Métodos para la generación de anticuerpos multiespecíficos y multivalentes.

Un anticuerpo monoclonal aislado que porta una especificidad diferente en cada sitio de combinación y que consiste en dos copias de un único polipéptido de cadena pesada y una primera cadena ligera y una segunda cadena ligera,

en el que las primera y segunda cadenas ligeras son diferentes.

Métodos para la generación de anticuerpos multiespecíficos y multivalentes Campo de la invención

La invención se refiere a la generación de nuevos anticuerpos monoclonales biespecíficos que portan una especificidad diferente para cada sitio de unión de la molécula de inmunoglobulina. Los anticuerpos de la invención están compuestos de una única cadena pesada y dos cadenas ligeras diferentes, una que contiene un dominio constante Kappa y la otra un dominio constante Lambda. La presente invención en particular se refiere al aislamiento de anticuerpos de diferentes especificidades pero que comparten una cadena pesada común. La invención se refiere además a la co-expresión controlada de dos cadenas ligeras y una única cadena pesada que conducen al ensamblaje de anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos. La invención proporciona un medio de producir un anticuerpo biespecífico y bivalente completamente humano que no está alterado en su secuencia y no implica el uso de enlazadores de otras secuencias no humanas, así como mezclas de anticuerpos de dos anticuerpos monoespecíficos y un anticuerpo biespecífico. La invención también proporciona los medios para purificar eficazmente el anticuerpo biespecífico.

Antecedentes de la invención

Un anticuerpo está compuesto de cuatro polipéptidos: dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. La parte de unión a antígeno de un anticuerpo se forma por el dominio variable de cadena ligera (VL) y el dominio variable de cadena pesada (VH). En una extremidad de estos dominios seis bucles forman el sitio de unión a antígeno y también se denominan las regiones determinantes de complementariedad (CDR). Tres CDR están localizadas en el dominio VH (H1, H2 y H3) y las otras tres están en el dominio VL (L1, L2 y L3). Durante el desarrollo de linfocitos B se forma una región de inmunoglobulina única por recombinación somática conocida como recombinación V(D)J. La región variable de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina está codificada por diferentes segmentos génicos. La cadena pesada está codificada por tres segmentos denominados segmentos variables (V), de diversidad (D) y de unión (J) mientras que la variable de cadena ligera está formada por la recombinación de solamente dos segmentos V y J. Puede generarse un gran número de parátopos de anticuerpos por recombinación entre una de las múltiples copias de los segmentos V, D y J que están presentes en el genoma. El segmento V codifica la CDR1 y CDR2 mientras que la CDR3 se genera por los acontecimientos de recombinación. Durante el transcurso de la respuesta inmunitaria se introduce más diversidad en el sitio de unión a antígeno por un proceso denominado hipermutación somática (SHM). Durante este proceso se introducen mutaciones puntuales en los genes variables de las cadenas pesada y ligera y en particular en las regiones que codifican las CDR. Esta variabilidad adicional permite la selección y expansión de linfocitos B que expresan variantes de anticuerpo con afinidad mejorada por su antígeno afín.

La amplia mayoría de inmunoglobulinas son moléculas bivalentes y monoespecíficas que portan la misma especificidad en ambas ramas ya que están compuestas de dos polipéptidos de cadena pesada idénticos y dos polipéptidos de cadena ligera idénticos. Sin embargo, se ha reconocido muy pronto durante el desarrollo de la tecnología de hibridomas que pueden crearse hibridomas híbridos por un acontecimiento de fusión entre dos hibridomas (Suresh MR et al., Methods Enzymol 1986; 121: 21-228). Estos "cuadromas" expresan dos cadenas pesadas diferentes y dos ligeras diferentes y de este modo producen una diversidad de especies de anticuerpos diferentes que resultan del emparejamiento aleatorio de las cadenas pesada y ligera. Entre estas especies diferentes, se generan anticuerpos biespecíficos (bsAb), que portan una especificidad diferente en cada rama. Otra excepción de origen natural es la inmunoglobulina del isotipo lgG4 que es capaz de experimentar intercambio de cadena pesada debido a una dimerización menos estable mediada por la región bisagra de ese isotipo (van der Neut Kolfschoten M et al., Science. 27 317(5844):1554-7). Aunque este intercambio parece suceder in vivo, su importancia biológica aún no está clara.

Han surgido anticuerpos monoclonales como una clase exitosa y atractiva de moléculas para intervención terapéutica en varias áreas de la enfermedad humana. Sin embargo, la dirección a o neutralización de una única proteína no siempre es suficiente para conseguir eficacia en ciertas enfermedades lo que limita el uso terapéutico de anticuerpos monoclonales. Cada vez está más claro que en varias indicaciones la neutralización de un componente de un sistema biológico no es suficiente para conseguir eficacia. Una solución a este problema es la coadministración de varios anticuerpos monoclonales. Este enfoque se complica sin embargo por aspectos reguladores si los anticuerpos para combinar no se han aprobado previamente de forma individual. Además, los enfoques de combinación también son costosos desde una perspectiva de fabricación. En consecuencia, existe la necesidad de anticuerpos y productos terapéuticos que permitan la dirección a múltiples antígenos con una única molécula.

Sumario de la invención

La invención posibilita la identificación, producción y purificación de anticuerpos biespecíficos que son indistinguibles en su secuencia de anticuerpos convencionales. La invención también posibilita la producción y purificación de una mezcla de anticuerpos sencilla de tres o más anticuerpos que portan todos la misma cadena pesada. La naturaleza

no modificada de los anticuerpos de la invención les proporciona características de fabricación favorables similares a los anticuerpos monoclonales convencionales.

Los anticuerpos biespecíficos de la invención se generan usando las siguientes etapas:

- Se aíslan dos anticuerpos que tienen especificidades diferentes y que comparten el mismo dominio variable de cadena pesada pero diferentes dominios variables de cadena ligera. Esta etapa se facilita mediante el uso de bibliotecas de anticuerpos que tienen una cadena pesada fija o animales transgénicos que contienen un único gen VH.

- El dominio variable de cadena pesada se fusiona con la región constante de una cadena pesada, un dominio variable de cadena ligera se fusiona a un dominio constante Kappa y el otro dominio variable de cadena ligera se fusiona con un dominio constante Lambda. Preferentemente, el dominio variable de cadena ligera fusionado con el dominio constante Kappa es del tipo Kappa y el dominio variable de cadena ligera fusionado con el dominio constante Lambda es del tipo Lambda. Sin embargo la invención también permite la generación de cadenas ligeras híbridas de modo que dos dominios variables de cadena ligera del mismo tipo puedan usarse para generar anticuerpos biespecíficos de la invención.

- Las tres cadenas se co-expresan en células de mamífero lo que conduce al ensamblaje y la secreción en el sobrenadante de una mezcla de tres anticuerpos: dos anticuerpos monoespecíficos y un anticuerpo biespecífico que porta dos cadenas ligeras diferentes. La relación de los diferentes anticuerpos depende de la expresión relativa de las cadenas y su ensamblaje en una IgG. La invención proporciona métodos para ajustar estas relaciones y maximizar la producción de anticuerpo biespecífico.

- La mezcla de anticuerpos se purifica usando técnicas de cromatografía convencionales usadas para purificación de anticuerpos. La mezcla de anticuerpos puede caracterizarse y usarse como un agente multi-dirección.

- El anticuerpo biespecífico se purifica usando en una cromatografía de afinidad de manera consecutiva medios que se unen específicamente con regiones constantes Kappa humana y Lambda humana. Este proceso de purificación es independiente de la secuencia de los dominios variables de cadena ligera y es por lo tanto genérico para todos los anticuerpos biespecíficos de la invención.

- El anticuerpo biespecífico aislado que porta una cadena ligera que contiene un dominio constante Kappa y una cadena ligera que contiene un dominio constante Lambda se caracteriza usando métodos bioquímicos e inmunológicos diferentes.

- El anticuerpo biespecífico de la invención puede usarse para la intervención terapéutica o como un reactivo de

investigación o diagnóstico.

La invención proporciona anticuerpos monoclonales que portan una especificidad diferente en cada sitio de combinación e incluyendo dos copias de un único polipéptido de cadena pesada y una primera cadena ligera y una segunda cadena ligera, en los que las primera y segunda cadenas ligeras son diferentes.

1. Un anticuerpo monoclonal aislado que porta una especificidad diferente en cada sitio de combinación y que consiste en dos copias de un único polipéptido de cadena pesada y una primera cadena ligera y una segunda cadena ligera, en el que las primera y segunda cadenas ligeras son diferentes.

2. El anticuerpo monoclonal aislado de la reivindicación 1 en el que al menos una parte de la primera cadena ligera es del tipo Kappa y al menos una parte de la segunda cadena ligera es del tipo Lambda.

3. El anticuerpo monoclonal aislado de la reivindicación 2, en el que la primera cadena ligera comprende al menos una región constante Kappa.

4. El anticuerpo monoclonal aislado de la reivindicación 3, en el que la primera cadena ligera comprende además una región variable Kappa o una región variable Lambda.

5. El anticuerpo monoclonal aislado de la reivindicación 2, en el que la segunda cadena ligera comprende al menos una región constante Lambda.

6. El anticuerpo monoclonal aislado de la reivindicación 5, en el que la segunda cadena ligera comprende además una región variable Lambda o una región variable Kappa.

7. El anticuerpo monoclonal aislado de la reivindicación 2, en el que la primera cadena ligera comprende una región constante Kappa y una región variable Kappa, y en el que la segunda cadena ligera comprende una región constante Lambda y una región variable Lambda.

8. El anticuerpo monoclonal aislado de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que las secuencias de la región marco conservada constante y variable son humanas.

9. Un método para generar un anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1 que comprende:

a. Aislar una región de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene una especificidad determinada por un dominio variable de cadena pesada combinado con un primer dominio variable de cadena ligera;

b. Aislar una región de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene una especificidad diferente determinada por el mismo dominio variable de cadena pesada que el anticuerpo de la etapa a) combinado con un segundo dominio variable de cadena ligera;

c. Co-expresar en una célula:

i. el dominio variable de cadena pesada común fusionado con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina;

i¡. el primer dominio variable de cadena ligera fusionado con un dominio constante de cadena ligera del tipo Kappa o fusionado con un dominio constante de cadena ligera del tipo Lambda; y

iii. el segundo dominio variable de cadena ligera fusionado con un dominio constante de cadena ligera de un tipo diferente que el dominio constante de la primera cadena ligera.

1. El método de la reivindicación 9 en el que

a. un dominio variable de cadena ligera Kappa está fusionado con una región constante del tipo Kappa,

b. un dominio variable de cadena ligera Kappa está fusionado con una región constante del tipo Lambda,

c. un dominio variable de cadena ligera Lambda está fusionado con una región constante del tipo Kappa, o

d. un dominio variable de cadena ligera Lambda está fusionado con una región constante del tipo Lambda.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 1, que comprende además la etapa de (d) purificar los anticuerpos biespecíficos producidos en la etapa c) de los anticuerpos monoespecíficos producidos en la etapa c), en el que la etapa d) es opcionalmente una etapa de purificación por cromatografía de afinidad.

12. El método de la reivindicación 11 en el que la etapa de purificación es una etapa de purificación por cromatografía de afinidad realizada usando medios de cromatografía de afinidad específico de dominio constante Kappa, específico de dominio constante Lambda o tanto específico de dominio constante Kappa como específico de dominio constante Lambda.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 en el que la etapa a) y b) se facilitan mediante el uso de bibliotecas de anticuerpos que tienen una cadena pesada común y diversidad limitada al dominio variable de cadena ligera, en el que la biblioteca de anticuerpos se presenta opcionalmente en bacteriófagos filamentosos, en la superficie de células de levadura, bacterias o mamíferos o se usa para ribosomas u otro tipo de presentación ¡n vitro.

14. Un método para preparar un anticuerpo biespecífico que se une específicamente con un primer antígeno y un segundo antígeno, en el que los primer y segundo antígenos son diferentes, comprendiendo el método:

a. proporcionar una primera molécula de ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada de un polipéptido de inmunoglobulina o fragmento del mismo que se une con el primer antígeno, acoplado con una región constante de inmunoglobulina;

b. proporcionar una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera del polipéptido de inmunoglobulina o fragmento del mismo que se une con el primer antígeno acoplado con una primera región constante de cadena ligera de tipo Kappa o de tipo Lambda;

c. proporcionar una tercera molécula de ácido nucleico que codifica un tercer polipéptido que comprende una región variable de cadena ligera de un polipéptido de inmunoglobulina o fragmento del mismo que comparte la misma región de cadena variable pesada del polipéptido de inmunoglobulina o fragmento del mismo de la etapa (a) y se une con el segundo antígeno, acoplado a una segunda región constante de cadena ligera de tipo Kappa o tipo Lambda, en el que los primer y segundo dominios constantes de cadena ligera son de tipos diferentes; y

d. cultivar una célula hospedadora que comprende las primera, segunda y tercera moléculas de ácido nucleico en condiciones que permiten la expresión de los primer, segundo y tercer polipéptidos.

15. El método de la reivindicación 14, que comprende además la etapa de (e) recuperar el anticuerpo biespecífico.

16. El método de la reivindicación 14, en el que el segundo ácido nucleico codifica un dominio variable de cadena ligera de tipo Kappa.

17. El método de la reivindicación 16, en el que el segundo ácido nucleico codifica una región constante de tipo Kappa o una región constante de tipo Lambda o un dominio variable de cadena ligera de tipo Lambda.

18. El método de la reivindicación 17, en el que el segundo ácido nucleico codifica un dominio variable de cadena ligera de tipo Lambda, en el que el segundo ácido nucleico codifica una región constante de tipo Kappa o una región constante de tipo Lambda.

19. El método de la reivindicación 14, en el que el tercer ácido nucleico codifica un dominio variable de cadena ligera de tipo Kappa.

2. El método de la reivindicación 19, en el que el tercer ácido nucleico codifica una región constante de tipo Kappa o una región constante de tipo Lambda.

21. El método de la reivindicación 14, en el que el tercer ácido nucleico codifica un dominio variable de cadena ligera de tipo Lambda.

22. El método de la reivindicación 21, en el que el tercer ácido nucleico codifica una región constante de tipo Kappa o una región constante de tipo Lambda.

23. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 22, en el que el anticuerpo biespecífico se recupera en una etapa (e) usando una etapa de purificación por cromatografía de afinidad, en el que la etapa de purificación se realiza opcionalmente usando medios de cromatografía de afinidad específico de dominio constante Kappa, específico de dominio constante Lambda o tanto específico de dominio constante Kappa como específico de dominio constante Lambda.

24. Una mezcla de anticuerpos que comprende dos anticuerpos monoespecíficos y un anticuerpo biespecífico, que tienen todos una cadena pesada común.

25. Un método para generar una mezcla de anticuerpos de la reivindicación 24 que comprende:

a. Aislar una región de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene una especificidad determinada por un dominio variable de cadena pesada combinado con un primer dominio variable de cadena ligera;

b. Aislar una región de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene una especificidad diferente determinada por el mismo dominio variable de cadena pesada que el anticuerpo de la etapa a) combinado con un segundo dominio variable de cadena ligera;

c. Co-expresar en una célula:

i. el dominio variable de cadena pesada común fusionado con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina;

¡i. el primer dominio variable de cadena ligera fusionado con un dominio constante de cadena ligera del tipo Kappa o fusionado con un dominio constante de cadena ligera del tipo Lambda; y

¡¡i. el segundo dominio variable de cadena ligera fusionado con un dominio constante de cadena ligera del tipo Kappa o fusionado con un dominio constante de cadena ligera del tipo Lambda; y opcionalmente

d. Purificar la mezcla de anticuerpos producida en la etapa c) del sobrenadante de cultivo celular.

26. Una mezcla de anticuerpos que comprende tres o más anticuerpos monoespecíficos y tres o más anticuerpos biespecíficos, que tienen todos una cadena pesada común.

27. Un método para generar una mezcla de anticuerpos de la reivindicación 26 que comprende:

a. Aislar una región de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene una especificidad determinada por un dominio variable de cadena pesada combinado con un primer dominio variable de cadena ligera;

b. Aislar varias regiones de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que tienen una especificidad diferente

determinada por el mismo dominio variable de cadena pesada que el anticuerpo de la etapa a) combinado con diferentes dominios variables de cadena ligera;

c. Co-expresar en una célula:

i. el dominio variable de cadena pesada común fusionado con una región constante de cadena pesada de

inmunoglobulina;

¡i. todas las cadenas ligeras de los anticuerpos aislados en la etapa a) y b) fusionados con un dominio constante de cadena ligera del tipo Kappa o fusionado con un dominio constante de cadena ligera del tipo Lambda; y opcionalmente

d. Purificar la mezcla de anticuerpos producida en la etapa c) del sobrenadante de cultivo celular.