PRODUCCIÓN DE ACEITES MICROBIANOS.

Producción de aceites microbianos.

La presente invención se refiere a la cepa Rhodosporidium toruloicies CECT 13085,

así como a los usos de la misma para la obtención de biomasa microbiana rica en triglicéridos y para la producción de aceites de origen microbiano en presencia de hidrolizados de biomasa lignocelulósica.

PRODUCCIÓN DE ACEITES MICROBIANOS CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la producción de aceites de origen microbiano a partir de cultivos de un microrganismo en presencia de hidrolizados de biomasa lignocelulósica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El creciente problema de las emisiones de C02, además de las preocupaciones relacionadas con la seguridad de la energía, ha incrementado en los últimos años el interés en las fuentes de energía alternativas no basadas en el petróleo. La lignocelolusa es la fuente de biomasa renovable más abundante con una producción mundial anual estimada de unas 1010 toneladas (Sánchez y Cardona, 2008. Bioresour. Technol., 99: 5270-5295), y por ello, esta biomasa es la única fuente de energía primaria renovable que puede proporcionar biocombustibles alternativos como el bioetanol o biodiesel a corto plazo (Hamelinck et al. 2005. Biomass Bioenergy, 28: 384-410; Sánchez, 2009. Biotechnol. Avd., 27: 185-194; Zhang, 2011. Process Biochem. 46: 2091-2110; Huang et al. 2013. Biotechnol. Avd. 31: 129-139).

Sin embargo, aunque la conversión biológica de diferentes materias primas lignocelulósicas como residuos agrícolas, o cultivos energéticos dedicados a la producción de biocombustibles o productos químicos ofrece numerosos beneficios, su desarrollo presenta todavía numerosos obstáculos técnicos y económicos. Uno de los obstáculos más importantes tanto a nivel económico como técnico es la liberación, a un precio económico, de los azúcares presentes en la biomasa (Lynd et al. 2008. Nature Biotechnol. 26: 169-172; Zhang, 2011. Process Biochem. 46. 2091-2110). De hecho, esta etapa está considerada como la más cara del proceso de producción de etanol pudiendo alcanzar hasta el 40% de los costes totales del proceso. A lo largo de los últimos años se ha desarrollado un gran número de estrategias de pretratamiento sobre diferentes tipos de materias primas como hidrólisis ácida, hidrólisis alcalina, explosión de vapor, explosión de amonio o hidrotratamiento térmico, entre otras (Yang y Wyman, 2008. Biofuels Bioprod. Bior. 2: 26-40; Hendriks y Zeeman, 2009. Bioresour. Technol. 100: 10-18; Alvira et al. 2010. Bioresour. Technol. 101: 4851-4861).

Uno de los puntos más importantes a considerar la hora de desarrollar un proceso de pretratamiento es minimizar la cantidad de compuestos tóxicos que se generan en esta etapa ya que son potentes inhibidores del metabolismo microbiano afectando al crecimiento (Palmquist y Hahn-Hágerdal. 2000. Bioresour. Technol. 74: 17-24). La cantidad y variedad de compuestos depende del tipo de pretratamiento y de la naturaleza de la materia prima debido a los diferentes grados de metoxilación de la lignina y su asociación con la hemicelulosa y celulosa. Los productos de degradación que se generan durante el pretratamiento del material lignocelulósico pueden ser de tres tipos: ácidos carboxílicos, derivados del furano y compuestos fenólicos (Palmqvist y Hágerdal. 2000. Bioresour. Technol. 74: 25-33; Almeida et al., 2007. J. Chem. Technol. Biotechnol. 82: 340-349). Los ácidos acético, fórmico y levulínico son los principales ácidos débiles. Los principales derivados del furano son el furfural y el 5-hidroximetilfurfural que se obtienen a partir de la degradación de las hexosas y pentosas. Los compuestos fenólicos incluyen alcoholes, aldehidos, cetonas y ácidos (Klinke et al. 2002. Bioresour. Technol. 82: 15-26).

Con el fin de minimizar los costes del proceso, el producto resultante del pretratamiento (slurry) debe ser empleado directamente para llevar a cabo sacarificación de la celulosa y hemicelulosa. Además, este proceso de hidrólisis debe realizarse empleando la mayor concentración posible de slurry (indicada como porcentaje de sólidos). Las concentraciones de slurry, en procesos industriales, deben alcanzar, como mínimo, valores entre un 15-20% de sólidos ya que permite reducir los volúmenes de operación y obtener soluciones con una alta concentración de azúcares (120-140 g/l). Sin embargo, existen dos problemas principales a la hora de emplear estas soluciones de azúcares directamente como parte de un medio de cultivo: en primer lugar, la presencia de los compuestos tóxicos ya mencionados (Palmquist y Hahn-Hágerdal. 2000. Bioresour. Technol. 74: 17-24; Almeida et al., 2009. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82: 625-638) y, en segundo lugar, la necesidad de metabolizar todas las pentosas (fundamentalmente xilosa) presentes en estas mezclas con el fin de utilizar todos los azúcares e incrementar el rendimiento final de los posteriores procesos de cultivo.

Aunque estos inhibidores pueden ser eliminados de forma eficiente por diferentes procesos de destoxificación (Mussatto y Roberto. 2004. Bioresour Technol 93: 1-10; Sánchez y Cardona. 2008. Bioresour. Technol., 99: 5270-5295; Almeida et al. 2009. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82: 625-638), su aplicación incrementa el coste de producción de etanol y,

además, conlleva una pérdida de azúcares fermentables. Existen algunos procesos de hidrólisis y pretratamiento, utilizados con materias primas agrícolas y herbáceas, que dan lugar a hidrolizados fermentables que no requieren destoxificación (Mosier y col., 2005. Bioresour. Technol. 96:1986-1993). Sin embargo, el consumo de agua en estos casos es elevado por lo que, teniendo presente el consumo/ahorro de agua, es necesario que los hidrolizados de cualquier tipo de biomasa lignocelulósica sean concentrados. Por ello, es previsible que los compuestos formados durante dicho proceso alcancen niveles inhibitorios.

Aunque existen microorganismos, bacterias, hongos filamentosos y levaduras, capaces de fermentar D-xilosa de forma natural (Jeffries. 2006. Curr. Opin. Biotechnol. 17: 320-326; Hahn-Hágerdal et al. 2007. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74:937-953), la mayoría de los microorganismos prefieren glucosa sobre otros azúcares monoméricos (ej. xilosa) y no asimilan estos últimos hasta que la glucosa es consumida (Gancedo. 1998. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 334-361). La utilización simultánea de glucosa y otros azúcares es raramente observada. Sin embargo, la utilización rápida y simultánea de mezclas de estos azúcares se considera esencial para la viabilidad económica de la producción de biocombustibles u otros productos químicos (ej. aceites) a partir de hidrolizados de biomasa (Rubín. 2008. Nature. 454: 841-845; Huang et al. 2013. Biotechnol. Avd. 31: 129-139). Se han empleado varias estrategias para intentar solventar la represión por glucosa como el control de la tasa de alimentación (Gong et al. 2012. Bioresour. Technol. 117: 20-24), reducir la actividad de la hexoquinasa, o mediante la obtención de mutantes resistentes a la 2-deoxiglucosa (Kahar etal. 2011. J. Biosc. Bioeng. 5: 557-563).

La capacidad de ciertos microorganismos de acumular grandes cantidades de lípidos es conocida desde años. Estos microorganismos se denominan oleaginosos por similitud con el térmico empleado con las semillas vegetales y se definen como aquellos capaces de acumular, al menos, un 20% de su peso seco en forma de lípidos (Ratledge y Wynn. 2002. Avd. Appl. Microbiol. 51: 1-51; Ratledge. 2004. Biochemie. 86: 807-815). Entre este tipo de microorganismos se encuentran varios géneros de levaduras como Yarrowia, Candida, Rhodotorula, Rhodosporídium, Críptococcus, Trichosporon, y Lipomyces. Varias especies pertenecientes a estos géneros son capaces de acumular hasta un 50-70% de su peso seco en forma de lípidos (Ageitos et al. 2011. Appl. Microbiol. Biotechnol. 90: 1219-1227; Beopoulos et al. 2011. Appl. Microbiol. Biotechnol. 90: 1193-1206). La acumulación de lípidos se produce en presencia de exceso de diferentes fuentes de carbono como glucosa, glicerol, suero lácteo, melazas e, incluso, xilosa en el caso de especies como Rhodosporídium toruloides (Freeret al. 1997. Biotechnol. Lett. 19: 1119-1122; Li etal. 2010.

J. Biobased Mat. Bioenergy. 4: 53-57), Rhodotorula glutinis (Dai et al. 2007. African J. Biotechnol. 6: 2130-2134), Tríchosporon cutaneum (Chen et al. 2009. Appl. Biochem. Biotechnol. 159: 276-290) o Tríchosporon fermentaos (Huang et al. Bioresour. Technol. 100: 4535-4538), entre otras.

Rhodosporidium toruloides es uno de los organismos oleaginosos con mayor potencial para el desarrollo de procesos industriales debido a su capacidad para crecer hasta altas densidades celulares, fácil escalado y a su capacidad para acumular lípidos mayoritariamente en forma de triglicéridos (W02009118438; Zhao et al. 2010. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1: 1-6; Ageitos etal. 2011. Appl. Microbiol. Biotechnol. 90: 1219-1227).

Sin embargo, Rhodosporidium toruloides no es capaz de crecer directamente en hidrolizados de bagazo de caña o de paja de trigo, preparados a partir de un 10%... [Seguir leyendo]

1. Microorganismo de la cepa Rhodosporídium tornloides CECT 13085 o de una cepa mutante de la misma, que mantiene la capacidad de acumular lípidos hasta al menos un 50% del peso seco, la capacidad de crecer en presencia de hidrolizados de biomasa sin detoxificar y/o la capacidad de metabolizar xilosa.

2. Procedimiento para obtener una biomasa microbiana rica en triglicéridos, que comprende

i) cultivar un microorganismo según la reivindicación 1, en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono y al menos una fuente de nitrógeno, en condiciones adecuadas para el crecimiento de dicho microorganismo, y

ii) separar la biomasa microbiana del medio de cultivo,

3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicación 2, en donde la fuente de carbono es un hidrolizado de biomasa lignocelulósica.

4. Procedimiento, según la reivindicación 3, en donde la fuente de carbono comprende además, glicerol.

5. Procedimiento, según las reivindicaciones 3 o 4, en donde el hidrolizado se obtiene de paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, bagazo de maíz, racimos vacíos de palma aceitera, poda de palma aceitera, fibra de palma aceitera, poda de vid, poda de olivo y combinaciones de las mismas.

6. Procedimiento según la reivindicación 2, en donde la fuente de carbono se selecciona del grupo que consiste en glucosa, glicerol, melazas, xilosa, arabinosa, mañosa, fructosa, acetato y combinaciones de las mismas.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en donde la fuente de carbono es glucosa.

8. Procedimiento según la reivindicación 6, en donde la fuente de carbono es xilosa.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en donde la fuente de

nitrógeno se selecciona del grupo que consiste en extracto de levadura, peptona,

líquido macerado de maíz, urea, glutamato sódico, diferentes fuentes de nitrógeno inorgánico, como sales de amonio y combinaciones de las mismas.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9 en donde la fuente de nitrógeno es una sal de amonio, preferiblemente cloruro de amonio.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10 en donde el medio de cultivo contiene inhibidores sólidos seleccionados de: ácido acético, ácido fórmico, ácido levulínico, ácido cumárico, ácido ferúlico, ácido succínico, 4-hidroxibenzaldehído, vanillina, ácido vaníllico, siringaldehido, ácido 4-hidroxibenzoico, catecol, guaicol, ácido siríngico, furfural, 5-hidroximetilfurfural y combinaciones de los mismos.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 11, en donde las condiciones adecuadas para el crecimiento de dicho microorganismo de la etapa (i) comprenden

- temperatura en un rango entre 18 0C y 37 0C,

- concentración de oxígeno disuelto de al menos el 20%, y/o

- agitación constante.

13. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12 en donde la etapa ii) se realiza mediante un método seleccionado del grupo que consiste en filtración, microfiltración, centrifugación y combinaciones de los mismos.

14. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, que comprende además secar la biomasa microbiana de la etapa ii).

15. Biomasa microbiana rica en triglicéridos obtenible según el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14.

16. Procedimiento para obtener una preparación enriquecida en lípidos que comprende

i) obtener una biomasas microbiana según la reivindicación 15 y

ii) extraer los lípidos de dicha biomasa microbiana.

17. Procedimiento según la reivindicación 16 en donde la extracción de la etapa (ii) se lleva cabo mediante métodos mecánicos o mediante un método de extracción sólido- líquido

18. Procedimiento según la reivindicación 17, en donde el método de extracción mecánica se realiza usando prensa de tornillo, prensa francesa o molino de bolas.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en donde el método de extracción sólido- líquido se realiza usando un disolvente orgánico inmiscible en agua.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, en donde dicho disolvente orgánico inmiscible en agua se selecciona del grupo que consiste en n-hexano, acetona, éter de petróleo, éter-etílico y combinaciones de los mismos.

21. Procedimiento para obtener parafinas que comprende las etapas de:

i) obtener una preparación enriquecida en lípidos a partir de una biomasa microbiana según la reivindicación 15,

ii) refinar los lípidos obtenidos en la etapa ii) y

iii) convertir la mezcla de lípidos refinados obtenidos en la etapa ii) en parafinas.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, en donde la etapa ii) se realiza mediante al menos un lavado con NaOH a una concentración entre 5% y 15%.

23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21 o 22 en donde la etapa iii) comprende un procedimiento de hidrotratamiento o hidroprocesamiento

24. Procedimiento según la reivindicación 23, en donde el método de hidrotratamiento comprende

- poner en contacto la mezcla de lípidos refinados obtenidos en la etapa ii) con

agua,

- aplicar una temperatura y presión elevadas, y

- separar la fase orgánica del agua.

25. Procedimiento según la reivindicación 23 en donde el método de hidroprocesamiento comprende

- hidrogenar la mezcla de lípidos refinados obtenidos en la etapa ii), y

- desoxigenar dicha mezcla de lípidos refinados.

26. Procedimiento según la reivindicación 25, en donde la hidrogenación y desoxigenación de dicha mezcla de lípidos refinados se realiza en la misma etapa o en etapas consecutivas.

27. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 25 o 26, en donde el método de hidroprocesamiento se lleva a cabo a temperatura y presión elevadas.

28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, que comprende adicionalmente un proceso de craqueo catalítico en condiciones adecuadas para convertir las parafinas obtenidas en la etapa ii) en bioqueroseno.

29. Procedimiento según la reivindicación 28, en donde dicho craqueo catalítico emplea un catalizador sólido.

30. Procedimiento para obtener biodiesel que comprende las etapas de

i) obtener una preparación enriquecida en lípidos a partir de la biomasa microbiana según la reivindicación 15,

ii) refinar los lípidos obtenidos en la etapa i) y

iii) convertir la mezcla de lípidos refinados obtenidos en la etapa ii) en biodiesel.

31. Procedimiento para obtener biolubricantes que comprende las etapas de

i) obtener una preparación enriquecida en lípidos a partir de la biomasa

microbiana según la reivindicación 15,

ii) refinar los lípidos obtenidos en la etapa i) y

iii) convertir la mezcla de lípidos refinados obtenidos en la etapa ii) en

biolubricantes.

32. Procedimiento para obtener biosurfactantes que comprende las etapas de: a partir de, que comprende:

i) obtener una preparación enriquecida en lípidos a partir de la biomasa

microbiana según la reivindicación 15,

ii) refinar los lípidos obtenidos en la etapa i) y

iii) convertir la mezcla de lípidos refinados obtenidos en la etapa ii) en

biolubricantes.

33. Uso del microorganismo según la reivindicación 1 o de la biomasa microbiana rica en triglicéridos según la reivindicación 15 para obtener una preparación enriquecida en

lípidos, para obtener parafinas, para obtener biodiesel, para obtener biolubricantes o para obtener biosurfactantes.