Procedimiento para preparar conjugados de anticuerpo maitansinoide.

Un procedimiento para preparar un conjugado anticuerpo-maitansinoide,

que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un anticuerpo con un reactivo de reticulación bifuncional para unir covalentemente un enlazador al anticuerpo y preparar de este modo una primera mezcla que comprende anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos,

(b) someter la primera mezcla a cromatografía adsortiva y preparar de este modo una primera mezcla purificada de anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos,

(c) conjugar un maitansinoide con los anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos en la primera mezcla purificada haciendo reaccionar los anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos con un maitansinoide en una solución que tiene un pH de 4 a 9 para preparar una segunda mezcla que comprende (i) anticuerpo acoplado químicamente mediante el enlazador al maitansinoide, (ii) maitansinoides libres y (iii) subproductos de reacción, y

(d) someter la segunda mezcla a cromatografía adsortiva para purificar los anticuerpos acoplados químicamente mediante los enlazadores al maitansinoide de los otros componentes de la segunda mezcla y preparar de este modo una segunda mezcla purificada de anticuerpos acoplados químicamente mediante los enlazadores al maitansinoide.

Procedimiento para preparar conjugados de anticuerpo maitansinoide Campo de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento para preparar conjugados de pureza y estabilidad sustancialmente altas, en donde los conjugados comprenden un agente de unión a células acoplado químicamente a un fármaco, como se define en las reivindicaciones.

Antecedentes de la invención

El tratamiento del cáncer ha progresado significativamente con el desarrollo de productos farmacéuticos que acceden y matan más eficazmente a las células cancerosas. Para este fin, los investigadores han aprovechado receptores superficiales celulares y antígenos expresados selectivamente por las células cancerosas para desarrollar fármacos basados en anticuerpos que se unen a los antígenos específicos de tumores o asociados a tumores. A este respecto, moléculas citotóxlcas tales como toxinas de bacterias y plantas, radionúclidos y ciertos fármacos quimioterapéuticos han sido enlazados químicamente a anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos superficiales celulares específicos de tumores o asociados a tumores (véanse, p.ej., las solicitudes de patente internacionales WO 00/02587, WO 02/060955 y WO 02/092127, las patentes de EE.UU. 5.475.092, 6.340.701 y 6.171.586, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2003/004210 A1, y Ghetie et al., J. Immunol. Methods, 112: 267-277 (1988)). Tales compuestos se denominan típicamente "conjugados" de toxinas, de radionúclidos y de fármacos, respectivamente. A menudo, también se denominan inmunoconjugados, radlolnmunoconjugados, e inmunotoxinas. La muerte de la célula tumoral se produce tras la unión del conjugado de fármaco a una célula tumoral y la liberación y/o activación de la actividad citotóxica del fármaco. La selectividad proporcionada por los conjugados de fármaco minimiza la toxicidad hacia las células normales, aumentando de este modo la tolerabilidad del fármaco en el paciente.

Se han descrito previamente procedimientos para conjugar anticuerpos a agentes citotóxicos que contienen sulfhldrllo tales como maitansinoides (véanse, p.ej., las patentes de EE.UU. 5.208.020, 5.416.064 y 6.441.163). Por ejemplo, las patentes de EE UU. 5.208.020 y 5.416.064 describen un procedimiento para fabricar conjugados antlcuerpo-maitansinoide en los que el anticuerpo se modifica primero con un reactivo heterobifuncional tal como se describe en las patentes EE.UU. 4.149.003, 4.563.304 y la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2004/0241174 Al. Las patentes de EE.UU. 5.208.020 y 5.416.064 describen además la conjugación de un anticuerpo modificado con un exceso de un agente citotóxico que contiene sulfhidrilo a pH 7, seguido de la purificación en columnas de cromatografía Sephadex G25. La purificación de conjugados anticuerpo-fármaco por cromatografía de exclusión de tamaños (SEC) también ha sido descrita (véase, p.ej., Liu et al, Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 93: 8618-8623 (1996) y Chari et al., Cáncer Research, 52: 127-131 (1992)).

Los procedimientos que se han descrito previamente para la preparación de los conjugados anticuerpo-fármaco son complejos, porque son obstaculizados con etapas que son incómodas de realizar o producen inmunoconjugados que son menos puros o menos estables que lo óptimamente deseado. Por ejemplo, la conjugación a un pH de entre 6,0 y 6,5 no es óptima para producir conjugados puros y estables. Además, las reacciones de conjugación bajo estas condiciones son generalmente lentas e ineficaces, conduciendo a un requisito de excesivo tiempo y utilización de material.

Sería deseable modificar o eliminar una o más etapas de preparación sin comprometer la calidad del producto, tal como la pureza y/o la estabilidad. Sería deseable además tener opciones de purificación adicionales que las que se han descrito hasta ahora, en la medida que algunas opciones serán más eficaces con ciertas combinaciones de agentes de unión a células, enlazadores y fármacos, que con otros.

En vista de lo anterior, hay una necesidad en la técnica de desarrollar métodos mejorados de preparación de composiciones de conjugados agente de unión a células-fármaco que sean de pureza sustancialmente alta y al mismo tiempo tengan mayor estabilidad. Se describe tal método.

Breve compendio de la invención

Se describe un procedimiento para preparar un conjugado de pureza y estabilidad sustancialmente altas que comprende un agente de unión a células acoplado químicamente a un fármaco. El procedimiento comprende (a) poner en contacto un agente de unión a células con un reactivo de reticulación bifuncional para unir covalentemente un enlazador al agente de unión a células y preparar de este modo una primera mezcla que comprende agentes de unión a células que tienen enlazadores unidos a los mismos, (b) someter la primera mezcla a cromatografía adsortiva, y preparar de este modo una primera mezcla purificada de agentes de unión a células que tienen enlazadores unidos a los mismos, (c) conjugar un fármaco con los agentes de unión a células que tienen enlazadores unidos a los mismos en la primera mezcla purificada haciendo reaccionar los agentes de unión a células que tienen enlazadores unidos a los mismos con un fármaco en una solución que tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9 para preparar una segunda mezcla que comprende (i) agente de unión a células acoplado químicamente mediante el enlazador al fármaco, (ii) fármaco libre y (iii) subproductos de reacción,

y (d) someter la segunda mezcla a cromatografía adsortiva para purificar los agentes de unión a células acoplados químicamente mediante los enlazadores al fármaco de los otros componentes de la segunda mezcla y preparar de este modo una segunda mezcla purificada, como se describe en las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención

Se describe un procedimiento para preparar conjugados agente de unión a células-fármaco de pureza y estabilidad sustancialmente altas. Tales composiciones se pueden usar para tratar enfermedades, debido a la alta pureza y estabilidad de los conjugados. Se describen composiciones que comprenden un agente de unión a células, tal como un anticuerpo, acoplado químicamente a un fármaco, tal como un maitansinoide, en, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 2004/0241174 A1. En este contexto, se considera que pureza sustancialmente alta es: (a) más que 90%, preferiblemente más que 95% de las especies conjugadas son monoméricas, y/o (b) el nivel de fármaco libre en la preparación del conjugado es menor que 2% (relativo al fármaco total).

A este respecto, el procedimiento descrito comprende (a) modificar el agente de unión a células con un reactivo de reticulación bifuncional para unir covalentemente un enlazador al agente de unión a células y preparar de este modo una primera mezcla que comprende agentes de unión a células que tienen enlazadores unidos a los mismos, (b) someter la primera mezcla a cromatografía adsortiva, para purificar los agentes de unión a células que tienen enlazadores unidos a los mismos de otros componentes de la primera mezcla y preparar de este modo una primera mezcla purificada de agentes de unión a células que tienen enlazadores unidos a los mismos, (c) conjugar un fármaco con los agentes de unión a células que tienen enlazadores unidos a los mismos en la primera mezcla purificada haciendo reaccionar los agentes de unión a células que tienen enlazadores unidos a los mismos con el fármaco en una solución que tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 9 para preparar una segunda mezcla que comprende (I) agente de unión a células acoplado químicamente mediante el enlazador al fármaco, (ii) fármaco libre y (i¡¡) subproductos de reacción, y (d) someter la segunda mezcla a cromatografía adsortiva para retirar los fármacos no conjugados, los reaccionantes y los subproductos, así como para obtener conjugados agente de unión a células-fármaco sustancialmente purificados, según las reivindicaciones.

Preferiblemente, se utilizan resmas de cromatografía adsortiva en las etapas de purificación. En una descripción adicional, se utilizan resinas de cromatografía adsortiva en ambas etapas de purificación.

Se puede utilizar cualquier resina de cromatografía adsortiva adecuada. Las resinas de cromatografía adsortiva preferidas incluyen resmas para cromatografía con hidroxiapatita, cromatografía de inducción de carga hidrófoba (HCIC), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de Intercambio iónico de modo mixto, cromatografía de afinidad con metal inmovilizado (IMAC), cromatografía de ligando colorante, cromatografía de afinidad,... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para preparar un conjugado anticuerpo-maitansinoide, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto un anticuerpo con un reactivo de reticulación bifuncional para unir covalentemente un enlazador al anticuerpo y preparar de este modo una primera mezcla que comprende anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos,

(b) someter la primera mezcla a cromatografía adsortiva y preparar de este modo una primera mezcla purificada de anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos,

(c) conjugar un maitansinoide con los anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos en la primera mezcla purificada haciendo reaccionar los anticuerpos que tienen enlazadores unidos a los mismos con un maitansinoide en una solución que tiene un pH de 4 a 9 para preparar una segunda mezcla que comprende (i) anticuerpo acoplado químicamente mediante el enlazador al maitansinoide, (ii) maitansinoides libres y (iii) subproductos de reacción, y

(d) someter la segunda mezcla a cromatografía adsortiva para purificar los anticuerpos acoplados químicamente mediante los enlazadores al maitansinoide de los otros componentes de la segunda mezcla y preparar de este modo una segunda mezcla purificada de anticuerpos acoplados químicamente mediante los enlazadores al maitansinoide.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde la cromatografía adsortiva se selecciona del grupo que consiste en cromatografía con hidroxiapatita, cromatografía de inducción de carga hidrófoba (HCIC), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de intercambio iónico de modo mixto, cromatografía de afinidad con metal inmovilizado (IMAC), cromatografía de ligando colorante, cromatografía de afinidad, cromatografía de fase inversa, y combinaciones de las mismas.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la solución en la etapa (c) tiene un pH de 4 a 6.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que la solución en la etapa (c) tiene un pH de 6,5 a 9.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la solución en la etapa (c) comprende

sacarosa.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la solución en la etapa (c) comprende un agente amortiguador seleccionado del grupo que consiste en un tampón citrato, un tampón acetato, un tampón succinato y un tampón fosfato.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal

humanizado.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en huN901, huMy9-6, huB4, huC242, trastuzumab, bivatuzumab, sibrotuzumab, CNT095, huDS6 y rituximab.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el anticuerpo es trastuzumab.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el maitansinoide es N2'-desacetil-N2'-(3- mercapto-1-oxopropil)-maitansina (DM1).

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el maitansinoide es N2'-desacetil-N2'-(4- metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina (DM4).

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el anticuerpo se acopla químicamente al maitansinoide por medio de enlaces químicos seleccionados del grupo que consiste en enlaces disulfuro, enlaces lábiles con ácidos, enlaces fotolábiles, enlaces lábiles con peptidasa, enlaces tioéter y enlaces lábiles con esterasa.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que el reactivo de reticulación bifuncional se selecciona del grupo que consiste en 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(2- piridilditio)butanoato de N-succinimidilo (SPDB), 4-(2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP), 4- (maleimidometil)ciclohexanocarboxilato de N-succinimidilo (SMCC), 4-(maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxi-(6- amidocaproato) de N-succinimidilo (LC-SMCC), áster de N-succinimidilo del ácido K-maleimidoundecanoico (KMUA), áster de N-succinimidilo del ácido y-maleimidobutírico (GMBS), áster de hidroxisuccinimida del ácido £- maleimidocaproico (EMCS), áster de m-maleidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), áster de N-(a- maleimidoacetoxi)-succinimida (AMAS), 6-(P-maleimidopropionamido)hexanoato de N-succinimidilo (SMPH), 4-(p- maleimidofenil)-butirato de N-succinimidilo (SMPB), isocianato de N-(p-maleimidofenilo) (PMPI), 4-(yodoacetil)-

aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB), yodoacetato de N-succinimidilo (SIA), bromoacetato de N-succinimidilo (SBA) y 3-(bromoacetamido)propionato de N-succinimidilo (SBAP).