Métodos y materiales para identificar el origen de un carcinoma de origen primario desconocido.

Método de identificación del origen de una metástasis de origen desconocido que comprende las etapas de a.

medir los Biomarcadores asociados con tres carcinomas diferentes en una muestra que contiene células metastásicas, en el que los Biomarcadores son los niveles de expresión de genes Marcadores y en el que los genes Marcadores están seleccionados de entre:

i. SP-B, TTF y DSG3, que son marcadores para el cáncer de pulmón;

ii. F5 y PSCA, que son marcadores para el cáncer de páncreas; y

iii. CDH17, que es un marcador para el cáncer de colon;

b. combinar los datos de los Biomarcadores en un algoritmo en el que el algoritmo i. normaliza los Biomarcadores frente a una referencia; e

ii. impone un punto de corte que optimiza la sensibilidad y la especificidad de cada Biomarcador, pondera la prevalencia de los carcinomas y selecciona un tejido de origen;

c. determinar el origen en base a la probabilidad más alta determinada por el algoritmo o determinar que el carcinoma no se deriva de un conjunto concreto de carcinomas; y

d. opcionalmente medir los Biomarcadores específicos para uno o más carcinomas diferentes adicionales, y repetir las etapas c) y d) para los Biomarcadores adicionales.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona métodos, usos de kits, etc. para identificar el origen de un carcinoma de origen primario desconocido.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El carcinoma de origen primario desconocido (CUP) es un conjunto de neoplasias heterogéneas, confirmadas por biopsia, en las que la enfermedad metastásica se presenta sin un tejido de origen (ToO) o sitio del tumor primario identificable. Este problema representa aproximadamente el 3%-5% de todos los cánceres, por lo que es la séptima neoplasia más común. Ghosh et al. (2005) ; y Mintzer et al. (2004) . El pronóstico y régimen terapéutico de los pacientes dependen del origen del tumor primario, lo que recalca la necesidad de identificar el sitio del tumor primario. Greco et al. (2004) ; Lembersky et al. (1996) ; y Schlag et al. (1994) .

Actualmente se utilizan diversos métodos para resolver este problema. En las figuras 1-2 se esquematizan varios métodos seguidos. Pueden utilizarse Marcadores tumorales séricos para el diagnóstico diferencial. Aunque carecen de especificidad adecuada, pueden utilizarse en combinación con la información clínica y patológica. Ghosh et al. (2005) . Pueden utilizarse métodos de inmunohistoquímica (IHC) para identificar el linaje del tumor, pero muy pocos Marcadores IHC son específicos al 100%. Por lo tanto, los patólogos suelen utilizar un panel de Marcadores IHC. Varios estudios han demostrado precisiones del 66%-88% utilizando de cuatro a 14 Marcadores IHC. Brown et al. (1997) ; DeYoung et al. (2000) ; y Dennis et al. (2005a) . Las pruebas diagnósticas más caras incluyen métodos de formación de imágenes tales como la radiografía de tórax, la tomografía computarizada (CT) y la tomografía de emisión de positrones (PET) . Cada uno de estos métodos puede identificar el primario en un 30% a 50% de los casos. Ghosh et al. (2005) ; y Pavlidis et al. (2003) . A pesar de estas sofisticadas tecnologías, la capacidad para resolver los casos de CUP es sólo del 20%-30% ante mortem. Pavlidis et al. (2003) ; y Varadhachar y et al. (2004) .

Un nuevo enfoque prometedor reside en la capacidad de determinar perfiles de expresión génica de todo el genoma para identificar el origen de los tumores. Ma et al. (2006) ; Dennis et al. (2005b) ; Su et al. (2001) ; Ramaswamy et al. (2001) ; Bloom et al. (2004) ; Giordano et al. (2001) ; y el documento 20060094035. Estos estudios demostraron la viabilidad de la identificación del tejido de origen en base al perfil de expresión génica. Para que estas tecnologías de determinación de perfiles de expresión sean útiles en la práctica clínica, deben superarse dos obstáculos principales. En primer lugar, puesto que la determinación de perfiles de expresión génica se lleva a cabo totalmente en tejidos primarios, los marcadores génicos candidatos deben validarse en los tejidos metastásicos para confirmar que su expresión específica de tejido se conserva en la metástasis. En segundo lugar, la tecnología de determinación de perfiles de expresión génica debe ser capaz de utilizar tejido fijado en formalina e incluido en parafina (FFPE) , ya que las muestras de tejidos fijados son el material convencional en la práctica actual. La fijación en formalina da como resultado la degradación del ARN (Lewis et al. (2001) ; y Masuda et al. (1999) ) por lo que los protocolos de micromatrices existentes no funcionarán con la misma fiabilidad. Bibikova et al. (2004) . Además, la tecnología de determinación de perfiles debe ser robusta, reproducible y fácilmente accesible.

Se ha demostrado que la RTPCR cuantitativa (qRTPCR) genera resultados fiables a partir de tejido FFPE. Abrahamsen et al. (2003) ; Specht et al. (2001) ; Godfrey et al. (2000) ; y Cronin et al. (2004) . Por lo tanto, un enfoque más práctico sería utilizar un método pangenómico como herramienta de descubrimiento y desarrollar un ensayo de diagnóstico en base a una tecnología más robusta. Ramaswamy (2004) . Sin embargo, este paradigma requiere un conjunto de genes más pequeño para su desarrollo. Oien y colaboradores utilizaron el análisis en serie de la expresión génica (SAGE) para identificar 61 Marcadores tumorales a partir de los que desarrollaron un método RTPCR en base a once genes para cinco tipos de tumores. Dennis et al. (2002) . Otro estudio que acoplaba SAGE y qRTPCR desarrolló un panel de cinco genes para cuatro tipos de tumores y consiguió una exactitud del 81%. Buckhaults et al. (2003) . Un estudio más reciente acoplaba la determinación de perfiles mediante micromatrices con qRTPCR, pero utilizaba 79 Marcadores. Tothill et al. (2005) .

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un método de identificación del origen de una metástasis de origen desconocido como se define en las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las figuras 1-2 representan los métodos de la técnica anterior de identificación del origen de una metástasis de origen desconocido.

La figura 3 representa el presente algoritmo de diagnóstico de CUP.

La figura 4 representa los datos de micromatriz que muestran las intensidades de dos genes en un panel de tejidos. (A) Antígeno de células madre de próstata (PSCA) . (B) Factor de coagulación V (F5) . Los gráficos de barras muestran la intensidad en el eje Y, y el tejido en el eje X. Panc Ca, cáncer de páncreas; Panc N, páncreas normal. La figura 5 representa los electroferogramas obtenidos a partir de un Agilent Bioanalyzer. Se aisló el ARN a partir de tejido FFPE mediante digestión con proteinasa K durante tres horas (A) o dieciséis horas (B) . La muestra C22 (rojo) era un bloque de un año, mientras que la muestra C23 (azul) era un bloque de cinco años. En verde se muestra un marcador de tamaño. La figura 6 representa una comparación de los valores de Ct obtenidos a partir de tres métodos de qRTPCR diferentes: cebado con hexámeros aleatorios en la transcripción inversa seguido de qPCR con el ADNc resultante (etapa RH 2) , cebado específico de gen (cebador inverso) en la transcripción inversa seguido de qPCR con el ADNc resultante (etapa SPG 2) o cebado específico de gen y qRTPCR en una reacción de una sola etapa (etapa GSP 1) . Se dividió ARN de once muestras en los tres métodos y se midieron los niveles de ARN de tres genes: β-actina (A) , HUMSPB (B) y TTF (C) . La mediana del valor de Ct obtenida con cada método se indica mediante la línea continua. La figura 7 representa los diagramas de placas del ensayo de CUP. La figura 8 es una serie de gráficos que representan el rendimiento del ensayo a lo largo de un intervalo de concentraciones de ARN. La figura 9 es un diagrama de flujo de trabajo experimental: designación y validación de Marcadores candidatos (9A) ; y optimización del ensayo y construcción y ensayo del algoritmo de predicción (9B) . La figura 10 representa la expresión de 10 Marcadores génicos candidatos específicos de tejido seleccionados en adenocarcinoma primario de próstata y carcinomas metastásicos FFPE. Para cada gráfico el eje X representa el valor de expresión de Marcador normalizado. La figura 11 representa la optimización del ensayo. (A y B) Electroferogramas obtenidos de un Agilent Bioanalyzer. Se aisló el ARN a partir de tejido FFPE mediante digestión con proteinasa K durante tres horas (A) o dieciséis horas (B) . La muestra C22 (rojo) era un bloque de un año, mientras que la muestra C23 (azul) era un bloque de cinco años. En verde se muestra un marcador de tamaño. (C y D) Comparación de los valores de Ct obtenidos a partir de tres métodos de qRTPCR diferentes: cebado con hexámeros aleatorios en la transcripción inversa seguido de qPCR con el ADNc resultante (etapa RH 2) , cebado específico de gen (cebador inverso) en la transcripción inversa seguido de qPCR con el ADNc resultante (etapa SPG 2) o cebado específico de gen y qRTPCR en una reacción de una sola etapa (GSP 1 etapa) . Se dividió ARN de once muestras en los tres métodos y se midieron los niveles de ARN para dos genes: β-actina (C) , HUMSPB (D) . La mediana del valor de Ct obtenida con cada método se indica mediante la línea continua. La figura 12 es un mapa de calor que muestra los niveles relativos de expresión del panel de 10 Marcadores en 239 muestras. El color rojo indica mayor expresión.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La identificación del sito primario en pacientes con carcinoma metastásico de origen primario desconocido (CUP) puede permitir la aplicación de regímenes terapéuticos específicos y puede prolongar la supervivencia. Se validaron Marcadores candidatos mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) en 205 carcinomas metastásicos FFPE procedentes de estos seis tejidos, así como metástasis... [Seguir leyendo]

1. Método de identificación del origen de una metástasis de origen desconocido que comprende las etapas de

a. medir los Biomarcadores asociados con tres carcinomas diferentes en una muestra que contiene células metastásicas, en el que los Biomarcadores son los niveles de expresión de genes Marcadores y en el que los genes Marcadores están seleccionados de entre:

i. SP-B, TTF y DSG3, que son marcadores para el cáncer de pulmón;

ii. F5 y PSCA, que son marcadores para el cáncer de páncreas; y

iii. CDH17, que es un marcador para el cáncer de colon;

b. combinar los datos de los Biomarcadores en un algoritmo en el que el algoritmo

i. normaliza los Biomarcadores frente a una referencia; e

ii. impone un punto de corte que optimiza la sensibilidad y la especificidad de cada Biomarcador, pondera la prevalencia de los carcinomas y selecciona un tejido de origen;

c. determinar el origen en base a la probabilidad más alta determinada por el algoritmo o determinar que el carcinoma no se deriva de un conjunto concreto de carcinomas; y

d. opcionalmente medir los Biomarcadores específicos para uno o más carcinomas diferentes adicionales, y repetir las etapas c) y d) para los Biomarcadores adicionales;

2. Método según la reivindicación 1 en el que la expresión génica se mide utilizando al menos una de las SEQ ID NO: 11-54 .

5. 58.

3. Método según la reivindicación 1, que comprende adicionalmente obtener información clínica adicional, incluido el sitio de metástasis, para determinar el origen del carcinoma.

4. Método según la reivindicación 1 que comprende adicionalmente medir la expresión de al menos un gen expresado constitutivamente en la muestra.

5. Método de orientación para el tratamiento determinando el origen de una metástasis de origen desconocido según la reivindicación 1 e identificando el tratamiento apropiado para ello.

6. Método para proporcionar un pronóstico determinando el origen de una metástasis de origen desconocido, según la reivindicación 1 e identificando el correspondiente pronóstico para ello.

7. Uso de una composición que comprende al menos una secuencia aislada seleccionada de entre las SEQ ID NO: 11-54 .

5. 58 en el método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. Uso de un kit que comprende ARN o ADNc que hibrida con los genes marcadores según la reivindicación 1 en un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

9. Uso de una micromatriz o matriz génica para llevar a cabo el método según la reivindicación 1.