o CR11, o -CHR6-X-CHR5- es

y = enlace o CHR12;

Ri = OH, OCH3;

15 R2 = H, OH, OCH3;

R3 = halo y R4 = H, OH, OCH3, alquilo, halo, amino, tiol; o R4 = halo y R3 = H, OH, OCH3, alquilo, halo, amino, tiol;

R5, R6, R7, R10, R11, R12, R13, y R14 son cada uno independientemente H, alquilo, halo, hidroxilo; y Rs y R9 en conjunto son =O o H, H.

3. Un compuesto de fórmula:

donde:

x = enlace o CR11, o -CHR6-X-CHR5- es

R1 = O, OCH3; R2 = H, OH, OCH3; R5 = H, alquilo, halo, hidroxi;

R6 = H, alquilo, halo, hidroxi;

R7 = H, alquilo, halo, hidroxi;

Rs, R9 = =O, o H, H;

R10 = H, alquilo, halo, hidroxi;

R<i<i = H, alquilo, halo, hidroxi;

R12 = H, alquilo, halo, hidroxi;

R13 = H, alquilo, halo, hidroxi;

R14 = H, alquilo, halo, hidroxi;

R15 =

R17 = halo.

4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1: donde

Ris es G; y

Rs = F, Cl y R4 = H, OH, CH3, F, Cl o R4 = F, Cl y R3 = H, OH, CH3, F, Cl, OCH3.

5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que es 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-c¡s- metox¡-4-trans-h¡drox¡c¡clohex¡l)-36-(3-f)uoro-4-h¡drox¡c¡clohex¡l) rapamicina.

6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que es 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-c¡s- metoxl-4-trans-h¡drox¡c¡clohex¡l)-36-(3-h¡drox¡-4-fluoroc¡clohex¡l) rapamicina.

7. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que es 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-c¡s- metoxl-4-transh¡drox¡c¡clohex¡l)-36-(3-cloro-4-h¡drox¡c¡clohex¡l) rapamicina.

8. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 que es 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-c¡s- metoxl-4-trans-h¡drox¡c¡clohex¡l)-36-(3-h¡drox¡-4-cloroc¡clohex¡l) rapamicina.

9. Un método para generar un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo dicho método:

(a) generar una cepa recombinante, en la que al menos el homólogo de rapK se ha suprimido o inactivado; y

(b) alimentar una unidad iniciadora no natural a dicha cepa.

10. El método de la reivindicación 9, que comprende adicionalmente suprimir uno o más genes auxiliares adicionales.

11. El método de las reivindicaciones 9 o 10, que comprende adicionalmente restaurar por complementación uno o más de los genes suprimidos.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que comprende adicionalmente la etapa de aislar y purificar los compuestos generados.

13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que dicha unidad iniciadora no natural se selecciona entre el grupo que consiste en:

ácido 3-trans-hldrox¡-4-c¡s-f!uoroc¡clohexano carboxílico; ácido 4-trans-hldrox¡-3-c¡s-f!uoroc¡clohexano carboxílico; ácido 3-c¡s-h¡drox¡-4-trans-f!uoroc¡clohexano carboxílico; ácido 4-c¡s-h¡drox¡-3-trans-f!uoroc¡clohexano carboxílico; ácido 3-cls-h¡drox¡-4-trans-cloroc¡clohexano carboxílico; ácido 4-cls-h¡drox¡-3-trans-cloroc¡clohexano carboxílico; ácido 3-trans-hldroxi-4-c¡s-cloroc¡clohexano carboxílico; y ácido 4-trans-hldroxi-3-c¡s-cloroc¡clohexano carboxílico,

0 ásteres simples o sales de los mismos.

14. El uso de un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer, el tratamiento de infecciones fúngicas, el tratamiento de enfermedades autolnmunes, prollferatlvas y/o hlperproliferativas, el mantenimiento de inmunosupresión, el tratamiento de diabetes, rechazo agudo o crónico de un trasplante de órganos o tejidos, asma, tumores, psoriasis, eccema, artritis reumatolde, flbrosls, alergias o para uso en relación con mecanismos antifibróticos, neuroregenerativos y/o antlanglogénlcos.

15. El uso de un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la fabricación de una endoprótesls vascular.

16. Una endoprótesls vascular que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones

1 a 8.

17. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para uso en el tratamiento de cáncer, el tratamiento de Infecciones fúngicas, el tratamiento de enfermedades autoinmunes, proliferativas y/o hlperproliferativas, el mantenimiento de Inmunosupresión, el tratamiento de diabetes, rechazo agudo o crónico de un

trasplante de órganos o tejidos, asma, tumores, psoriasis, eccema, artritis reumatoide, fibrosis, alergias o para uso en relación con mecanismos antifibróticos, neuroregenerativos y/o antiangiogénicos.