Péptidos GLP-1 insulinotrópicos monoconjugados específicos de sitio.

Derivado monoconjugado de un péptido 1 similar al glucagón o análogos de GLP-1 seleccionados del grupo que consiste en GLP-1 (7-36) amida (SEC ID Nº 1),

GLP-1 (7-37) extendido por glicina (SEC ID Nº 2), exendina-3 y exendina-4 que tiene un residuo de glutamina ligado covalentemente a un monometoxi-poli(etilenglicol) lineal o ramificado funcionalizado con alquilamino primario, caracterizado por que dicho péptido 1 similar al glucagón o análogos de GLP-1 seleccionados del grupo que consiste en GLP-1 (7-36) amida (SEC ID Nº 1), GLP-1 (7-37) extendido por glicina (SEC ID Nº 2), exendina-3 y exendina-4 y dicho monometoxi-poli(etilenglicol) están directamente ligados.

Péptidos GLP-1 insulinotrópicos monoconjugados específicos de sitio

[1] La presente invención está relacionada con el péptido 1 similar al glucagón (GLP-1) y análogos de péptidos insulinotrópicos, monoconjugados con moléculas poliméricas biocompatibles por reacción directa enzimática y de transglutaminación específica de sitio, además de sus formulaciones farmacéuticas y sistemas de administración para aplicación terapéutica en patologías dismetabólicas tales como diabetes de tipo 2.

Campo de la invención

[2] La diabetes mellitus es una enfermedad que se sabe que existe desde hace miles de años y que actualmente afecta a más de 2 millones de personas en el mundo. Además de la disminución de la esperanza de vida y menor calidad de vida de los individuos con diabetes, la enfermedad y sus complicaciones asociadas son una carga importante para los presupuestos sanitarios.

[3] La forma más común de la diabetes es la diabetes de tipo 2 (o diabetes no mellitus dependiente de insulina) que tiene tanto componentes genéticos como ambientales y representa un grupo heterogéneo multifactorial de trastornos, que resultan de defectos en la secreción de insulina, acción de la insulina, o ambos, y conduce a niveles incontrolados o elevados de glucosa en sangre.

[4] En países industrializados, aproximadamente el 9 % de los individuos con diabetes tienen diabetes de tipo 2 cuya prevalencia ha aumentando espectacularmente durante las últimas décadas, lo más probablemente bajo la influencia de las modificaciones del nivel de dieta y actividad física.

[5] La diabetes de tipo 2 normalmente se produce en adultos con sobrepeso por encima de la edad de 45; sin embargo, la incidencia de la diabetes de tipo 2 en niños con sobrepeso (normalmente por encima de la edad de 1) también está aumentando rápidamente.

[6] Las actuales terapias en el tratamiento de la diabetes de tipo 2 incluyen intervención en el estilo de vida mediante la modificación de la dieta y el ejercicio físico, y tratamiento con agentes hipoglucémicos orales o inyectados; sin embargo, no todos los individuos con diabetes de tipo 2 responden de la misma forma a estos tratamientos.

[7] Un mejor entendimiento de las respuestas fisiológicas a comidas permitió el descubrimiento de las hormonas incretinas y el desarrollo de nuevos agentes cuya acción terapéutica se basa en la potenciación de la acción de las hormonas gastrointestinales [Drucker DJ, 21].

[8] Estas terapias están asociados al ralentizamiento del vaciamiento gástrico, estimulación de insulina e inhibición de la secreción de glucagón, mejora del control de la hiperglucemia postprandial y control de peso corporal.

[9] Las incretinas son hormonas derivadas del intestino liberadas por nutrientes que potencian la secreción de insulina bajo elevadas condiciones glucémicas. El péptido 1 similar al glucagón (GLP-1) humano es una hormona incretina prototípica, originada a partir del gen preproglucagón y secretada de células L enteroendocrinas del intestino después del consumo de alimentos, presentando un potente efecto reductor de la glucosa en sangre mediante diferentes mecanismos fisiológicos que incluyen la secreción de insulina endógena en un modo dependiente de glucosa, la disminución de los niveles de glucagón en sangre y la reducción del vaciamiento gástrico al ralentizarse la motilidad gástrica. Además, el GLP-1 estimula la proliferación y diferenciación de nuevas células p del páncreas, conduciendo al aumento de la masa de células p [Holst JJ, 27].

[1] La forma principal del GLP-1 humano circulante es un péptido amidado del extremo C de 3 residuos de aminoácidos generalmente indicado como GLP-1 (7-36)-amida (SEC ID N2 1); una forma extendida por glicina no desamidada secundaria y del extremo C de 31 residuos de aminoácidos, generalmente indicada como GLP-1 (7-37), también es detectable en sangre (SEC ID N2 2). Ambos péptidos muestran las mismas actividades biológicas y son equipotentes. Para los fines de la presente invención, como se muestra por SEC ID N2 NO 1 y 2, los péptidos GLP-1 y sus análogos se informan según la numeración de cadenas de péptidos a partir del residuo de histidina del extremo N.

SEC ID 1

GLP-1 (7-36) amida:

1 11 21

HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFLAWLVKGR-CONH2

SEC ID 2

GLP-1 (7-37) extendido por glicina

1 11 21 31

HAEGTFTSDV SSYLEGQAAK EFIAWLVKGR G-COQH

[11] La acción insulinotrópica de los péptidos GLP-1 y análogos, que es la estimulación de la secreción de insulina solo cuando los niveles de glucosa en plasma están por encima del valor fisiológico normal, hace de estos compuestos posibles candidatos para el tratamiento de la diabetes de tipo 2. Los péptidos GLP-1 ejercen sus efectos biológicos mediante siete receptores acoplados a la proteína G transmembranaria expresados en la célula |3 de los islotes de Langerhans, además de en el tubo gastrointestinal y otros tejidos que incluyen corazón, riñón, pulmones y cerebro. Estudios de la relación de estructura-actividad de péptidos GLP-1 llevados a cabo por mutagénesis por cribado con alanina demostraron que las posiciones 1, 4, 6, 7, 9, 13, 15, 22, 23 y 26 son críticas para la unión al receptor [Adelhorst K, et al., 1994; Gallwitz B et al., 1994].

[12] Ejemplos de análogos de GLP-1 incluyen exendina-3 y exendina-4, dos péptidos de 39 aminoácidos originalmente aislados del veneno del monstruo de Gila (Heloderma suspectum), que comparten aproximadamente el 5 % de identidad de secuencias con el propio GLP-1 y son de hecho agonistas del receptor de GLP-1. Se ha autorizado una preparación sintética de exendina-4 (exenatida) en tanto EE.UU. como Europa como terapia complementaria para el tratamiento de diabetes de tipo 2 basándose en dos inyecciones subcutáneas diarias [Davidson MB et al., 25].

[13] Desafortunadamente, el uso terapéutico de péptidos GLP-1 está limitado por una semivida en plasma muy corta (por ejemplo, GLP-1-amida tiene una t-1/2 < 1,5 minutos después de la administración intravenosa) principalmente debido a la rápida degradación por la dipeptidil peptidasa IV del plasma (DPP-IV) o CD26, una proteasa tipo serina que escinde dipéptidos del extremo N de cadenas de polipéptidos después de un residuo de prolina o de alanina. La actividad biológica de los péptidos GLP-1 circulantes naturales está de hecho regulada por la escisión mediada por DPP-IV del extremo N en el residuo de alanina-2 para dar el metabolito inactivo des-His-Ala- péptido GLP-1.

[14] Incluso la exenatida, que se diferencia del GLP-1 en la posición 2 del extremo N que confiere resistencia a DPP-IV y es, por tanto, esencialmente eliminada por filtración glomerular, cuando se inyecta intravenosamente muestra una semivida en plasma de aproximadamente 3 minutos. La rápida inactivación y/o eliminación de los péptidos GLP-1 y análogos ha estimulado el interés en los agonistas de receptores de GLP-1 resistentes a la degradación de acción prolongada que presentan duración prolongada de la acción con respecto a los péptidos GLP-1 naturales después de la administración in vivo. Ejemplos de estos derivados de GLP-1 se informan ampliamente en tanto la bibliografía científica como de patentes; pueden obtenerse, entre otros, según los siguientes enfoques:

a) por sustituciones de aminoácidos selectivas en la cadena peptídica de GLP-1 que confieren resistencia a DPP-IV como, por ejemplo, por sustitución del segundo aminoácido L-alanina del extremo N con D-alanina o serina produciendo análogos de GLP-1 que mantienen la actividad insulinotrópica con un aumento significativo de la estabilidad en plasma y semivida in vivo [Ugkaya G et al., 25; Ritzel U et al., 1998; Buckley DI et al., US5545618]

b) uniendo uno o más sustituyentes lipófilos a las cadenas laterales de residuos de aminoácidos de GLP-1 y análogos de GLP-1 en los que los sustituyentes lipófilos comprenden de 4 a 4 átomos de carbono y están químicamente conjugados con aminoácidos tanto directamente como mediante un espaciador. Algunos de estos análogos de GLP-1 derivatizados con restos lipófilos mostraron un perfil de acción extendido in vivo y mayor persistencia en plasma en comparación con GLP-1 natural (Knudsen L et al., EP944 648)

c) explotando los péptidos insulinotrópicos que se producen naturalmente tales como, por ejemplo, exendina-3 y exendina-4 (o su forma sintética correspondiente exenatida), dos péptidos de 39 aminoácidos originalmente aislados de las glándulas salivales de lagartos [Eng J et al., 1992] que se encontró que eran potentes agonistas de receptores de GLP-1. La exenatida, cuya eficacia terapéutica también se demostró en pacientes con diabetes... [Seguir leyendo]

1. Derivado monoconjugado de un péptido 1 similar al glucagón o análogos de GLP-1 seleccionados del grupo que consiste en GLP-1 (7-36) amida (SEC ID N2 1), GLP-1 (7-37) extendido por glicina (SEC ID N2 2), exendina-3 y exendina-4 que tiene un residuo de glutamina ligado covalentemente a un monometoxi-poli(etilenglicol) lineal o ramificado funcionalizado con alquilamino primario, caracterizado por que dicho péptido 1 similar al glucagón o análogos de GLP-1 seleccionados del grupo que consiste en GLP-1 (7-36) amida (SEC ID N2 1), GLP-1 (7-37) extendido por glicina (SEC ID N2 2), exendina-3 y exendina-4 y dicho monometoxi-poli(etilenglicol) están directamente ligados.

2. Derivado monoconjugado según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho monometoxi-poli(etilenglicol) lineal o ramificado funcionalizado con un grupo amino primario tiene un peso molecular de 2 a 5 kDa, preferentemente de 5 a 4 kDa.

3. Derivado monoconjugado según la reivindicación 2, caracterizado por que dicho monometoxi-poli(etilenglicol) lineal o ramificado funcionalizado con un grupo amino primario tiene un peso molecular de 1 a 3 kDa, preferentemente de 15 a 25 kDa, más preferentemente de aproximadamente 2 kDa.

4. Derivado monoconjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1,2 y 3, caracterizado por que el residuo de glutamina en la posición 17 de dicha GLP-1 (7-36) amida (SEC ID N2 1) o GLP-1 (7-37) extendido por glicina (SEC ID N2 2) está ligado covalentemente a dicho polímero funcionalizado con alquilamino, o por que la glutamina en la posición 17 está sustituida con una asparagina y la alanina en la posición 24 está sustituida con una glutamina y está ligada covalentemente al polímero funcionalizado con alquilamino.

5. Un derivado monoconjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en el tratamiento de diabetes, preferentemente diabetes de tipo 2.

6. Un derivado monoconjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para reducir hiperglucemia en pacientes afectados por diabetes, preferentemente diabetes de tipo 2.

7. Una formulación que contiene un derivado monoconjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, junto con al menos un excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

8. Una formulación que contiene un derivado monoconjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, junto con nano- y micro-partículas poliméricas y/o lipídicas.

9. Una formulación que contiene un derivado monoconjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, junto con un polímero termosensible.

1. Un proceso para la preparación de un derivado monoconjugado según una cualquiera de la reivindicación 1 a 4, que comprende hacer reaccionar un péptido 1 similar al glucagón o análogos de GLP-1 seleccionados del grupo que consiste en GLP-1 (7-36) amida (SEC ID N2 1), GLP-1 (7-37) extendido con glicina (SEC ID N2 2), exendina-3 y exendina-4 con un monometoxi-poli(etilenglicol) lineal o ramificado funcionalizado con alquilamino primario en presencia de una transglutaminasa microbiana, en el que dicho proceso es una reacción de conjugación directa.

11. Un proceso según la reivindicación 1, caracterizado por que la relación molar de péptido 1 similar al glucagón:polímero funcionalizado con alquilamino comprende entre 1:1 y 1:1, preferentemente entre 1:5 y 1:35, más preferentemente entre 1:15 y 1:25.

12. Un proceso según las reivindicaciones 1 y 11, caracterizado por que dicha reacción se lleva a cabo en una disolución tamponada a un pH de entre 4 y 9, preferentemente de entre 5 y 8.

13. Un proceso según las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por que dicha transglutaminasa se usa en cantidades que oscilan entre ,1 y 2 U/ml, preferentemente entre ,2 y 1 U/ml.

14. Un proceso según las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por que dicha reacción se lleva a cabo a una temperatura de entre 1 y 5 2C, preferentemente de entre 15 y 3 2C.