Método de selección de agentes que mejoran la piel seca asociada con la dermatitis atópica empleando la actividad de bleomicina hidrolasa como medida.

Un método in vitro para seleccionar y evaluar mejoradores de la piel seca causada por la dermatitis atópica que se lleva a cabo en células cultivadas,

que comprende: evaluar un fármaco candidato como un mejorador de la piel seca causada por la dermatitis atópica en el caso de que el fármaco candidato aumente significativamente la expresión y/o la actividad de la bleomicina hidrolasa en comparación con un fármaco de control, donde la expresión y/o la actividad de la bleomicina hidrolasa se considera que ha aumentado significativamente en el caso de que la actividad de la transcripción de un gen que codifica la bleomicina hidrolasa ha aumentado significativamente en comparación con la de un control, y donde la actividad de la transcripción se considera que ha aumentado significativamente en el caso de que la actividad de unión de los factores de transcripción MZF-1, Sp-1 y/o GATA-1 a la región reguladora de la transcripción de un gen que codifica la bleomicina hidrolasa ha aumentado significativamente en comparación con la de un control.

Método de selección de agentes que mejoran la piel seca asociada con la dermatitis atópica empleando la actividad de bleomicina hidrolasa como medida

Campo técnico

La presente invención proporciona un método para seleccionar y evaluar mejoradores de piel seca, y concretamente la piel seca causada por dermatitis atópica, y un método ex vivo para el diagnóstico de la piel seca causada por dermatitis atópica.

Antecedentes de la técnica

Las fibras de queratina presentes en la capa granular de la epidermis se agregan mediante la unión a una protema denominada como filagrina durante la queratinización y producen una morfología característica denominada "patrón de queratina". Aunque una sustancia precursora de la filagrina conocida como profilagrina (que consiste en una estructura de 1 a 12 unidades de filagrina) está presente en grandes cantidades en los gránulos de queratohialina dentro de las células granulares, junto con la formación de monómeros de filagrina, las fibras de queratina se agregan por desfosforilación durante la queratinización. Posteriormente, las fibras de queratina agregadas se someten a desiminación por la acción de una enzima conocida como peptidil arginina desiminasa (PAD), se liberan como queratina, y posteriormente se descomponen a aminoácidos y similares en la capa superior de la capa córnea. Estos aminoácidos se denominan factores humectantes naturales (NMF), juegan un papel importante en el mantenimiento del contenido de humedad de la capa córnea, y se sabe que poseen la capacidad de absorber la luz ultravioleta (Blank, I.H., J.l. Dermatol., 18, 433 (1952); Blank, I.H., J.l. Dermatol., 21, 259 (1953)).

Desde que se determinó que los aminoácidos que funcionan como el componente principal de NMF tenían su origen en la filagrina, se ha realizado la investigación sobre la correlación entre los estados de enfermedad que presentan la piel seca y la filagrina. Se ha determinado recientemente que los niveles de aminoácidos en la capa córnea disminuyen en la piel seca asociada a condiciones tales como la xerosis senil o enfermedades atópicas (Horii, I. et al., Br. J. Dermatol., 121, 587-592(1989); Tanaka, M. etal, BrJ Dermatol, 139, 618-621 (1989)).

La PAD desimina la filagrina actuando sobre los residuos de arginina, y los convierte en residuos de citrulina. Como resultado de esta forma de desiminación de la filagrina, la afinidad entre la filagrina y las fibras de queratina se debilita y las fibras de queratina son liberadas, y como resultado de ello, la filagrina se vuelve susceptible a la acción de proteasas, y esto se cree que en última instancia conduce a su descomposición a NMF.

El inventor de la presente invención identificó la calpaína 1 como una enzima que descompone la filagrina desiminada por PAD, y determinó que los productos de descomposición de la misma en forma de pequeños fragmentos peptídicos se descomponen en unidades de aminoácidos, es decir NMF, por la bleomicina hidrolasa (BH) (Journal of Investigative Dermatology (28), Volume 128, Abstraéis, S9, 539; Joint Conference of the 3th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan and 8th Annual Scientific Meeting of the Japanese Biochemical Society, Collection of Abstracts, p. 583; Journal of Biological Chemistry, 284, No. 19, pp. 12829-12836, 29, 3P-251; and, Japanese Patent Application No. 28-135944 (to be referred to as JP944). Además, ya que tanto la expresión de BH como la actividad de BH están reducidas en la piel lesionada con dermatitis atópica comparada con piel norma, se sugirió que la regulación de BH es importante para la diferenciación terminal de queratinocitos y que un defecto en la ruta de degradación de la filagrina está asociado con la patogénesis de la dermatitis atópica (Kamata, Y. et al., J. Dermatol. ScL, 56, JSID Abstracts, e17 (29)).

Más recientemente, se sabe que algunas dermatitis atópicas están causadas por una anomalía genética del gen de la profilagrina, y esta anomalía genética se observa en aproximadamente del 5% al 5% de los pacientes con dermatitis atópica (Smith, F.J.D., et al., Nat. Genet. 38: 337-342 (26): Aileen Sandilands, et al., J.l. Dermatol., 127, 1282-1284 (27); and, Nomura, T. et al., J.l. Dermatol., 128(6): 1436-41 (28)). Sin embargo, la piel de pacientes con dermatitis atópica no está necesariamente asociada a una disminución dramática en la expresión de la filagrina.

Documentos de la técnica anterior

Documentos no patentes

Documento no patente 1: Blank, I.H., J.l. Dermatol., 18, 433 (1952)

Documento no patente 2: Blank, I.H., J.l. Dermatol., 21, 259 (1953)

Documento no patente 3: Horii, I. et al., Br. J. Dermatol., 121, 587-592 (1989)

Documento no patente 4: Tanaka, M. etal., Br. J. Dermatol., 139, 618-621 (1989)

Documento no patente 5: Kamata, et al., J. Biochem., 141, 69-76 (27)

Documento no patente 6: Journal of Investigative Dermatology (28), Volume 128, Abstracts, S9, 539

Documento no patente 7: Joint Conference of the 3th Annual Meeting ofthe Molecular Biology Soclety of Japan and 8th Annual Scientific Meeting ofthe Japanese Blochemical Soclety, Collection of Abstraéis, p. 583, 3P-251

Documento no patente 8: Journal of Biological Chemistry, 284, No. 19, pp. 12829-12836, 29

Documento no patente 9: Kamata, Y. et al., Journal of Dermatological Science, 56, JSID Abstracts, e17 (29)

Documento no patente 1: Smith, F.J.D. et al., Nat. Genet. 38: 337-42 (26)

Documento no patente 11: Aileen Sandilands, et al., J.l. Dermatol., 127, 1282-1284 (27)

Documento no patente 12: Nomura, T. et al., Journal of Investigative Dermatology, 128, 1436-41 (28)

Compendio de la invención

Problemas a resolver por la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para seleccionar fármacos que mejoran o previenen la piel seca causada por la dermatitis atópica basado en un nuevo mecanismo de la aparición de piel áspera atribuible a las fluctuaciones en la expresión de una enzima productora de NMF, y un método para el diagnóstico de la piel seca causada por la dermatitis atópica.

Medios para resolver los problemas

En la citada JP944, los inventores de la presente invención determinan que el aumento de la actividad de bleomicina hidrolasa mejora la función de barrera de la piel mediante la producción de NMF. De esta manera, se cree que la bleomicina hidrolasa actúa en la etapa final de la producción de NMF. Sin embargo, es interesante observar con respecto a la piel seca debida a la dermatitis atópica que, ya que la expresión de la filagrina continúa observándose en numerosos pacientes de dermatitis atópica, se prevé que este fenómeno esté causado por otra anomalía al gen de la filagrina.

Basándose en la hipótesis de que la disminución de la expresión de bleomicina hidrolasa en la piel humana no sólo está relacionada con una disminución de la función barrera de la piel debido a una anomalía en el mecanismo por el cual se producen NMF, sino también con la dermatitis atópica causada principalmente por un trastorno inmune o la piel seca y similares causados por la dermatitis atópica, los inventores de la presente invención verificaron fluctuaciones en la expresión de esta enzima mediante la realización de pruebas en piel seca en seres humanos y analizaron el mecanismo por el cual se controla su expresión. Como resultado, los inventores de la presente invención encontraron que la disminución de la expresión de bleomicina hidrolasa está relacionada con la piel seca causada por dermatitis atópica, y que una región de control que induce claramente la expresión de la enzima está presente en la región flanqueante 5' de un gen que codifica esa enzima. Más específicamente, los inventores de la presente invención clonaron la región flanqueante 5' de BH. Se identificó una región importante para la actividad del promotor de BH 216 pb aguas arriba en un análisis de deleción del mismo. Un ensayo de cambio de la movilidad electroforética demostró claramente que MZF-1, Sp-1 y factor regulador de ¡nterferón (IRF) -1/2 son capaces de unirse a esta región in vitro. Por otra parte, la actividad del promotor de BH disminuyó considerablemente cuando se indujo una mutación dirigida en los motivos MZF-1 y Sp-1. Estos datos sugirieron que la expresión de BH se regula al alta mediante MZF-1 y Sp-1. Es interesante observar que la citoquina Th1, el interferón (IFN) -y disminuyen significativamente la expresión de BH. El efecto inhibidor de IFN-y sobre la expresión de BH se demostró en un análisis utilizando mutagénesis dirigida y ARN pequeño de interferencia. Aunque la citoquina Th2, IL-4, no demostraron acción directa alguna sobre la expresión de BH,... [Seguir leyendo]

1. Un método ¡n vitro para seleccionar y evaluar mejoradores de la piel seca causada por la dermatitis atóplca que se lleva a cabo en células cultivadas, que comprende: evaluar un fármaco candidato como un mejorador de la piel seca causada por la dermatitis atópica en el caso de que el fármaco candidato aumente significativamente la expresión

y/o la actividad de la bleomicina hidrolasa en comparación con un fármaco de control, donde la expresión y/o la actividad de la bleomicina hidrolasa se considera que ha aumentado significativamente en el caso de que la actividad de la transcripción de un gen que codifica la bleomicina hidrolasa ha aumentado significativamente en comparación con la de un control, y donde la actividad de la transcripción se considera que ha aumentado significativamente en el caso de que la actividad de unión de los factores de transcripción MZF-1, Sp-1 y/o GATA-1 a 1 la reglón reguladora de la transcripción de un gen que codifica la bleomicina hidrolasa ha aumentado significativamente en comparación con la de un control.

2. Un método ex vivo para diagnosticar la predisposición a la piel seca causada por la dermatitis atópica, que comprende determinar una tendencia a la piel seca causada por la dermatitis atópica en caso de que la expresión y/o la actividad de la bleomicina hidrolasa en el tejido de la piel disminuya significativamente en comparación con la

de la piel de control, al tiempo que se determina la ausencia de una tendencia a la piel seca causada por la dermatitis atópica si esta es igual o mayor que la de la piel de control, de manera que se considera que la expresión y/o la actividad ha disminuido significativamente en el caso de que la actividad de la transcripción de un gen que codifica la bleomicina hidrolasa ha disminuido significativamente en comparación con la de un control, y de tal manera que la actividad de la transcripción se considera que ha disminuido significativamente en el caso de que la 2 actividad de unión de los factores de transcripción MZF-1, Sp-1 y/o GATA-1 a la región reguladora de la transcripción de un gen que codifica la bleomicina hidrolasa ha disminuido significativamente en comparación con la de un control.