Metodo multiparametro de alta sensibilidad para el análisis de eventos extraños en una muestra biológica.

Un método para aumentar la sensibilidad en los análisis de casos raros que comprende:

a. la preparación de la muestra mediante el etiquetado fluorescente;

b. el escaneado de la muestra para identificar los blancos, en el cual el blanco es seleccionado de un grupo que contiene células epiteliales circulantes, células, células tumorales circulantes, células endoteliales circulantes, leucocitos, subconjuntos de linfocitos, células que contienen un orgánulo o un receptor de interés, restos celulares, células rotas y sus restos, o combinaciones de los mismos;

c. la aspiración del fluido de la muestra para dejar los blancos en la misma ubicación;

d. el fotoblanqueo de los blancos;

e. el retinte del blanco con un marcador fluorescente secundario en el que dicho marcador secundario es un anticuerpo fluorescente conjugado o una combinación de un conjugado de anticuerpo fluorescente y un colorante;

f. el nuevo escaneado de los blancos; y

g. la repetición de las etapas c a f para cada marcador fluorescente adicional.

Metodo multiparametro de alta sensibilidad para el análisis de eventos extraños en una muestra biológica Descripción ANTECEDENTES DEL INVENTO

Campo del Invento [0001] El invento está relacionado con los campos de la oncología y de las pruebas de diagnóstico. El invento es útil para exploraciones, estadificación, respuestas al tratamiento, reincidencias o análogas, en enfermedades tales como el cáncer o enfermedades cardiovasculares. Más específicamente, el presente invento proporciona métodos que facilitan el análisis y la enumeración de las células circulantes raras aisladas de muestras biológicas.

Antecedentes [0002] Los métodos para la caracterización no sólo de células tumorales, sino también de células raras u otros organismos biológicos de muestras biológicas han sido previamente descritos (US 6, 365, 362) .

Este método de dos etapas requiere de un eficiente enriquecimiento para asegurar la consecución de células diana mientras es eliminada una cantidad sustancial de restos y otras sustancias que interfieren previamente al análisis, permitiendo el examen celular mediante técnicas de imagen. El método combina elementos de enriquecimiento inmunomagnético con citometría de flujo multiparamétrica, microscopía y análisis inmunocitoquímico de una manera automatizada única. El método combinado se usa para enriquecer y enumerar células epiteliales en muestras de sangre, proporcionando así una herramienta para la medición del cáncer.

El método de dos etapas tiene aplicaciones en el pronóstico del cáncer y en la supervivencia de los pacientes con cáncer metastásico (WO 04076643) . Basándose en la presencia de células cancerosas morfológicamente intactas, este método es capaz de correlacionar la presencia de células cancerosas circulantes de pacientes con cáncer de mama metastásico con el tiempo de progresión de la enfermedad y la supervivencia. Más específicamente, la presencia de cinco (5) o más células tumorales circulantes por 7, 5 mililitros proporciona un valor predictivo en el primer seguimiento, proporcionando así un indicador de pronóstico temprano de la supervivencia del paciente.

La especificidad del ensayo descrito anteriormente aumenta con el número de células detectadas y no es el adecuado en los casos en los cuales solo pocas (generalmente menos de 5 células tumorales circulantes) son detectadas. Una solución para este problema es proporcionar la información genética detallada sobre las células sospechosas de cáncer. Por consiguiente, un método que incorporaría el enriquecimiento de una muestra de sangre con citometría de imagen multiparamétrica y el análisis genético multiparamétrico de una célula individual sospechosa de cáncer proporcionaría un perfil completo y un mecanismo de confirmación que mejoraría significativamente los procedimientos actuales de las revisiones a los pacientes, evaluando la reincidencia de la enfermedad o la supervivencia general. Un ensayo confirmatorio en el análisis de células circulantes raras mediante la combinación de análisis multiparamétricos fenotípicos y genotípicos de una célula diana aislada individualmente ha sido descrito (véase la solicitud pendiente de Estados Unidos 12/067, 532) . La confirmación proporciona un nivel clínicamente significativo de la sensibilidad y, por lo tanto, la garantía para el facultativo de cualquier tipo de información cuantitativa obtenida. Los estados patológicos relevantes son evaluados utilizándose un número extremadamente pequeño (1, 2, 3, o 4) de células tumorales circulantes (CTC) y proporcionan una estructura para la detección temprana de la enfermedad.

No hay otras tecnologías disponibles capaces de realizar múltiples ensayos de alta sensibilidad en la misma muestra con el mismo marcador y lo hacen en casos raros. La citometría de flujo multiparamétrica se hace comúnmente, pero requiere cientos o miles de células diana o blancos para obtener una información precisa. Sin embargo, si un paciente sólo tiene 6 CTC en 7, 5 mLs de sangre, no es un caso suficiente para detectarse de forma fiable, por no hablar de la ejecución del análisis multiparamétrico.

El presente invento amplia el protocolo de enriquecimiento y análisis descritos en el US 6.365.362 y utilizado en los Sistemas Celltracks® Autoprep® y Celltracks® Analyzer II System (Immunicon Corporation, Huntingdon Valley, PA) , proporcionando un medio para permitir la interrogación de células circulantes raras con múltiples biomarcadores fluorescentes.

WO2007/053245 muestra métodos para el análisis genético de las células que se han identificado después de la selección inmunomagnética y del etiquetado fluorescente. EP1722230 se refiere a métodos para la detección de un patrón molecular de una enfermedad específica en una muestra de tejido de la piel de un paciente y/o una muestra del tejido de la mucosa de la piel vecina, en el que la disposición espacial de los epítopos en la muestra es extraída a través de la identificación del patrón de la combinación molecular específica de la enfermedad.

RESUMEN DEL INVENTO

El invento, tal y como se define en las reivindicaciones, consiste en un método que consta de cinco partes que trabajan conjuntamente para lograr el resultado final. El método consiste esencialmente en (1) Escaneado de un cartucho para identificar aquellos con células diana de interés y su ubicación en el cartucho; (2) Aspiración del fluido del cartucho para secar o fijar de forma activa las células en su posición en cubreobjetos; (3) Fotoblanqueo de las señales fluorescentes para eliminar la fluorescencia que se utilizó originalmente para identificar la célula diana; (4) Retinte de las células dentro del cartucho con uno o más anticuerpo (s) fluorescente (s) conjugado (s) con una combinación de anticuerpos y un colorante para identificar marcadores, receptores, proteínas, etc., de interés en o dentro del blanco de interés; (5) Nuevo escaneado del cartucho y retorno a los blancos de interés previamente identificados determinando si las células son positivas o negativas para los marcadores o proteínas deseadas.

Una muestra de sangre que contiene CTC, u otras células de interés, es teñida con marcadores fluorescentes de análisis de imágenes y es escaneada para identificar la presencia y la ubicación de las células diana o los elementos subcelulares en el cartucho. Se procesa a continuación una muestra que contiene las células diana deseadas o los elementos subcelulares, en parte a través del fotoblanqueo de la muestra, de manera que estos mismos blancos pueden volver a ser analizados con biomarcadores adicionales conjugados con los mismos o diferentes fluorocromos usándose los mismos criterios de imagen que se utilizaron en el análisis inicial. El presente invento se aplica a blancos como las células epiteliales circulantes, células, células tumorales circulantes, células endoteliales circulantes, leucocitos, subconjuntos de linfocitos, células que contienen un orgánulo o un receptor de interés, restos celulares, células rotas y sus restos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Panel A Confirmación de la integridad de la muestra y de la ubicación del blanco después del secado. Panel B Las células se muestran en el mismo lugar antes y después del secado.

Figura 2: Retinte del cartucho después del secado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Panel A Confirmación de la integridad de la muestra y la ubicación del blanco después del secado. Panel B Las células se muestran en el mismo lugar antes y después del secado.

Figura 2: Retinte del cartucho después del secado.

Figura 3: Blanqueo de la señal fluorescente utilizando LEDs. Panel A Blanqueo de células SKBR teñidas con C11-PE seguido del retinte con C11-FITC. Panel B Blanqueo de las células teñidas con PC3-9 C11-PE seguido de retinte con C11-FITC.

Figura 4: Panel A presenta el escaneado inicial de las células teñidas con SKBR C11-PE. Panel B presenta la muestra después del blanqueo y retinte con solo C11-FITC. Panel C presenta la muestra reteñida con C11-FITC y pART-PE.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL INVENTO

Las células tumorales circulantes (CTCs) extraídas de la sangre han sido detectadas y analizadas mediante los Sistemas Cell-Tracks® Autoprep® y CellTracks® Analyzer II System (Immunicon Corporation, Huntingdon Valley, PA) . En este procedimiento, se utiliza una combinación de biomarcadores fluorescentes y colorantes para identificar las células de origen epitelial y para distinguirlas de los leucocitos contaminados. La plataforma de análisis CellTracks® se limita a cuatro canales o colores para detectar estos marcadores fluorescentes.... [Seguir leyendo]

1. Un método para aumentar la sensibilidad en los análisis de casos raros que comprende:

a. la preparación de la muestra mediante el etiquetado fluorescente;

b. el escaneado de la muestra para identificar los blancos, en el cual el blanco es seleccionado de un grupo que contiene células epiteliales circulantes, células, células tumorales circulantes, células endoteliales circulantes, leucocitos, subconjuntos de linfocitos, células que contienen un orgánulo o un receptor de interés, restos celulares, células rotas y sus restos, o combinaciones de los mismos;

c. la aspiración del fluido de la muestra para dejar los blancos en la misma ubicación;

d. el fotoblanqueo de los blancos;

e. el retinte del blanco con un marcador fluorescente secundario en el que dicho marcador secundario es un anticuerpo fluorescente conjugado o una combinación de un conjugado de anticuerpo fluorescente y un colorante;

f. el nuevo escaneado de los blancos; y g. la repetición de las etapas c a f para cada marcador fluorescente adicional.

2. El método de la reivindicación 1 en el que dicho blanco son las células tumorales circulantes.

3. El método de la reivindicación 1 en el que una etapa adicional consiste en la delimitación del perfil multiparamétrico genotípico de dicho blanco.

4. El método de la reivindicación 3 en el que dicha delimitación del perfil del genotipo es FISH.