Método para la secreción y producción de alto nivel de proteína.

Célula huésped transformada

(i) en la que se han introducido uno o una combinación de dos o más de los genes de chaperonas (a) a (c) a continuación:

(a) un gen que comprende ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1;

(b) un gen que se hibrida en condiciones rigurosas con un ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria al ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 y que codifica para una proteína que tiene una actividad de aumento de la secreción de proteínas foráneas, en la que las condiciones rigurosas comprenden una concentración de sodio de 15 a 750 mM, una temperatura de 25ºC a 70ºC, una concentración de formamida del 0% al 50%, lavándose el filtro a una concentración de sal de sodio de 15 a 600 mM y a una temperatura de 50ºC a 70ºC tras la hibridación; y

(c) un gen que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de al menos el 90% con la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 y que codifica para una proteína que tiene una actividad de aumento de la secreción de proteínas foráneas, en la que la homología se determina usando un programa FASTA o BLAST, o

(ii) en la que se han introducido uno o una combinación de dos o más de los genes que codifican para las proteínas chaperonas (d) a (f) a continuación:

(d) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2;

(e) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 y que tiene una actividad de aumento de la secreción de proteínas foráneas, en la que la homología se determina usando un programa FASTA o BLAST; y

(f) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 mediante deleción, sustitución y/o adición de uno a 10 aminoácidos y que tiene una actividad de aumento de la secreción de proteínas foráneas.

Método para la secreción y producción de alto nivel de proteína Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para la producción secretora de alto nivel de una proteína, principalmente en levadura.

Técnica anterior

Cuando se expresan proteínas secretoras, las secuencias señal de las mismas se reconocen por partículas de reconocimiento de señales (SRP), y las proteínas secretoras pasan entonces a través del translocón y entran en el retículo endoplásmico. Cuando las proteínas secretoras pasan a través del translocón, las estructuras de orden superior del mismo se sueltan y las proteínas se pliegan en el retículo endoplásmico (ER). El plegamiento de proteínas puede producirse espontáneamente y diversas chaperonas moleculares ayudan en tal plegamiento. Una conformación nativa formada en el retículo endoplásmico es crítica para la secreción, y las proteínas con un plegamiento erróneo no pueden entrar en la ruta secretora ubicada de manera posterior. Cuando las proteínas no se pliegan correctamente en el retículo endoplásmico, de manera desventajosa se agregan en el mismo proteínas que tienen estructuras de orden superior anómalas. Tal alteración en la modificación que tiene lugar en el retículo endoplásmico (es decir, la adición de una cadena de azúcar o un enlace disulfuro) y el transporte deteriorado desde el retículo endoplásmico provocan "estrés del retículo endoplásmico". Como medio para abordar tal estrés del retículo endoplásmico, se induce una respuesta de estrés denominada "respuesta de proteínas desplegadas (UPR)" en células eucariotas. La Inducción de transcripción y la regulación de la traducción de UPR son respuestas que restablecen las proteínas anómalas acumuladas. También existe un mecanismo denominado "degradación asociada a ER (ERAD)" que degrada y elimina las proteínas anómalas, para mantener la homeostasis en el retículo endoplásmico. Además, se conocen chaperonas moleculares que sueltan las proteínas agregadas con el propósito del plegamiento, así como chaperonas moleculares que ayudan en el plegamiento de proteínas en el retículo endoplásmico. Por ejemplo, HSP14 puede realizar una reacción que no puede realizarse con la ayuda de otras chaperonas que actúan conjuntamente con HSP7 y solubiliza proteínas de los agregados (Glover JR, Lindquist S, Hsp14, Hsp7 and Hsp4: A novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins, Cell, 1998, 94:73-82).

Entre tanto, las moléculas de anticuerpo forman agregados de una conformación apropiada (H2L2) a través de la formación de un enlace disulfuro entre la cadena pesada de anticuerpo y la cadena ligera de anticuerpo o entre cadenas pesadas de anticuerpo y formando un enlace disulfuro intramolecular de la cadena pesada de anticuerpo y la cadena ligera de anticuerpo. En el caso de células eucariotas tales como células de levadura, la introducción de un enlace disulfuro a través de plegamiento oxidativo de proteínas se lleva a cabo mediante la proteína disulfuro isomerasa (PDI) oxidativa en el retículo endoplásmico (Benjamín P. Tu y Jonathan S. Weissman, Oxidative protein folding in eukaryotes: Mechanisms and consequences, J. Cell Blol., 24, 164: 341-346). La PDI que se reduce por medio de oxidación de proteínas sustrato se reoxida mediante ER1 oxidativa ubicada en la proximidad de la membrana (Mezghrani, A., Fassio, A., Benham, A., Simmen, T., Braakman, I. y Sitia, R., Manipularon of oxidative protein folding and PDI redox state in mammalian cells, EMBO. J., 21, 2: 6288-6296 y Frand, A. R. y C. A. Kaiser, Erolp oxidizes protein disulfide isomerase in a pathway for disulflde bond formation in the endoplasmic reticulum, Mol. Cell, 1999, 4: 469-477). En el retículo endoplásmico de levaduras hay 5 tipos de familias de PDI (es decir, PD11, EUG1, MPD1, MPD2 y EPS1) (Per Norgaard, Vibeke Westphal, Christine Tachibana, Lene Alsoe, Bjorn Holst, Jakob R. Winther, Functional Differences in Yeast Protein Disulfide Isomerases, J. Cell Biology, 21, 152 (3): 553-562). De entre tales familias de PDI, aquéllas para las que se confirma que forman un enlace disulfuro intramolecular con ER1 se limitan a PDI1 y MPD2. También se notifica que la eficacia de plegamiento oxidativo de proteínas se mejora mediante B¡P/Kar2, que funciona en cooperación con PDI (Marcus Mayer, Ursula Kies, Robert Kammermeier y Johannes Buchner, BiP and PDI Cooperate in the Oxidative Folding of Antibodies in Vitro, J. Blol. Chem., 2, 275 (38): 29421-29425). B¡P/Kar2 también está asociada con la inducción mediante la FIAC1 activa de diversos genes asociados con la UPR mencionada anteriormente. La HAC1 activa se activa mediante el corte y empalme de HAC1 mediante la nucleasa/cinasa transmembrana IRE1. La IRE1 a la que se ha unido BiP/Kar2 se disocia cuando BiP/Kar2 actúa sobre una proteína que tiene una estructura anómala en el retículo endoplásmico, presenta una actividad nucleasa a través de la formación de un dímero y produce HAC1 activa mediante el corte y empalme de FIAC1 (Cox JS., Shamu CE., Walter P., Transcriptional ¡nduction of genes encoding endoplasmic reticulum resident proteins requires a transmembrane protein kinase, Cell, 1993, 73: 1197-126 y Sidrauski C. y Walter P., The transmembrane kinase Irelp is a site-specific endonuclease that initiates mRNA splicing in the unfolded protein response, Cell, 1997, 9 (6): 131-139). Además, B¡p/Kar2 se asocia con plegamiento de proteínas en el retículo endoplásmico en cooperación con SCJ1 ubicada en el retículo endoplásmico (Susana Silberstein, Gabriel Schlenstedt, Pam A. Silver y Reid Gilmore, A Role for the DnaJ Flomologue Scjlp in Protein Folding in the Yeast Endoplasmic Reticulum, J. Cell Biol., 1998, 143 (4): 921-933).

Por tanto, se ha demostrado que diversas chaperonas moleculares están asociadas con el plegamiento correcto de proteínas secretoras. Además, se han hecho intentos para aumentar la cantidad de proteínas secretoras producidas

con la ayuda de chaperonas moleculares. Cuando un enlace S-S produce abundante albúmina sérica humana en la levadura K. lactis, por ejemplo, la cantidad de producción aumenta 15 veces tras la introducción de ER1 o PDI1 (Tiziana Lodi, Barbara Neglla y Claudia Donnini, Secretion of human serum albumln by Kluyveromyces lactis overexpressing KIPDI1 and KIEROI, Applied. Environ. Microblol., 25, 71 (8): 4359-4363). Sin embargo, la introducción simultánea de EROI y PDI1 no conduce a una mejora adicional y simplemente adelanta el momento de producción. Además, IL-ip sin enlace S-S no produce ningún efecto. También se ha notificado que la cantidad de producción secretora aumentó 8 veces por medio de la coexpresión de Bip y PDI de rata, cuando se producen fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) en S. cerevisiae (Shusta, E. V., Raines, R. T., Pluckthun, A. y Wittrup, K. D., Increasing the secretory capacity of Saccharomyces cerevisiae for production of single-chain antibody fragments, Nat. Biotechnol., 1998, 16: 773-777). En este informe, se concluyó que Bip impide la agregación y se aumentó la cantidad de producción secretora de PDI mediante la actividad isomerasa en lugar de actividad chaperona. Cuando se producen fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla (scFv) en Pichia pastoris, además, la cantidad de producción secretora aumentó 3 veces por medio de la coexpresión con Bip; sin embargo, el uso de PDI o PDI en combinación con Bip no pudo producir ningún efecto (Damasceno, Leonardo, et al., Cooverexpression of chaperones for enhanced secretion of a single-chain antibody fragment in Pichia pastoris. Applied. Microbic. Biotech. (27) 74(2): 381-389). Además, se inspeccionaron los efectos de un nivel aumentado de PD1 sobre la secreción de IL-15 y el receptor del factor de necrosis tumoral (es decir, la proteína de fusión con Fe (TNFR:Fc)) en células CFIO. Como resultado, la sobreexpresión de PDI permitió la retención de TNFR:Fc (es decir, proteínas ricas en enlaces disulfuro) en las células, pero no se retuvo IL-15 en las células (Davis R., Schooley K., Rasmussen B., Thomas J., Reddy P., Effect of PDI overexpression on recombinant protein secretion in CHO cells. Biotechnol. Prog., 2, 16: 736-743). Esto sugiere que la sobreexpresión de PDI da como resultado de manera desventajosa una disminución en la cantidad de producción secretora en células CHO.

Tal como se describió anteriormente, se han hecho intentos para mejorar la producción secretora de proteínas tales como anticuerpos por medio de la coexpresión de chaperonas moleculares que ayudan en el plegamiento de proteínas. Sin embargo, no siempre pueden obtenerse efectos debido a los tipos o las combinaciones de células huésped o chaperonas moleculares. En un ejemplo de producción de anticuerpo, simplemente se producen anticuerpos... [Seguir leyendo]

Célula huésped transformada

(i) en la que se han introducido uno o una combinación de dos o más de los genes de chaperonas (a) a (c) a continuación:

(a) un gen que comprende ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1;

(b) un gen que se hibrida en condiciones rigurosas con un ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria al ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 y que codifica para una proteína que tiene una actividad de aumento de la secreción de proteínas foráneas, en la que las condiciones rigurosas comprenden una concentración de sodio de 15 a 75 mM, una temperatura de 25°C a 7°C, una concentración de formamida del % al 5%, lavándose el filtro a una concentración de sal de sodio de 15 a 6 mM y a una temperatura de 5°C a 7°C tras la hibridación; y

(c) un gen que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de al menos el 9% con la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 y que codifica para una proteína que tiene una actividad de aumento de la secreción de proteínas foráneas, en la que la homología se determina usando un programa FASTA o BLAST, o

(ii) en la que se han introducido uno o una combinación de dos o más de los genes que codifican para las proteínas chaperonas (d) a (f) a continuación:

(d) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2;

(e) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 9% con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 y que tiene una actividad de aumento de la secreción de proteínas foráneas, en la que la homología se determina usando un programa FASTA o BLAST; y

(f) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 mediante deleción, sustitución y/o adición de uno a 1 aminoácidos y que tiene una actividad de aumento de la secreción de proteínas foráneas.

Célula huésped transformada según la reivindicación 1 (i), en la que se han introducido adicionalmente uno o una combinación de dos o más de los genes de chaperonas (iv) a (vi) a continuación:

(iv) un gen que comprende ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 3, 5,

7, 9, 11 ó 13;

(v) un gen que se hibrida en condiciones rigurosas con un ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria al ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11 ó 13 y que codifica para una proteína que tiene una actividad de aumento de la secreción de proteínas foráneas, en la que las condiciones rigurosas comprenden una concentración de sodio de 15 a 75 mM, una temperatura de 25°C a 7°C, una concentración de formamida del % al 5%, lavándose el filtro a una concentración de sal de sodio de 15 a 6 mM y a una temperatura de 5°C a 7°C tras la hibridación; y

(vi) un gen que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de al menos el 9% con la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11 ó 13 y que codifica para una proteína que tiene una actividad de aumento de la secreción de proteínas foráneas, en la que la homología se determina usando un programa FASTA o BLAST.

Célula huésped transformada según la reivindicación 1 (ii), en la que se han introducido adicionalmente uno o una combinación de dos o más de los genes que codifican para las proteínas chaperonas (vii) a (ix) a continuación:

(vii) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4, 6, 8, 1, 12 ó 14;

(viii) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 9% con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4, 6, 8, 1, 12 ó 14 y que tiene una actividad de aumento de la secreción de proteínas foráneas, en la que la homología se determina usando un programa FASTA o BLAST; y

concentración de sal de sodio de 15 a 6 mM y a una temperatura de 5°C a 7°C tras la hibridación; y

(c) un gen que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de al menos el 9% con la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 y que codifica para una proteína que tiene una

actividad de aumento de la secreción de proteínas foráneas, en los que la homología se determina usando

un programa FASTA o BLAST,

o

un gen que codifica para cualquiera de las proteínas chaperonas (d) a (f) a continuación :

(d) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2;

(e) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el

9% con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 y que tiene una actividad de aumento de

la secreción de proteínas foráneas, en los que la homología se determina usando un programa FASTA o BLAST; y

(f) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos

mostrada en SEQ ID NO: 2 mediante deleción, sustitución y/o adición de uno a 1 aminoácidos y que tiene

una actividad de aumento de la secreción de proteínas foráneas.