Células etiquetadas para su uso como un control interno funcional en ensayos de detección de células raras.

Un método para detectar y enumerar células raras en una población de células mezcladas,

siendo la presencia de dichas células raras en dicha población indicativa de la severidad de una enfermedad, que comprende:

a) Preparar una muestra inmunomagnética en la que una muestra de sangre obtenida de un sujeto de prueba se mezcla con partículas magnéticas, dicha muestra comprende una población de células mezcladas que se cree que contiene dichas células raras y dichas partículas magnéticas se acoplan a un ligando que reacciona específicamente con un determinante de las células raras para la exclusión sustancial de otros componentes de la muestra.

b) Poner en contacto dicha muestra inmunomagnética con, al menos, un reactivo que marca un determinante de las células raras; y

c) analizar las células raras marcadas para determinar la presencia y el número de cualquiera de las células raras en la muestra inmunomagnética, el mayor número de células raras presentes en dicha muestra, la mayor severidad de la enfermedad,

donde la célula de control tiene determinantes en común con las células raras y en la que la membrana de dicha célula de control se encuentra marcada de forma detectable y los componentes celulares y restos antigénicos de la célula de control han sido estabilizados durante un período de hasta seis meses mediante la exposición a un fijador,

donde, opcionalmente, dicha célula rara es una célula cancerígena y dicha enfermedad es cáncer.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al uso de células previamente marcadas como control funcional Interno en los procedimientos de selección y análisis de células. La invención proporciona una única entidad que puede controlar esos diversos parámetros como marcado magnético, selección magnética, viscosidad, temperatura, adición de reactivos, actividad de reactivos y error del operador en procedimientos que implican el aislamiento de células raras. La invención es útil en aspectos de la selección de células que Incluye cribado de cáncer, estadlflcaclón, monitorización de tratamientos de quimioterapia, monltorizaclón de recaída, hibridación de ADN y otras numerosas formas de diagnóstico y monitorización médicos. La presente Invención es especialmente útil en la separación de células raras.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La mayoría de las muertes por cáncer no se producen por el tumor primarlo. En su lugar, la muerte se produce por metástasis, es decir, múltiples colonias de tumor extendidas establecidas por células malignas que se unen a sí mismas desde el sitio del tumor original y se desplazan por el cuerpo, frecuentemente a sitios distantes. Si un tumor primario se detecta suficientemente pronto, la cirugía, la radiación, la quimioterapia o alguna combinación de estos tratamientos puede eliminarlo frecuentemente. Desafortunadamente, las colonias metastásicas son más difíciles de detectar y eliminar y frecuentemente es Imposible tratar todas ellas satisfactoriamente. Por tanto, desde un punto de vista clínico, las metástasis pueden considerarse el acontecimiento decisivo en la progresión natural del cáncer.

Además, la capacidad de metastatlzar es la propiedad que caracteriza excepcionalmente a un tumor maligno. La metástasis de cáncer comprende la siguiente serie compleja de acontecimientos secuenciales:

1. Extensión desde el locus primario a los tejidos circundantes;

2. Penetración en cavidades y vasos del cuerpo;

3. Liberación de células tumorales para el transporte por el sistema circulatorio hasta sitios distantes;

4. Reinvasión de tejido en el sitio de ataque; y

5. Adaptaciones al nuevo entorno de manera que se promueva la supervivencia de células tumorales, la vascularización y el crecimiento tumoral.

Basándose en la complejidad del cáncer y la metástasis del cáncer, y la frustración en el tratamiento de pacientes con cáncer con el transcurso de los años, se han hecho muchos Intentos por desarrollar pruebas de diagnóstico para guiar el tratamiento y monitorizar los efectos de tal tratamiento en metástasis o recaída. Tales pruebas también podrían usarse supuestamente para el cribado de cáncer, sustituyendo pruebas relativamente rudimentarias tales como la mamografía para tumores de mama o exámenes rectales digitales para cánceres de próstata. Para ese fin se han desarrollado varias pruebas durante los últimos 20 años y se han evaluado sus beneficios. Uno de los primeros intentos fue la formulación de un inmunoensayo para el antígeno carcinoembrionarlo [CEA], Este antígeno aparece en células fetales y reaparece en células tumorales en ciertos cánceres. Se han hecho grandes esfuerzos para evaluar la utilidad de probar para CEA, además de para muchos otros antígenos tumorales tales como PSA, CA 15.3, CA125, PSMA, CA27.29. Estos esfuerzos han demostrado ser algo Inútiles ya que la aparición de tales antígenos en una muestra de prueba no ha sido generalmente predictlva y se detectan frecuentemente cuando hay poca esperanza para el paciente. Sin embargo, en los últimos años, una prueba ha demostrado ser útil en la detección temprana de cáncer, concretamente PSA para cánceres de próstata. Óuando se usa con examen físico de seguimiento y biopsia, la prueba de PSA ha desempeñado una notable fundón en la detección temprana de cáncer de próstata, momento en el que se trata mejor.

A pesar del éxito de la prueba de PSA, la prueba deja mucho que desear. Por ejemplo, altos niveles de PSA no siempre establecen una correlación con cáncer ni parecen ser una indicación del potencial metastáslco del tumor. Esto puede ser debido en parte al hecho de que el PSA es un componente de tejido de próstata normal, además de otros factores desconocidos. Además, cada vez es más evidente que un gran porcentaje de pacientes con cáncer de próstata continuarán teniendo enfermedad localizada que no es potencialmente mortal. Basándose en el deseo de obtener una mejor concordancia entre aquellos pacientes con cánceres que metastatizarán y aquellos que no se ha intentado determinar si las células de la próstata están en la circulación. Cuando se añade a altos niveles de PSA y datos de biopsia, la existencia de células tumorales en circulación podrían dar indicaciones de cómo de enérgicamente debería tratarse el paciente.

El enfoque recomendado para determinar la presencia de células tumorales de la próstata en circulación ha sido probar la expresión de ARN mensajero de PSA en sangre. Esto se está haciendo mediante el laborioso

procedimiento de aislar todo el ARNm de una muestra de sangre y realizar RT-PCR. No existe una buena correlación entre la presencia de tales células en la sangre y la capacidad de predecir qué pacientes están en necesidad de un tratamiento enérgico (LG Gomella, J of Urology, 158:326-337(1997)). Es de notar que la PCR es difícil de realizar cuantitativamente, si no imposible, en muchas situaciones, es decir, para determinar el número de células tumorales por volumen unitario de muestra biológica. Adicionalmente, frecuentemente se observan positivos falsos usando esta técnica. Un inconveniente añadido es el límite finito y práctico a la sensibilidad de esta técnica basándose en el tamaño de muestra examinado. Normalmente, la prueba se realiza en 105 a 10® células purificadas de eritrocitos interfe rentes. Con 5-10x10® leucocitos en sangre normal, esto se corresponde con un límite inferior práctico de sensibilidad de una célula tumoral/0,1 mi de sangre. Por tanto, se necesita que haya aproximadamente 10 células tumorales en un mi de sangre antes de que la señal sea detectable. Como complicación adicionalmente posible, las células tumorales son frecuentemente genéticamente inestables. Por consiguiente, las células cancerosas que tienen transposiciones genéticas y cambios de secuencias pueden pasarse por alto en un ensayo de PCR ya que puede perderse la complementariedad de secuencias necesarias entre cebadores de PCR y secuencias diana.

En resumen, una prueba de diagnóstico útil necesita ser altamente sensible y cuantitativa de forma fiable. Una prueba tal debe poder detectar la presencia de una única célula tumoral en un mi de sangre, correspondiéndose así en promedio con 3000-4000 células totales en circulación. En estudios de inoculo que establecen tumores en animales, ese número de células puede conducir de hecho al establecimiento de un tumor. Además, si 3000-4000 células en circulación representan el 0,01% de las células totales en un tumor, entonces contendría aproximadamente 4x107 células totales. Un tumor que contiene ese número de células no sería visible por ninguna técnica actualmente existente. De ahí que, si las células tumorales se propagaran en las fases tempranas de cáncer, una prueba con la sensibilidad mencionada anteriormente detectaría el cáncer. Si las células tumorales se propagaran en alguna relación funcional con el tamaño del tumor, entonces sería beneficiosa una prueba cuantitativa para evaluar la carga tumoral. Hasta ahora no se ha informado de información referente a la existencia de células tumorales en circulación en cánceres muy tempranos. Además, hay dudas muy considerables en la bibliografía médica referentes a la existencia de tales células y el potencial de tal información. La visión general es que los tumores están inicialmente muy confinados y de ahí que haya pocas células, si hay alguna, en circulación en fases tempranas de la enfermedad, y que sería poco probable que la detección temprana de células cancerosas en circulación, aunque fuera viable, proporcionara cualquier información útil.

Basándose en lo anterior, es evidente que es altamente deseable un procedimiento para identificar aquellas células en circulación con potencial metastásico antes del establecimiento de un tumor secundario, particularmente durante las fases tempranas de cáncer. Para apreciar la ventaja que una prueba tal tendría sobre inmunoensayos convencionales se considera que un inmunoensayo altamente sensible tiene un límite de sensibilidad funcional inferior a 10"17 moles. Si una célula tumoral puede capturarse de un mi de sangre y analizarse, el número de moles de receptor de... [Seguir leyendo]

1. Un método para detectar y enumerar células raras en una población de células mezcladas, siendo la presencia de dichas células raras en dicha población indicativa de la severidad de una enfermedad, que comprende:

a) Preparar una muestra inmunomagnétlca en la que una muestra de sangre obtenida de un sujeto de prueba se mezcla con partículas magnéticas, dicha muestra comprende una población de células mezcladas que se cree que contiene dichas células raras y dichas partículas magnéticas se acoplan a un ligando que reacciona específicamente con un determinante de las células raras para la exclusión sustancial de otros componentes de la muestra.

b) Poner en contacto dicha muestra ¡nmunomagnética con, al menos, un reactivo que marca un determinante de las células raras; y

c) analizar las células raras marcadas para determinar la presencia y el número de cualquiera de las células raras en la muestra ¡nmunomagnética, el mayor número de células raras presentes en dicha muestra, la mayor severidad de la enfermedad,

donde la célula de control tiene determinantes en común con las células raras y en la que la membrana de dicha célula de control se encuentra marcada de forma detectable y los componentes celulares y restos antigénicos de la célula de control han sido estabilizados durante un período de hasta seis meses mediante la exposición a un fijador,

donde, opcionalmente, dicha célula rara es una célula cancerígena y dicha enfermedad es cáncer.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha membrana se marca de forma redundante con, al menos, dos marcadores fluorescentes con las mismas propiedades espectrales.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dicho marcador de la membrana se selecciona del grupo formado por carbocianinas lipofílicas de cadena larga, ¡ndocarboclanlnas llpofíllcas de cadena larga, indodicarbocianinas lipofílicas de cadena larga y análogos de las mismas, colorantes amlnoestlril lipofílicos y los análogos de cadena larga de colorantes rodamina B C18 y de fluoresceína C18.

4. El método de la reivindicación 1, en el que dicho ligando es un antl-EpCam, y dicho reactivo marca una citoqueratina ¡ntracelular, dicho Epcam y dicha citoqueratlna están presentes tanto en dicha célula rara como en dicha célula de control.

5. Un kit para cribar una muestra de un paciente para la presencia de células tumorales circulantes, que

comprende:

a) nanopartículas magnéticas recubiertas que comprenden un material de núcleo magnético, un material de revestimiento de base de proteína y un antl-EpCam acoplado, directa o Indirectamente, a dicho material de revestimiento de base;

b) Al menos un anticuerpo con especificidad de unión para un determinante de una célula cancerígena;

c) Un colorante específico de célula para excluir componentes de muestra distintos a dichas células tumorales a partir del análisis.

d) Un recipiente que comprende células establllzadoras para su uso como control interno, dichas células estabilizadoras de control tienen determinantes en común con dichas células raras, en las que dicha membrana de dicha célula de control se encuentra marcada de forma detectable, y se han estabilizado componentes celulares y restos antigénicos de dicha célula control para un período de hasta seis meses mediante la exposición al fijador, siendo dichas células establllzadoras de control suspendidas en un medio de densidad de flotación.

6. El método de la reivindicación 4 o el kit de la reivindicación 5, en el que la célula de control es:

una célula de cáncer de mama SKBR3, que comprende, además, un determinante de superficie marcado de forma detectable seleccionado del grupo formado por mamoglobulina, globulina de la grasa de la leche humana y HER -21 neu;

una célula de cáncer de mama MCF - 7, que comprende, además, un segundo determinante de superficie marcado de forma detectable que es un receptor de estrógeno;

una célula de cáncer de próstata LNCaP, que comprende, además, un segundo determinante de superficie marcado de forma detectable seleccionado del grupo formado por PSMA, PSA y receptor de andrógeno;

una célula cancerígena de leucemia de células T CEM, que comprende, además, un segundo determinante de superficie marcado de forma detectable que es una molécula CD4;

una célula de leucemia de células B Raji, que comprende, además, un segundo determinante de superficie marcado de forma detectable que es una molécula CD19;

una célula de leucemia no Hodgkin SU - DHL, que comprende, además, un segundo determinante de superficie marcado de forma detectable que es una molécula CD20; o

una célula cancerígena de melanoma C32, que comprende, además, un segundo determinante de superficie marcado de forma detectable que es una molécula CD146.