Métodos para identificación de sitios para conjugación de IgG.

Un conjugado de inmunoglobulina, que comprende una inmunoglobulina que tiene al menos una mutación en el residuo 7(VH),

donde la al menos una mutación es una sustitución con un residuo de cisteína, y un átomo o molécula, donde el átomo o molécula se conjuga con el residuo de cisteína.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2010/037517.

Solicitante: NOVARTIS AG.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: LICHTSTRASSE 35 4056 BASEL SUIZA.

Inventor/es: CHENNAMSETTY,NARESH, HELK,BERNHARD, TROUT,BERNHARDT, KAYSER,VEYSEL, VOYNOV,VLADIMIR.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K47/48 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 47/00 Preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos utilizados, p. ej. portadores, aditivos inertes. › estando el ingrediente no activo químicamente unido al ingrediente activo, p. ej. conjugados polímero-medicamento.
  • C07K16/00 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales.

PDF original: ES-2537566_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Métodos para identificación de sitios para conjugación de IgG.

Campo de la invención La presente invención se refiere a inmunoglobulinas y conjugados de inmunoglobulina mejorados.

Antecedentes Los anticuerpos monoclonales se usan en gran medida en laboratorio y terapia. Derivados de anticuerpo con fluorescencia específica de sitio diseñada o propiedades de enlace se han desarrollado y usado durante muchos años. Más recientemente, se han desarrollado anticuerpos como agentes terapéuticos, presentando en la actualidad la clase de medicamentos que crece de manera más rápida [1]. Los anticuerpos son proteínas multidominio de dos cadenas ligeras o cadenas pesadas unidas por enlaces disulfuro. Las regiones variables especifican el enlace con n antígeno particular, y parte de la región constante es responsable de las funciones del efector pro medio del enlace con los receptores Fc sobre la superficie de células inmunes. Debido a su potencial en la cura de varias enfermedades, actualmente los anticuerpos constituyen la clase de terapia humana que está creciendo de manera más rápida (Carter. Nature Reviews Immunology. 2006, 6 (5) , 343) . Desde 2001, su mercado ha crecido a un ritmo de crecimiento medio anual de 35%, el índice más alto entre todas las categorías de fármacos de biotecnología (S. Aggarwal. Nature. BioTech. 2007, 25 (10) 1097) .

El diseño de conjugados de anticuerpo ha incrementado además la versatilidad de aplicaciones de anticuerpo. En muchas técnicas de laboratorio, las enzimas o sondas fluorescentes se conjugan con anticuerpos para realizar funciones de ensayos, por ejemplo cuantificación de abundancia de antígenos. En casos de terapias destinadas, las moléculas tóxicas pequeñas se unen a anticuerpos que específicamente se enlazan con biomarcadores en células dañadas [2-4]. Se han buscado varias técnica para conjugación de anticuerpos, por ejemplo, unión a lisinas de superficie [5], a carbohidratos Fc [6] o a disulfuros de intercadena parcialmente reducidos [7].

La conjugación de anticuerpos con cisteína de superficie diseñada sigue siendo una opción muy atractiva porque la mayoría de anticuerpos no tienen cisteínas aparte de las consumidas en los enlaces disulfuro intra- o intercadena. Las moléculas pequeñas pueden estar unidas al sitio específico de sustitución de cisteína por medio de una química reactiva de tiol tal como maleimidas [8-14]. Se ha preferido el diseño en los dominios CH1 y CH3 para evitar la interferencia con enlace de antígeno de las regiones variables y la función del efector de CH2. Se han considerado diferentes criterios para la conjugación exitosa de anticuerpos por medio de cisteínas diseñadas. Por ejemplo, el dominio de anticuerpo en el que para realizar una mutación, la exposición al sitio mutado y el aminoácido que se sustituirá son algunas de las variables que se toman en cuenta. Se ha desarrollado una técnica de cribado de alto rendimiento para identificar sitios adecuados para diseño y conjugación de cisteínas [15]. Dos de los problemas más comunes asociados con las variantes de cisteína de anticuerpo son la oligomerización y el etiquetado pobre. Aún no hay una herramienta universal para predecir si una variante de cisteína de anticuerpo será estable y se conjugará de manera eficiente. Además, las variantes de cisteína actualmente existen solamente para los dominios CL, CH1 y CH3 [8, 9, 11, 12, 15].

Así, existe una necesidad de variante de cisteína de inmunoglobulina adicionales que puedan usarse en la generación de conjugados estables de inmunoglobulina.

Resumen de la invención La invención proporciona un conjugado de inmunoglobulina, que comprende una inmunoglobulina que tiene al menos una mutación en residuo 7 (VH) , donde la al menos una mutación es una sustitución con un residuo de cisteína, y un átomo o molécula, donde el átomo o molécula esta conjugado con el residuo de cisteína.

La invención también proporciona un método para producir un conjugado de inmunoglobulina que comprende:

(a) proporcionar una inmunoglobulina modificada o aislada que comprende al menos una mutación una mutación en residuo 7 (VH) , donde la al menos una mutación es una sustitución con un residuo de cisteína;

(b) reducir uno o más residuos de cisteína sustituidos con un agente reductor para formar residuos de cisteína reducidos; y

(c) incubar la inmunoglobulina con un átomo o molécula, donde el átomo o molécula es reactiva con los residuos de cisteína reducidos, para formar un conjugado de inmunoglobulina.

La invención también proporciona un método para reducir el enlace cruzado entre cisteínas expuestas a la superficie de una inmunoglobulina en una formulación farmacéutica muy concentrada de conjugados de inmunoglobulina que comprende:

(a) proporcionar una inmunoglobulina;

(b) sustituir el residuo 7 (VH) con un residuo de cisteína;

(c) reducir uno o más residuos de cisteína sustituidos con un agente reductor para formar residuos de cisteína reducidos;

(d) incubar la inmunoglobulina con un átomo o molécula, donde el átomo o molécula es reactiva con los residuos de cisteína reducidos, para formar un conjugado de inmunoglobulina; y

(e) generar una formulación líquida muy concentrada del conjugado de inmunoglobulina donde la concentración de conjugado de inmunoglobulina es al menos 20 mg/ml, al menos 30 mg/ml, al menos 40 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml, al menos 100 mg/ml, al menos 125 mg/ml o al menos 150 mg/ml.

La invención también proporciona el uso del conjugado de inmunoglobulina de la invención en la preparación de un medicamento que comprende una formulación líquida muy concentrada del conjugado de inmunoglobulina donde la concentración de inmunoglobulina es al menos 20 mg/ml, al menos 30 mg/ml, al menos 40 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml, al menos 100 mg/ml, al menos 125 mg/ml o al menos 150 mg/ml, y donde al menos ochenta por ciento, al menos ochenta y cinco por ciento, al menos noventa por ciento, al menos noventa y cinco por ciento, al menos noventa y seis por ciento, al menos noventa y siete por ciento, al menos noventa y ocho por ciento o al menos noventa y nueve por ciento del conjugado de inmunoglobulina es monómero no oligomerizado.

La invención también proporciona el uso del conjugado de inmunoglobulina de la invención como una herramienta de diagnóstico.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el conjugado de inmunoglobulina de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde al menos ochenta por ciento, al menos ochenta y cinco por ciento, al menos noventa por ciento, al menos noventa y cinco por ciento, al menos noventa y seis por ciento, al menos noventa y siete por ciento, al menos noventa y ocho por ciento o al menos noventa y nueve por ciento del conjugado de inmunoglobulina es monómero no oligomerizado.

Resumen de la divulgación Aquí se describen inmunoglobulinas y conjugados de inmunoglobulina mejorados que muestran enlace cruzado reducido que cumplen esta necesidad.

Así un aspecto incluyen un conjugado de inmunoglobulina que comprende una inmunoglobulina que tiene la menos una mutación en un residuo seleccionado del grupo consistente en 7 (VH) , 20 (VL) , 22 (VL) , 25 (VH) , 125 (CH1) , 248 (CH2) , 254 (CH2) , 286 (CH2) , 298 (CH2) y 326 (CH2) , donde al menos una mutación es una sustitución con un residuo de cisteína, y un átomo o molécula, donde el átomo o molécula se conjuga con el residuo de cisteína. En ciertas realizaciones, la al menos una mutación es un residuo seleccionado del grupo consistente en 7 (VH) , 20 (VL) , 22 (VL) y 125 (CH1) . En ciertas realizaciones, la al menos una mutación es un residuo seleccionado del grupo consistente en 248 (CH2) y 326 (CH2) . En ciertas realizaciones, la al menos una mutación es un residuo seleccionado del grupo consistente en 25 (VH) y 286 (CH2) . En ciertas realizaciones, la al menos una mutación es un residuo seleccionado del grupo consistente en 254 (CH2) y 298 (VH) . En ciertas realizaciones que pueden combinarse con las realizaciones precedentes, la inmunoglobulina se selecciona del grupo que comprende IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En ciertas realizaciones que pueden combinarse con las realizaciones precedentes, la inmunoglobulina comprende un IgG1. En ciertas realizaciones que pueden combinarse con las realizaciones precedentes, el conjugado de inmunoglobulina comprende un dominio humano CH1. En ciertas realizaciones que pueden combinarse con las realizaciones precedentes, el conjugado de inmunoglobulina comprende un dominio humano CH2. En ciertas realizaciones que pueden combinarse con las realizaciones precedentes,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un conjugado de inmunoglobulina, que comprende una inmunoglobulina que tiene al menos una mutación en el residuo 7 (VH) , donde la al menos una mutación es una sustitución con un residuo de cisteína, y un átomo o molécula, donde el átomo o molécula se conjuga con el residuo de cisteína.

2. El conjugado de inmunoglobulina de la reivindicación 1, que además comprende una molécula enlazadora que tiene al menos dos sitios reactivos, donde un primer sitio reactivo está unido al residuo de cisteína de la inmunoglobulina y un segundo sitio reactivo está unido al átomo o molécula.

3. El conjugado de inmunoglobulina de la reivindicación 2, donde la molécula enlazadora se selecciona del grupo consistente en una hidrazona, un disulfuro, un péptido, un agente quelante y una maleimida.

4. El conjugado de inmunoglobulina de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el átomo o molécula se selecciona del grupo consistente en un radionúclido, un agente quimioterapéutico, una toxina microbiana, una toxina de planta, un polímero, un carbohidrato, una citoquina, una etiqueta fluorescente, una etiqueta luminiscente, una etiqueta enzima-sustrato, una enzima, un péptido, un péptido mimético, un nucleótido, un siARN, un microARN, un ARN mimético y un aptámero.

5. El conjugado de inmunoglobulina de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el átomo o molécula se selecciona del grupo consistente en 90Y, 131I, 67Cu, 177Lu, 213Bi, 211At, una calicheamicina, una duocarmicina, un maitansinoide, una auristatina, una antraciclina, exotoxina A Pseudomona, toxina de Difteria, ricina, polietilenglicol, almidón de hidroxietilo y un residuo de manosil.

6. El conjugado de inmunoglobulina de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el conjugado de inmunoglobulina comprende además una actividad de enlace de antígeno y la actividad es al menos ochenta por ciento, al menos noventa por ciento, al menos cien por ciento, al menos, ciento diez por ciento, al menos ciento veinte por ciento o al menos ciento treinta por ciento de la actividad de enlace de antígeno de la inmunoglobulina no mutada.

7. Un método para producir un conjugado de inmunoglobulina, que comprende:

(a) proporcionar una inmunoglobulina modificada o aislada que comprende al menos una mutación una mutación en el residuo 7 (VH) , donde la al menos una mutación es una sustitución con un residuo de cisteína;

(b) reducir uno o más residuos de cisteína sustituidos con un agente reductor para formar residuos de cisteína reducidos; y

(c) incubar la inmunoglobulina con un átomo o molécula, donde el átomo o molécula es reactiva con los residuos de cisteína reducidos, para formar un conjugado de inmunoglobulina.

8. Un método para reducir el enlace cruzado entre cisteínas expuestas a la superficie de una inmunoglobulina en una formulación farmacéutica muy concentrada de conjugados de inmunoglobulina que comprende:

(a) proporcionar una inmunoglobulina;

(b) sustituir el residuo 7 (VH) con un residuo de cisteína;

(c) reducir uno o más residuos de cisteína sustituidos con un agente reductor para formar residuos de cisteína reducidos;

(d) incubar la inmunoglobulina con un átomo o molécula, donde el átomo o molécula es reactiva con los residuos de cisteína reducidos, para formar un conjugado de inmunoglobulina; y

(e) generar una formulación líquida muy concentrada del conjugado de inmunoglobulina donde la concentración de conjugado de inmunoglobulina es al menos 20 mg/ml, al menos 30 mg/ml, al menos 40 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml, al menos 100 mg/ml, al menos 125 mg/ml o al menos 150 mg/ml.

9. El método de la reivindicación 8 donde el conjugado de inmunoglobulina comprende una actividad de enlace de antígeno y la actividad es al menos ochenta por ciento, al menos noventa por ciento, al menos cien por ciento, al menos, ciento diez por ciento, al menos ciento veinte por ciento o al menos ciento treinta por ciento de la actividad de enlace de antígeno de la inmunoglobulina no mutada.

10. Uso del conjugado de inmunoglobulina de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en la preparación de un medicamento que comprende una formulación líquida muy concentrada donde la concentración de conjugado de inmunoglobulina es al menos 20 mg/ml, al menos 30 mg/ml, al menos 40 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml, al menos 100 mg/ml, al menos 125 mg/ml o al menos 150 mg/ml, y donde al menos ochenta por ciento, al menos ochenta y cinco por ciento, al menos noventa por ciento, al menos noventa y cinco por ciento, al menos noventa y seis por ciento, al menos noventa y siete por ciento, al menos noventa y ocho por ciento o al menos noventa y nueve por ciento del conjugado de inmunoglobulina es monómero no oligomerizado.

11. uso del conjugado de inmunoglobulina de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 como una herramienta de diagnóstico.

12. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado de inmunoglobulina de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde al menos ochenta por ciento, al menos ochenta y cinco por ciento, al menos noventa por ciento, al menos noventa y cinco por ciento, al menos noventa y seis por ciento, al menos noventa y siete por ciento, al menos noventa y ocho por ciento o al menos noventa y nueve por ciento del conjugado de inmunoglobulina es monómero no oligomerizado.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 12 donde el conjugado de inmunoglobulina está en una concentración de al menos 10 mg/ml, al menos 30 mg/ml, al menos 40 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml, al menos 100 mg/ml, al menos 125 mg/ml o al menos 150 mg/ml.


 

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