Método de recuperación y enriquecimiento de uranio mediante bioacumulación en microalgas mejoradas genéticamente.

La presente invención se refiere a un método de recuperación de U y un método de enriquecimiento de U mediante bioacumulación en microalgas mejoradas genéticamente.

Para obtener estas microalgas mejoradas, la invención incluye un método de mejora genética por selección artificial mediante el cual se ha obtenido la cepa Chlaf SCEP de Chlamydomonas fonticola. Esta cepa concentra en su interior, mediante bioacumulación activa, el uranio captado del exterior, en forma de precipitados metálicos que representan el 3% de la biomasa seca del alga. Además, produce un fraccionamiento isotópico de **IMAGEN** que puede aplicarse en sucesivos pasos para aumentar el enriquecimiento en 235U. La invención también incluye el uso de estas microalgas en la recuperación de uranio disuelto produciendo un fraccionamiento isotópico que puede utilizarse para conseguir uranio enriquecido de uso industrial, así como en su utilización en bio-remediación de aguas y/o suelos contaminados con uranio (en minería, depósitos de residuos radioactivos, piscinas de apagamiento -radioactive decay-, accidentes nucleares, vertidos, etc.).

Método de recuperación y enriquecimiento de uranio mediante bioacumulación en microalgas mejoradas genéticamente.

Campo técnico de la invención La invención se encuadra en el sector de la biotecnología aplicada al tratamiento de la contaminación ambiental y más concretamente a la biorremediación de uranio, incluyendo el enriquecimiento de uranio, mediante la bioacumulación en microalgas mejoradas genéticamente por medio de un método de selección artificial.

Estado de la técnica El uranio es un elemento muy contaminante, extremadamente dañino -tanto por su actividad radioactiva como por su elevada toxicidad como metal pesado (Achr y a et al. (2012) Bioresource Technology 116: 290-294) -, que se introduce en los ecosistemas naturales a través de actividades humanas (explotaciones mineras, producción de energía nuclear y actividades militares) , las cuales han generado una ingente cantidad de residuos. Debido a su capacidad de formar compuestos que se disuelven y dispersan en el agua, este elemento se incorpora fácilmente a la cadena trófica, lo que ha llevado al uranio a estar en los primeros puestos en la escala de contaminantes antropogénicos.

Consecuentemente, se ha hecho un gran esfuerzo para lograr procesos que permitan la remediación de los numerosos problemas ambientales causados por el uranio. En este sentido, existen numerosos abordajes tecnológicos clásicos, basados en métodos fisicoquímicos y de ingeniería (básicamente métodos químicos directos, tratamientos electro-químicos y métodos de intercambio iónico y adsorción; revisados por Kalin et al. (Kalin et al. (2005) Journal of Environmental Radioactivity78: 151-177) .

Las tecnologías emergentes basadas en el secuestro del uranio empleando microorganismos, son muy prometedoras pues resultan auto-sostenibles, respetuosas con el medio ambiente y de bajo coste. En este sentido diversos estudios se han enfocado hacia la captación del uranio empleando cianobacterias y microalgas (p.e. Sakaguchi et al. (1978) J. Ferment. Tech. 56, 561-565; Fortin et al. (2004) Environ. Toxicol. Chem. 23, 974-981; Fortin et al. (2007) Environ. Toxicol. Chem. 26, 242-248; Achar y a et al. (2009) Bioresource Technology 100: 2176-2181; Achr y a et al. (2012) Bioresource Technology 116: 290-294) . Pronto se demostró que la captación de uranio por microalgas era un proceso fisicoquímico independiente de su metabolismo, que se basaba solo en la adsorción del uranio a la superficie celular, para el cual las microalgas no tenían que estar vivas. (Horikoshi et al. (1979) Agricultural and Biological Chemistr y 43, 617-623) . Así el uranio puede ser eliminado parcialmente del medio utilizando simplemente biomasa microalgal aunque esté muerta (Kalin et al. (2005) Journal of Environmental Radioactivity 78: 151-177; Cecal et al. (2012) Bioresource Technology 118: 19-23) . Pero más recientemente se encontró otro proceso de captación activa de uranio por parte de microalgas, un proceso de bioacumulación que se basa en la actividad metabólica de microalgas vivas (Vogel et al. (2010) Science of the Total Environment 409: 384-395) .

Así los dos procesos biológicos que posibilitan la concentración y recuperación del uranio son la bio-adsorción y la bio-acumulación:

O La bioadsorción supone la unión del uranio a distintos grupos funcionales que se encuentran en las paredes celulares de la mayoría de las plantas, algas y microrganismos. Básicamente estas paredes están compuestas por polisacáridos y carbohidratos que presentan grupos cargados negativamente. Las cargas negativas pueden unir electrostáticamente formas catiónicas del uranio. Asimismo, el uranio también puede ser adsorbido extracelularmente a través de ligandos de tipo inorgánico. Los fenómenos de adsorción son fenómenos superficiales en los que se ve involucrada la pared celular, pudiéndose dar tanto con organismos vivos como con organismos muertos. Con frecuencia se propone la utilización de la biomasa muerta. O La bio-acumulación o bio-concentración implica la captación y transporte del uranio al interior de la célula donde se concentra en vacuolas y otros compartimentos celulares o es precipitado. Este mecanismo requiere que los organismos estén vivos.

Desde hace 50 años se utilizan organismos para combatir la contaminación (bioremediación) (revisado por Saunders et al. (2012) Plos One 7 (5) : e36470) , probándose distintos tipos de biomasa (plantas, bacterias, hongos (revisado por Ghosh and Smith, (2005) As. J. Energy Env. 6 (04) : 214-231; Wang and Chen, (2006) Biotechnology advances 24 (5) : 427-451) . También se aprovecha la bioflora autóctona de lugares contaminados en los que los organismos ya están adaptados a la contaminación (p.e. Vrionis et al. (2005) Applied and Environmental Microbiology 71 (1 O) : 6308-6318) .

De manera más específica se ha estudiado la utilidad de algunas especies de microalgas tanto en la bioadsorción de uranio como en su bioacumulación (Achar y a et al. (2009) Bioresource Technology 100: 2176-2181; Achr y a et al. (2012) Bioresource Technology 116: 290-294; Vogel et al. (2010) Science of the Total Environment 409: 384-395) . Incluso ha habido algunos intentos de fraccionamiento isotópico mediante bacterias acoplado a reacciones químicas de reducción del hierro (Rademarker et al. (2006) Environ. Sci. Technol. 40: 69433948) .

En cualquier caso, se ha intentado por un lado, ligar el U a la superficie de un microorganismo o confinarlo en su interior, para conseguir su eliminación del medio y su posterior recuperación y tratamiento. Aún así, todavía no se ha encontrado un método plenamente satisfactorio en cuanto a numerosos factores, como son la eficiencia, la sencillez, la capacidad de crecimiento exponencial en las condiciones ambientales que determinan las elevadas acumulaciones de residuos de U o la facilidad de recuperación de los microorganismos que secuestran el uranio.

Exposición de la invención La presente invención se refiere a un método de recuperación de uranio disuelto en aguas y/o sólidos, que se basa en la actividad biológica de microalgas obtenidas mediante un nuevo proceso de mejora genética basado en la selección artificial de mutantes que aparecen en líneas mantenidas por reproducción asexual, a consecuencia del cual los clones seleccionados acumulan en su interior (en forma de precipitados sólidos metálicos) el uranio que captan del medio ambiente. La invención también se refiere a la utilización del método de recuperación de uranio en bio-remediación de aguas y/o suelos contaminados con uranio en minería, depósitos de residuos radioactivos, piscinas de apagamiento (radioactive decay) , accidentes nucleares, vertidos y demás aplicaciones en el sector del uranio. Por otro lado, las microalgas obtenidas según el método de mejora genética de la invención, además de la recuperación de uranio, también producen fraccionamiento isotópico enriqueciendo la relación 235U /238U.

Un primer aspecto de la invención se refiere a un método para seleccionar microalgas capaces de acumular activamente uranio en su interior en las condiciones ambientales en que este elemento se encuentra habitualmente en las zonas mineras y de acumulación de residuos de U procedentes de centrales nucleares, actividades militares o industriales.

El método de mejora genética por selección artificial de microalgas capaces de acumular activamente uranio incluye: a) la toma de muestras de aguas o suelos contaminados con U, b) el aislamiento de cepas de microalga a partir de estas muestras, c) las transferencias seriadas de las cepas aisladas en el paso anterior a un medio que contiene cantidades crecientes de uranio, cantidades crecientes de otros metales pesados, valores decrecientes de pH y valores variables de temperatura, seleccionando para la transferencia a la siguiente generación sólo aquellas microalgas que sedimenten más rápidamente.

Para la toma de muestras se puede recurrir a cualquier espacio (aguas, suelos) con altas concentraciones de uranio, por ejemplo: zonas mineras de uranio, zonas de acumulación de residuos de uranio procedentes de centrales nucleares, de actividades militares o de actividades industriales, piscinas de apagamiento, etc.

El aislamiento de las cepas de microalgas contenidas en las muestra se realiza mediante cualquier método conocido por el experto en la materia. A título de ejemplo, se pueden realizar diluciones sucesivas en placas multiensayo, tal y como se esquematiza en la figura 1. El aislamiento final de cada uno de los clones se realiza cogiendo una sola célula con una micropipeta.

Para conseguir la mejora genética en la capacidad de bioacumular uranio se realizan transferencias seriadas, periódicamente, cada 7 o 14...

1. Método de mejora genética por selección artificial de microalgas capaces de acumular activamente uranio en su interior que incluye: a) la toma de muestras de aguas o suelos contaminados con U, b) el aislamiento de cepas de microalga a partir de estas muestras, c) transferencias seriadas de las cepas aisladas en el paso b) a un medio que contiene cantidades crecientes de uranio, cantidades crecientes de otros metales pesados seleccionados entre el grupo formado por Ar, Sn, Pb, Cr, Cu y/o Zn, valores decrecientes de pH y valores variables de temperatura entre los 1 y 47º C, seleccionando para la transferencia a la siguiente generación sólo aquellas microalgas que sedimenten a velocidades iguales o superiores a 35 cm/h.

2. Método según la reivindicación 1 que incluye un paso d) de iluminación de la parte superior del recipiente en el que se realizan las transferencias seriadas y oscurecimiento de la parte inferior de dicho recipiente, en el que los pasos c) y d) son simultáneos.

3. Microalga capaz de acumular activamente uranio obtenible mediante el método de las reivindicaciones 1-2.

4. Microalga según la reivindicación 3 que pertenece a la especie Chlamydomonas fonticola Sravez.

5. Cultivo biológicamente puro de Chlamydomonas fonticola SEA 004-12.

6. Método de recuperación de U a partir de aguas y/o sólidos contaminados que incluye los siguientes pasos: a) solubilización del U existente en los sólidos contaminados, b) adición de medio de enriquecimiento para microalgas a la solución acuosa contaminada con U, c) mantenimiento de la temperatura de la solución acuosa entre 1 y 47º C, d) inoculación de microalgas definidas en cualquiera de las reivindicaciones 3-5,

e) sedimentación de las microalgas, f) separación de las microalgas de la solución acuosa enriquecida, g) lavado de las microalgas del paso f) con HCI 0, 1-1 M, o bien calcinación de la biomasa, en el que el paso a) sólo se realiza cuando se parte de materiales sólidos contaminados con U.

7. Método según la reivindicación 6 en que la temperatura del paso c) es de 20º C.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 6-7 que incluye un paso h) de iluminación de la parte superior del recipiente en el que se inoculan las microalgas y oscurecimiento de la parte inferior de dicho recipiente, que se mantiene durante los pasos d) ye) .

9. Método de enriquecimiento de la relación 235U/238U para su uso industrial que incluye los siguientes pasos: a) solubilización del U que no esté en forma soluble, b) adición de medio de enriquecimiento para microalgas a la solución acuosa que contiene el U, c) mantenimiento de la temperatura entre 1 y 47º C, d) inoculación de microalgas definidas en cualquiera de las reivindicaciones 3-5, e) sedimentación de las microalgas, f) recuperación del U mediante lavado del cultivo con HCI, o bien mediante calcinación de la biomasa, g) disolución en una nueva solución acuosa del U recuperado en el paso f) , h) repetición de los pasos b) -g) hasta obtener el enriquecimiento deseado, momento en que el método se para en el paso f) , en el que el paso a) sólo se realiza cuando se parte de materiales sólidos con U.

10. Método según la reivindicación 9 en que la temperatura del paso c) es de 20º C.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9-10 que incluye un paso i) de iluminación de la parte superior del recipiente en el que se inoculan las microalgas y oscurecimiento de la parte inferior de dicho recipiente, que se mantiene durante los pasos d) ye) .

12. Uso de las microalgas definidas en cualquiera de las reivindicaciones 3-5 en biorremediación de aguas y/o suelos contaminados con uranio.

13. Uso de las microalgas definidas en cualquiera de las reivindicaciones 3-5 en

el enriquecimiento de la relación 235U/238U para obtener uranio enriquecido para 10 uso industrial.

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