Polimorfismos del factor H en el diagnóstico y terapia de enfermedades inflamatorias tales como degeneración macular relacionada con la edad.

Un método para determinar la existencia de un factor de riesgo para Degeneración Macular Relacionada con la Edad (AMD) en una muestra de plasma obtenida de un individuo que comprende:

a) exponer dicha muestra a al menos un anticuerpo, o un fragmento del mismo que comprende al menos la Región Determinante de Complementariedad, específico para:

i) la variante de histidina 402 del Factor H del Complemento en la que dicho anticuerpo se secreta por el clon depositado con la referencia 07042601, o un fragmento del mismo que comprende al menos la Región determinante de Complementariedad; o

ii) la variante de tirosina 402 de Factores H del Complemento en la que dicho anticuerpo se secreta por el clon depositado con la referencia 08011002, o un fragmento del mismo que comprende al menos la Región Determinante de Complementariedad;

b) determinar la unión específica de dicho anticuerpo con el Factor H del Complemento de plasma y cuando tenga lugar unión del anticuerpo secretado por el clon depositado con la referencia 07042601 concluir que la variante de histidina 402 está presente, o cuando tenga lugar la unión del anticuerpo secretado por el clon depositado con la referencia 08011002 concluir que está presente la variante de tirosina 402; y

c) cuando esté presente la variante de histidina 402 concluir que el individuo tiene, o está en mayor riesgo de desarrollar AMD, o cuando la unión del anticuerpo específico de tirosina indique un estado homocigoto para la variante de tirosina concluir que el individuo está en menor riesgo de desarrollar AMD.

Polimorfismos del factor H en el diagnóstico y terapia de enfermedades inflamatorias tales como degeneración macular relacionada con la edad La invención se refiere a un método de diagnóstico para determinar la existencia de un factor de riesgo para degeneración macular relacionada con la edad (AMD) ; un kit para el mismo y partes componentes del mismo y, en particular, anticuerpos usados en la metodología y kit anteriormente mencionados.

La Degeneración Macular Relacionada con la Edad es una causa habitual de ceguera y su incidencia, en el mundo occidental y en particular en Norteamérica y Europa, está aumentando, parcialmente debido a la creciente edad de la población (1) . Se concluye por lo tanto que la importancia de esta enfermedad con respecto a costes en el cuidado de la salud y calidad de vida para los individuos afectados probablemente aumente durante los próximos años.

La enfermedad se caracteriza por la aparición de depósitos retinianos, denominados drusas, que se cree que forman una barrera entre el epitelio pigmentado retiniano y la circulación coroidal. Los depósitos conducen al crecimiento de nuevos vasos sanguíneos del coroides a la retina. Estos nuevos vasos tienden a ser delicados y pueden tener fugas o sangrar. Este síntoma da lugar a la forma "húmeda" de la Degeneración Macular Relacionada con la Edad y provoca degeneración disciforme que conduce a una distorsión de la imagen y pérdida rápida de la visión. Sin embargo, incluso si esto no sucede, algunas áreas de la retina pueden atrofiarse, posiblemente debido a la anoxia. Este último síntoma se conoce como la forma "seca" de la enfermedad, también conocida como atrofia geográfica.

Como se apreciará, manifestaciones tardías de la enfermedad dan como resultado la incapacidad para leer y realizar tareas diarias. Existe por lo tanto una necesidad urgente para el diagnóstico temprano de la afección y por lo tanto el uso temprano de medidas profilácticas o terapéuticas para evitar la pérdida irreversible de la visión central.

Existe varios tipos de tratamiento para la enfermedad incluyen inyección intravítrea de anti VEGF así como corticosteroides. Otras formas de tratamiento incluyen terapia con láser y tratamiento quirúrgico tal como traslocación de la retina y terapia fotodinámica.

Se ha mostrado que una variante en el gen del Factor H del Complemento (CFH) , aumenta el riesgo de AMD (2) (2a) . Esta variante es un polimorfismo que resulta de la sustitución del nucleótido T a C en la posición 1277 en el exón 9; una forma de CFH tiene el aminoácido histidina en la posición 402 (H402) y la otra variante tiene una tirosina (Y402) . Es la forma de histidina la que se asocia con AMD y otras enfermedades inflamatorias. Por ejemplo, el mismo factor de riesgo (CFH H402) se asocia con otras patologías en las que está implicado el complemento, incluyendo infarto de miocardio (3) . Aunque la asociación de este factor de riesgo de Y402H con la enfermedad es significativa en AMD, se piensa que el diagnóstico de este riesgo junto con otros factores de riesgo (tales como H402 además de niveles elevados de CRP) es particularmente importante.

CFH tiene un papel importante que desempeñar en el control del sistema del Complemento.

El sistema de complemento es una defensa importante contra patógenos. Tras su activación, el sistema del complemento conduce la inflamación, activa células inmunitarias y destruye directamente a invasores. Este potente sistema proinflamatorio tiene el potencial de provocar daño a uno mismo cuando se activa en un grado inapropiado o en un sitio inapropiado. Para restringir esta tendencia a perjudicar a uno mismo, el complemento está estrechamente controlado por una batería de proteínas reguladoras presentes tanto en el plasma como en las membranas celulares. El Factor H del Complemento es un regulador de complemento de fase fluida, presente en plasma a 0, 2 - 0, 5 g/l, desempeña un papel clave en la regulación del sistema de complemento, específicamente el bucle de amplificación de la ruta alternativa. En los pocos individuos con deficiencia heredada del Factor de Complemento H, el sistema de complemento experimenta activación incontrolada, que consume las proteínas del complemento y hace al individuo deficiente en el complemento (y por lo tanto susceptible a infecciones) (4) . También se han ligado recientemente cambios más sutiles en el Factor de Complemento H con la enfermedad humana. Las mutaciones agrupadas en el dominio carboxilo terminal de la proteína se han ligado con síndrome urémico hemolítico atípico y, como se ha mencionado, un polimorfismo común que provoca una sustitución de un único aminoácido en el medio de la molécula en la posición 402 está asociado fuertemente con la Degeneración Macular Relacionada con la Edad (AMD) (5) . Homocigotos individuales para histidina en la posición 402, aproximadamente 10 % de la población caucásica, tienen un riesgo aumentado 6-7 veces de desarrollar AMD en comparación con los homocigotos para tirosina en esta posición (2, 5) . 50 % de la población caucásica son heterocigotos para los dos alelos, H402 e Y402, estos individuos tienen un riesgo aumentado aproximadamente 3 veces. La razón precisa por la que este cambio pequeño en la molécula del factor H grande altera tan profundamente el riesgo de AMD no está clara, aunque se están acumulando pruebas de que las dos formas difieren en su capacidad para unirse a células y tejidos (6) .

Conocer el estado polimórfico del Factor de H del Complemento de un individuo en riesgo de AMD (esencialmente, todas las personas ancianas) y otras enfermedades mediadas por el complemento sería útil tanto en la predicción del riesgo como en la orientación de las intervenciones o modificaciones de comportamiento para reducir el riesgo. Por ejemplo, el tabaquismo y la obesidad están asociados de forma independiente con el riesgo aumentado de AMD y en homocigotos H402 podrían realizarse grandes esfuerzos para eliminar estos factores modificables. En la

actualidad, la única manera de descubrir el estado polimórfico del Factor H del Complemento de un individuo es secuenciar el gen. Esto implica obtener sangre nueva, extraer ADN de células y secuenciar la región relevante del gen que codifica el Factor H del Complemento, métodos que son tediosos, consumen tiempo y solo son posibles en un laboratorio especialista. Un sencillo análisis de sangre que identificara con fiabilidad el estado polimórfico del factor H permitiría la exploración rápida de los ancianos en cuidados primarios o clínicas oculares.

El Factor H del Complemento consiste en 1213 aminoácidos dispuestos en 20 unidades homólogas, cada una de aproximadamente 60 aminoácidos de longitud. Las unidades repetidas de 60 aminoácidos de longitud son homólogas de las halladas en un gran número de otras proteínas del complemento y no del complemento. Dado que las dos variantes polimórficas difieren solamente en un único aminoácido de los 1213 restos de la proteína, no fue evidente que pudieran generarse anticuerpos que distinguieran las dos formas variantes de CFH.

Sin embargo, usando métodos de exploración selectivos, los inventores han sido capaces de producir un anticuerpo que es específico para la variante H402 y un anticuerpo adicional que es específico para la variante Y402, cada uno, o ambos, de estos anticuerpos permite la producción de un ensayo de diagnóstico fiable y repetible a partir de muestras de plasma para determinar los individuos en riesgo de AMD.

Declaraciones de invención De acuerdo con un primer aspecto de la invención se proporciona por lo tanto un método para determinar la existencia de un factor de riesgo para Degeneración Macular Relacionada con la Edad (AMD) en una muestra de plasma obtenida de un individuo que comprende:

a) exponer dicha muestra a al menos un anticuerpo, o un fragmento del mismo que comprende al menos la Región Determinante de Complementariedad, específica para:

i) la variante de histidina 402 del Factor H del Complemento en la que dicho anticuerpo se secreta por el clon depositado con la referencia 07042601, o un fragmento del mismo que comprende al menos la Región Determinante de Complementariedad; o ii) la variante de tirosina 402 de los Factores H del Complemento en la que dicho anticuerpo se secreta por el clon depositado con la referencia 08011002, o un fragmento del mismo que comprende al menos la Región Determinante de Complementariedad;

b) determinar la unión específica de dicho anticuerpo con el Factor H del Complemento en plasma y en el que la unión del anticuerpo secretado por el clon depositado con la referencia 07042601 tiene lugar concluyendo que está presente la variante de histidina 402,... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar la existencia de un factor de riesgo para Degeneración Macular Relacionada con la Edad (AMD) en una muestra de plasma obtenida de un individuo que comprende:

a) exponer dicha muestra a al menos un anticuerpo, o un fragmento del mismo que comprende al menos la Región Determinante de Complementariedad, específico para:

i) la variante de histidina 402 del Factor H del Complemento en la que dicho anticuerpo se secreta por el clon depositado con la referencia 07042601, o un fragmento del mismo que comprende al menos la Región determinante de Complementariedad; o ii) la variante de tirosina 402 de Factores H del Complemento en la que dicho anticuerpo se secreta por el clon depositado con la referencia 08011002, o un fragmento del mismo que comprende al menos la Región Determinante de Complementariedad;

b) determinar la unión específica de dicho anticuerpo con el Factor H del Complemento de plasma y cuando tenga lugar unión del anticuerpo secretado por el clon depositado con la referencia 07042601 concluir que la variante de histidina 402 está presente, o cuando tenga lugar la unión del anticuerpo secretado por el clon depositado con la referencia 08011002 concluir que está presente la variante de tirosina 402; y c) cuando esté presente la variante de histidina 402 concluir que el individuo tiene, o está en mayor riesgo de desarrollar AMD, o cuando la unión del anticuerpo específico de tirosina indique un estado homocigoto para la variante de tirosina concluir que el individuo está en menor riesgo de desarrollar AMD.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa b) implica el uso solamente de anticuerpo secretado por el clon depositado con la referencia 08011002, o un fragmento del mismo que comprende al menos la Región Determinante de Complementariedad, y la etapa c) implica un ensayo cuantitativo para determinar si el individuo es homocigoto para la variante de tirosina.

3. El método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que después de la etapa b) se retiran los anticuerpo no unidos de modo que la determinación posterior de la unión pueda llevarse a cabo sin, o con la mínima cantidad de, interferencia de fondo de anticuerpos no unidos.

4. El método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en el que la etapa a) se sigue de una etapa que implica exponer plasma al anticuerpo o un fragmento de anticuerpo que comprende al menos la Región Determinante de Complementariedad que reconoce ambas variantes del Factor H del Complemento en el que el anticuerpo se secreta por el clon depositado con la referencia 08011003 y cualquier proteína de plasma no unida se retira por lavado antes de exponer adicionalmente los anticuerpos unidos a anticuerpos secundarios específicos para la variante His402 o la variante Tyr 402.

5. El método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que implica además el uso de un anticuerpo secundario que se une con un anticuerpo específico de isoforma o un fragmento de anticuerpo que comprende al menos la Región Determinante de Complementariedad y en el que dicho anticuerpo secundario se une directamente, o indirectamente, con un sistema de marcaje.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 5 en el que dicho sistema de marcaje incluye uno cualquiera o más de los siguientes: sistemas de ELISA, sistemas bioluminiscentes, sistemas quimioluminiscentes o sistemas indicadores pigmentados.

7. Un kit para llevar a cabo el método de acuerdo con las reivindicaciones 1-6 en el que dicho kit comprende un anticuerpo, o un fragmento del mismo que comprende al menos la Región Determinante de Complementariedad, específico para:

i) la variante de histidina 402 del Factor H del Complemento en la que dicho anticuerpo se secreta por el clon depositado con la referencia 07042601; y/o ii) la variante de tirosina 402 del Factor H del Complemento en la que dicho anticuerpo se secreta por el clon depositado con la referencia 08011002.

8. El kit de acuerdo con la reivindicación 7 en el que dicho kit incluye además un anticuerpo, o un fragmento del mismo que comprende al menos la Región Determinante de Complementariedad, que reconoce cualquier isoforma del Factor H del Complemento en el que el anticuerpo se secreta por el clon depositado con la referencia 08011003.

9. El kit de acuerdo con la reivindicación 8 en el que dicho anticuerpo es monoclonal o policlonal.

10. El kit de acuerdo con las reivindicaciones 7-8 en el que dicho kit incluye además medios de marcaje que permiten determinar la unión de dichos uno o más anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo, con el Factor H del Complemento.

11. El kit de acuerdo con la reivindicación 10 en el que dicho kit incluye un anticuerpo secundario que se acopla con un sistema de ELISA o un sistema de ensayo activado por luz o un sistema de ensayo pigmentado.

12. El kit de acuerdo con la reivindicación 11 en el que dicho anticuerpo secundario es un anticuerpo específico de isoforma.

13. Un anticuerpo que es específico para la variante de histidina H402 del Factor H del Complemento en el que

dicho anticuerpo se secreta por el clon depositado con la referencia 07042601, o un fragmento del mismo que 5 comprende la menos la Región Determinante de Complementariedad.

14. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es específico para la variante de tirosina Y402 del Factor H del Complemento en el que dicho anticuerpo se secreta por el clon depositado con la referencia 08011002, o un fragmento del mismo que comprende al menos la Región Determinante de Complementariedad.

15. El uso in vitro de un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo que comprende al menos la Región 10 Determinante de Complementariedad, específico para:

i) la variante de histidina 402 del Factor H del Complemento en la que dicho anticuerpo se secreta por el clon depositado con la referencia 07042601; o ii) la variante de tirosina 402 del Factor H del Complemento en la que dicho anticuerpo se secreta por el clon depositado con la referencia 08011002;

para inhibir la unión del Factor H del Complemento con ligandos o tejidos.

16. Un producto terapéutico que comprende un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo que comprende al menos la Región Determinante de Complementariedad, específico para:

i) la variante de histidina 402 del Factor H del Complemento en la que dicho anticuerpo se secreta por el clon depositado con la referencia 07042601; o 20 ii) la variante de tirosina 402 del Factor H del Complemento en la que dicho anticuerpo se secreta por el clon depositado con la referencia 08011002.

17. Uso de un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo que comprende al menos la Región Determinante de Complementariedad, específico para:

i) la variante de histidina 402 del Factor H del Complemento en la que dicho anticuerpo se secreta por el clon depositado con la referencia 07042601; o ii) la variante de tirosina 402 del Factor H del Complemento en la que dicho anticuerpo se secreta por el clon depositado con la referencia 08011002; para el diagnóstico in vitro de AMD.

18. Un clon que secreta un anticuerpo depositado con la referencia 07042601 o con la referencia 08011002 o con la referencia 08011003.