Método para aislar una célula madre humana a partir de toda la profundidad del tejido cartilaginoso.

Un método para aislar una célula madre humana que comprende:

(a) digerir el tejido cartilaginoso articular humano aislado obtenido a partir de toda la profundidad del tejidocartilaginoso para liberar los condrocitos,

mediante el uso de enzimas;

(b) exponer a los condrocitos aislados a fibronectina y/o un fragmento de la misma que contiene la secuenciaRGD; y

(d) aislar las células que se unen a fibronectina o a dicho fragmento.

Método para aislar una célula madre humana a partir de toda la profundidad del tejido cartilaginoso La solicitud describe una célula madre humana, y en particular una célula madre de cartílago articular; una población de células derivadas de ella; un método para la producción de dicha célula madre y dicha población de células madre; el uso de dicha célula madre y dicha población de células en la reparación de tejidos, y en particular la reparación del tejido conectivo, y más específicamente la reparación de articulaciones; y un implante que comprende o que incluye dicha célula madre o dicha población de células.

Introducción El cartílago articular es avascular, aneural y no contiene vasos linfáticos, y tiene un nivel bajo de actividad metabólica en comparación con otros tejidos conectivos tales como el músculo, pero se puede considerar activo por una célula que depende en gran medida de la glicolisis para obtener energía. También tiene una matriz extracelular considerable, de la que depende para proporcionar al cartílago sus propiedades características de articulación indolora de baja fricción. Los dos constituyentes principales del cartílago articular son el condrocito sumamente especializado, que es exclusivo del cartílago, y la matriz, compuesta por una estructura compleja interconectada de proteoglicanos, colágenos y proteínas no colagenosas (Buckwalter y Hunziker, 1999) .

El cartílago articular se puede dividir en cuatro zonas principales por su profundidad. Estas son las zonas de cartílago superficial; de transición; radial superior e inferior; y calcificado, que van desde la superficie articular externa hasta el hueso subcondral profundo, respectivamente. Aunque las zonas nombradas están presentes, no hay límites 'exactos', que se puedan visualizar entre las zonas. En cada zona hay variaciones biomecánicas y morfológicas (Dowthwaite et al, 2004) , que incluyen diferencias en la morfología celular (tamaño y forma) , empaquetamiento celular, actividad metabólica y el grosor de las capas. También existen diferencias de composición de la matriz entre las zonas, con variaciones de los tipos y cantidades de los diversos colágenos, proteoglicanos, y proteínas no colagenosas.

Como máximo, el cartílago articular tiene un grosor de unos pocos milímetros solamente, pero puede alcanzar hasta 7 mm en las articulaciones grandes, tales como la cadera. A pesar de tener un grosor de solamente unos cuantos milímetros, todavía consigue proporcionar resistencia a la compresión, y muestra la capacidad de distribuir las cargas, por lo que, a su vez, reduce las tensiones elevadas localizadas sobre el hueso subcondral (Buckwalter y Hunziker, 1999) .

Condrocitos El cartílago articular normal contiene un tipo de células, el condrocito sumamente especializado rodeado por la matriz extracelular (Buckwalter, 1998) . En la mayoría de los casos, el condrocito está "aislado citoplásmicamente" (Archer y Francis-West, 2003) de su células adyacentes, y casi nunca forma contactos célula-célula excepto en la parte más superficial del tejido. Cada condrocito, por lo tanto, está completamente rodeado por la matriz con la que interacciona libremente. Los condrocitos difieren en su morfología y actividades metabólicas entre las zonas del cartílago articular. En general, el condrocito tiene una morfología redondeada o poligonal, excepto en los límites tisulares en los que puede aparecer aplanado o discoide, es decir, en la superficie articular de las articulaciones (Archer y Francis-West, 2003) . El papel principal del condrocito es el mantenimiento de la matriz extracelular intrincada del cartílago, en particular las estructuras hidrófilas solubles, tales como hialuronano y agrecano (Knudson, 2003) . Intracelularmente, el condrocito contiene orgánulos que son típicos de los de una célula metabólicamente activa (Archer y Francis-West, 2003) que desempeñan un papel fundamental en la síntesis de la matriz, funcionando continuamente para sintetizar y sustituir una gran proporción de matriz respecto del volumen, principalmente compuesta de proteoglicanos, glicosaminoglicanos y colágenos (Buckwalter y Hunziker, 1999) . Algunos condrocitos contienen además prolongaciones cortas o microvellosidades, que pueden detectar alteraciones mecánicas en la matriz. Esto se consigue a medida que se prolongan desde la célula directamente en la matriz. Los filamentos intracitoplasmáticos, lípidos, glicógeno y vesículas secretoras permiten que los condrocitos interaccionen con la matriz. Los condrocitos maduros se distinguen fácilmente de otras células, ya que tienen una morfología esferoide. También tienen cantidades abundantes de colágeno tipo II, grandes proteoglicanos agregados y proteínas no colagenosas específicas entretejidas en una red, que forma una matriz cartilaginosa que cubre y rodea sus membranas celulares (Buckwalter y Hunziker, 1999) .

Zonas Zona superficial

La zona superficial (Figura 2) es extremadamente fina, y consiste en dos capas. La capa más superficial es acelular, y consiste en una película fina y clara de material amorfo conocida como lamina splendens que recubre una lámina de microfibrillas de colágeno tipo II finas y densamente empaquetadas (Buckwalter y Hunziker, 1999) , y comprende en gran medida lubricina. La capa celular más profunda está compuesta de condrocitos aplanados, discoides encerrados dentro de una matriz rica en colágeno, que está situada en posición paralela a la superficie articular (Dowthwaite et al, 2003) . Estas células sintetizan la matriz, que es abundante en colágeno, fibronectina y agua, y

baja en contenido de proteoglicanos en comparación con el de las zonas más profundas.

La capa densa de fibrillas de colágeno tiene una orientación paralela a la de la superficie, y proporciona al cartílago sus propiedades mecánicas características, que incluyen el tener una fuerza de tensión elevada y ser capaces de resistir la fuerza tangencial a la que se le somete (Buckwalter y Hunziker, 1999) . La red de fibrillas de colágeno permite también el movimiento de moléculas hacia dentro y hacia fuera del cartílago, tales como anticuerpos y moléculas grandes del cartílago, respectivamente.

Diverso estudios han demostrado que la zona superficial del cartílago articular está implicada en la regulación del desarrollo y crecimiento del tejido. Los estudios de desarrollo en el laboratorio han identificado que el cartílago articular crece mediante el crecimiento aposicional desde la superficie articular (Hayes et al 2001) , y que este método de crecimiento permite que se establezca la arquitectura zonal diferente de este tejido heterogéneo. Estos estudios también han demostrado que el crecimiento está controlado por una población de condrocitos que se dividen lentamente en la zona superficial del cartílago articular, y una población de células que se dividen más rápidamente en la zona de transición (Hayes et al 2001) . Estas observaciones no solamente justifican la naturaleza aposicional del crecimiento del cartílago articular y la variación zonal, sino que también sugieren la presencia de una población de células progenitoras de condrocitos articulares específicas en la zona superficial y una población de células amplificadoras de transición en la zona de transición. Además, se ha descubierto que la zona superficial es un centro de señalización debido a la expresión de diversos factores de crecimiento y sus receptores, que desempeñan un papel fundamental en la morfogénesis de la articulación diartrodial por medio de la síntesis de la matriz diferencial (Dowthwaite et al, 2003) . También se ha demostrado in vivo que la zona superficial es responsable del crecimiento aposicional del cartílago articular (Hayes et al, 2001) , y los estudios in vitro recientes han demostrado que la zona superficial del cartílago articular contiene una población de células progenitoras (Dowthwaite et al, 2004) .

Además, la patente de EE.UU. 2006/0239980 describe que el cartílago articular obtenido de la zona superficial del tejido cartilaginoso humano se puede digerir enzimáticamente para producir una población de condrocitos que, por medio del cultivo, se pueden desdiferenciar hasta el tejido condroprogenitor. Sin embargo, no hay datos en este documento con respecto a la estabilidad fenotípica de este tejido, y no hay ninguna afirmación o indicación de que el tejido represente células madre aisladas, y por lo tanto es cuestionable el uso de este tejido desdiferenciado como fuente fiable de material para la reparación tisular.

En el pasado, se identificó una población de células condroprogenitoras en la zona superficial de cartílago articular bovino (Dowthwaite et al 2004) . Esta población se obtuvo aprovechando... [Seguir leyendo]

1. Un método para aislar una célula madre humana que comprende:

(a) digerir el tejido cartilaginoso articular humano aislado obtenido a partir de toda la profundidad del tejido cartilaginoso para liberar los condrocitos, mediante el uso de enzimas;

(b) exponer a los condrocitos aislados a fibronectina y/o un fragmento de la misma que contiene la secuencia RGD; y

(d) aislar las células que se unen a fibronectina o a dicho fragmento.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que en la parte (b) dichos condrocitos liberados se cultivan con fibronectina o una secuencia RGD, tal como un fragmento de fibronectina que contiene la misma.

3. Un método según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que en la parte (a) de la reivindicación 1 dicho cartílago articular se digiere con una combinación de pronasa y colagenasa.

4. Un método según las reivindicaciones 1-3, en el que en la parte (a) de la reivindicación 1 dicho cartílago digerido se filtra o se centrifuga para aislar dichos condrocitos.

5. Un método según las reivindicaciones 1-4, en el que en la parte (a) de la reivindicación 1 el tejido cartilaginoso 15 articular mencionado es el cartílago de un adulto.