Método para aislamiento de polipéptidos solubles.

Un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 22.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10190155.

Solicitante: NATIONAL RESEARCH COUNCIL OF CANADA.

Nacionalidad solicitante: Canadá.

Dirección: Building M-58, EG-06B 1200 Montreal Road Ottawa, ON K1A 0R6 CANADA.

Inventor/es: TANHA,Jamshid.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K16/00 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales.
  • C07K16/12 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra materiales bacterianos.
  • C12N15/10 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
  • G01N33/68 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.

PDF original: ES-2534305_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Método para aislamiento de polipéptidos solubles Campo de la Invención

Esta Invención se refiere al aislamiento, identificación y manipulación de polipéptidos, especialmente fragmentos de anticuerpos humanos monómeros.

Antecedentes de la Invención

Los anticuerpos en los vertebrados se componen típicamente de cadenas pesada (H) y ligera (L) apareadas. El primer dominio de las cadenas H y L combinadas, VH y VL, son de secuencia más variable, y esta es la porción del anticuerpo que reconoce el antígeno y se fija al mismo. Los dominios VHy VL reconocen el antfgeno como un par.

El repertorio ¡nmunológlco de los Camélidos (camellos, dromedarios y llamas) es único en el sentido de que posee tipos raros de anticuerpos a los que se hace referencia como anticuerpos de cadena pesada (Hamers, Casterman C. et al., 1993). Estos anticuerpos carecen de cadenas ligeras y por tanto sus sitios de combinación están constituidos por un solo dominio, denominado VhH.

Los anticuerpos VhH recombinantes de un solo dominio (sdAbs) proporcionan varias ventajas sobre los fragmentos FV monocatenarios (scFv) derivados de anticuerpos convencionales de cuatro cadenas. Si bien los sdAbs son comparables a sus contrapartidas scFv en términos de afinidad, los mismos superan a los scFv en términos de solubilidad, estabilidad, resistencia a la agregación, susceptibilidad de replegado, rendimiento de expresión, y facilidad de manipulación del DNA, construcción de bibliotecas y determinaciones estructurales 3-D. Muchas de las propiedades anteriormente mencionadas de los VhH sdAbs son deseables en aplicaciones que implican anticuerpos

Sin embargo, la naturaleza no humana de los VhHs limita su uso en inmunoterapia humana debido a inmunogenicidad. A este respecto, los sdAbs Vh y Vl humanos son candidatos ideales para aplicaciones de inmunoterapia debido a que se confía que sean menos inmunógenos.

Los VHs y VLs humanos, sin embargo, son por lo general tendentes a agregación, una característica común a los VhS y Vi_s derivados de anticuerpos convencionales (Davies, J. et al., 1994; Tanha, J. et al., 2001; Ward E.S. et al., 1989). Por ello, se han realizado intentos para obtener VhS y VLs humanos adecuados para aplicaciones de anticuerpos. Tales VhS y Vls han exhibido también otras propiedades útiles típicas de los VhHs tales como alto rendimiento de expresión, alta susceptibilidad de replegado y resistencia a la agregación. Bibliotecas sintéticas construidas a base de estos VHs y VLs como andamiajes de biblioteca podrían servir como una fuente prometedora de proteínas terapéuticas.

La camelización y la llamización, que implican incorporar residuos importantes de solubilidad de los VhHs de camello y llama, respectivamente, en VhS o Vls humanos se han empleado para generar Vhs y VLs humanos monómeros. Se ha demostrado que bibliotecas sintéticas de sdAb construidas sobre la base de estos VHs y Vls y generadas por aleatorización de CDR son funcionales en términos de producción de ligantes para diversos antígenos (Davies, J. et al., 1995; Tanha J. etal., 2001).

En otro enfoque, se aislaron Vhs y VLs monómeros totalmente humanos de bibliotecas de VH y VL sintéticos humanos sin recurrir a ingeniería de la clase arriba mencionada. En un experimento, se descubrió un VH humano monómero cuando una biblioteca de Vh humano se lavó en batea contra lisozima de huevo de gallina (Jespers, L. ef al., 2004b). Más recientemente, un método de selección basado en criterios de desplegado reversible y afinidad produjo un gran número de VhS monómeros a partir de bibliotecas de Vh humanas sintéticas (Jespers, L. et al., 2004a). Este descubrimiento puso de manifiesto el hecho de que un método de selección apropiado es fundamental para la captura eficiente de Vhs humanos monómeros raros con propiedades biofísicas deseables.

Sumario de la Invención

La invención es resultado de un método para aislamiento de polipéptidos, preferiblemente fragmentos de anticuerpo, y muy preferiblemente Vhs y V[_s humanos con propiedades biofísicas deseables (solubilidad, estabilidad, expresión alta, carácter monómero, ausencia de agregación, especificidad de fijación). El método incluye los pasos de obtención de una biblioteca de presentación de fago capaz de expresar una diversidad de secuencias de polipéptido, permisión de la infección de un césped bacteriano por el fago de la biblioteca, e identificación de fagos que forman calvas de tamaño mayor que la media en el césped bacteriano.

Se aíslan luego los fagos y se realizan pasos para secuenciar o caracterizar de otro modo las secuencias de polipéptido.

La invención proporciona polipéptidos, especialmente Vhs humanos monómeros, que pueden ser útiles para inmunoterapia, y/o como agentes de diagnóstico o detección. Los Vhs humanos monómeros pueden combinarse

también para formar dímeros, trímeros, pentámeros u otros multímeros, que pueden ser útiles para inmunoterapia y/o como agentes de diagnóstico o detección.

Los polipéptidos identificados en esta memoria, que incluyen VhS humanos, pueden ser manipulados por métodos tales como desordenamiento del DNA para seleccionar propiedades biofísicas mejoradas tales como solubilidad, estabilidad, carácter monómero, expresabilidad alta, especificidad de fijación y origen humano.

Los polipéptidos Identificados en esta memoria, que incluyen Vhs humanos, pueden utilizarse también para generar bibliotecas de presentación ulteriores, que pueden utilizarse después a su vez para aislar polipéptidos adicionales por el método anterior.

En un primer aspecto, la presente Invención proporciona un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

En un segundo aspecto, la presente Invención proporciona un fragmento de anticuerpo Vh que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.

En un tercer aspecto, la presente Invención proporciona un método para producción de polipéptidos con propiedades biofísicas deseables, que comprende los pasos de a) proporcionar una secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento de anticuerpo conforme a la reivindicación 1 o la reivindicación 2; b) proporcionar secuencias de oligonucleótidos con codones aleatorizados; c) incorporar los ollgonucleótidos aleatorlzados en la secuencia de nucleótidos que codifica una o más de una de las reglones determinantes de la complementariedad (CDR) del fragmento de anticuerpo, de tal modo que una o más de las CDRs está aleatorizada; y d) expresar las secuencias de nucleótidos producidas en el paso (c).

Descripción Detallada de los Dibujos

Leyendas de las figuras

Figura 1. Una representación gráfica de resultados de ejemplos seleccionados: El contraste en el tamaño de calva entre fagos que presentan un VH soluble (HVHP428) y aquéllos que presentan uno ¡nsoluble (BT32/A6). La fotografía muestra una parte de la placa de agar de césped bacteriano que se amplió para mejorar la vlsuallzaclón de la calva. Aunque la placa contenía un número igual de cada uno de los dos tipos de calva, la fotografía contiene esencialmente las calvas HVHP428, de tamaño grande. La mayoría de las calvas BT32/A6 eran demasiado pequeñas para producir imágenes claras bien definidas en la fotografía. Por tanto, las calvas marcadas por flechas representan una proporción menor de fagos BT32/A6 que eran lo suficientemente grandes para ser visibles en esta imagen. Los asteriscos marcan tamaños de calva representativos para los fagos HVHP428. Las identidades de las calvas se determinaron por secuenciación del DNA.

Figura 2. Secuencia de aminoácidos de los Vhs humanos seleccionados sobre la base de afinidad para la proteína A y tamaño de la calva. Los puntos en las entradas de la secuencia indican identidad de aminoácidos con HVHP2M10 o HVHP44. Se incluyen guiones para alineación de las secuencias. Los residuos en las posiciones de solubilidad principales y el residuo 57T que se asocia con Vhs/VhHs con propiedad de fijación de proteína A se muestran en negrilla. Se utiliza el sistema de numeración Kabat. El valor de "frecuencia" total es 114. CDR = región determinante de la complementariedad; FR = región de entramado; gln seq = secuencia de la línea germinal

Figura 3. Tendencias de agregación de los Vhs humanos. Cromatogramas de filtración en gel que comparan el estado de oligomerización de un Vh humano aislado en este estudio (HVHP428) con el de un VhH de llama (H11C7) y un Vh humano típico (BT32/A6). El pico que se eluye en último lugar en cada cromatograma corresponde al Vh monómero. El pico H11C7 dímero está marcado por una flecha. B, espectros 1H NMR unidimensionales de HVHP414 a 800 MHz (i), HVHP423 a 500 MHz (ii) y... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un fragmento de anticuerpo que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 22.

2. El fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el fragmento de anticuerpo es un VH.

3. Una secuencia de ácido nucleico que codifica el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2.

4. Un multímero que comprende el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2.

5. Un dímero que comprende el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2.

6. Un trímero que comprende el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2.

7. Un pentámero que comprende el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2.

8. Un vector recombinante que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 3.

9. Una célula hospedadora transformada con el vector recombinante de la reivindicación 8.

10. Un método para producir una biblioteca de fragmentos de anticuerpo, que comprende:

a) proporcionar una secuencia de nucleótidos que codifica el fragmento de anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2;

b) proporcionar secuencias de oligonucleótidos con codones aleatorizados;

c) incorporar los oligonucleótidos aleatorizados en la secuencia de nucleótidos que codifica una o más de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del fragmento de anticuerpo, de tal modo que una o más de las CDR está aleatorizada; y

d) expresar las secuencias de nucleótidos producidas en el paso c)

e) someter a cribado las secuencias expresadas para fijación a un polinucleótido diana.

11. Uso de una biblioteca de fragmentos de anticuerpo obtenida por el método de la reivindicación 10, para someter a cribado las secuencias expresadas para fijación a un polipéptido diana.

12. El uso de la reivindicación 11, en donde el cribado comprende lavado en batea contra una molécula diana.


 

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