Método de producción de factor VII libre de suero y libre de insulina.

Método para producir factor VII (FVII) humano recombinante, que comprende:

a) obtener una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) que expresa FVII humano recombinante; y

b) cultivar dicha célula CHO en medio libre de suero que carece de insulina,

en el que dicha célula CHO se prepara adaptando una línea celular CHO que expresa FVII humano recombinante modificada para el crecimiento en cultivo libre de suero para crecer en cultivo celular en ausencia de insulina mediante el cultivo en serie de dicha línea celular CHO en cantidades decrecientes de insulina para obtener una línea celular CHO que produce FVII que crece en ausencia de insulina, y en el que dicho cultivo en serie comprende pulsar pases sucesivos de células CHO con concentraciones decrecientes de insulina.

Método de producción de factor VII libre de suero y libre de insulina Antecedentes de la invención El principal papel de FVII es iniciar el proceso de coagulación junto con el factor tisular (TF) . El factor tisular se encuentra en el exterior de los vasos sanguíneos y no está expuesto normalmente al torrente sanguíneo. Tras la lesión de un vaso, el factor tisular se expone a la sangre y al factor VII circulante. Una vez unido a TF, FVII se activa para dar FVIIa por diferente proteasas, entre las que están trombina (factor IIa) , factor X activado y el propio complejo FVIIa-TF. Los sustratos más importantes para FVIIa-TF son el factor X y el factor IX. El factor VIIa que está presente en la circulación en una cantidad correspondiente a aproximadamente el 1% de la masa de proteína de factor VII total. El factor VII existe en plasma principalmente como un zimógeno monocatenario que se escinde por FXa en su forma activada bicatenaria, el factor VIIa.

El factor VII activado recombinante (rFVIIa) se ha desarrollado como agente prohemostático. La administración de rFVIIa ofrece una repuesta prohemostática rápida y sumamente eficaz en sujetos hemofílicos con hemorragias, que tienen limitado su tratamiento mediante otros factores de coagulación debido al desarrollo de anticuerpos. También puede tratarse de manera satisfactoria con rFVIIa la hemorragia en sujetos con deficiencia en el factor VII o sujetos que tienen un sistema de coagulación normal pero que experimentan una hemorragia excesiva.

La preparación de factores de coagulación sanguínea recombinantes está adquiriendo importancia. Por ejemplo, el factor VIIa, como otras proteínas de coagulación, está sometido a una variedad de modificaciones co-y postraduccionales, incluyendo, por ejemplo, glucosilacion unida a asparagina (unida a N) ; glucosilacion unida a O; y es preferible la -carboxilación de residuos de ácido glutámico para producir estas proteínas recombinantes en células de mamífero que son capaces de modificar las proteínas recombinantes de manera apropiada.

Esto es para permitir el crecimiento óptimo de células recombinantes; se ha realizado de manera tradicional el cultivo de células de mamífero en presencia de suero de animales o componentes derivados de animales tales como albúmina, transferrina, insulina, etc. No obstante, reconociendo que existe la necesidad de reducir el riesgo de contaminación y disminuir la variabilidad en el producto producido, se han desarrollado diversos métodos y composiciones para el uso de medio libre de suero para la preparación de factores de coagulación sanguínea recombinantes (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense 6.100.061 y los documentos US 2003/0203448A1 o US 2006/0094104A1) . El uso de tal medio en el procedimiento de preparación también permite una purificación más sencilla de las proteínas expresadas. En la mayor parte de los casos, en primer lugar se cultivan células recombinantes en medio que contiene suero hasta una alta densidad celular, por ejemplo para un banco de células de trabajo, y posteriormente se readaptan a medio libre de suero durante la fase de producción.

Zang et al. (Biotechnology (N Y) . abril de 1995; 13 (4) :389-92) citan la producción de las proteínas recombinantes activador de plasminógeno de tipo urocinasa (uPa) y una cadena ligera kappa de inmunoglobulina G (IgG) humanizada usando un medio de cultivo celular libre de proteínas.

Hunt et al. (Cytotechnology. Mayo de 1997; 24 (1) :55-64) citan células de ovario de hámster chino que contienen un gen heterólogo de IGF-I dirigido por el promotor de citomegalovirus y que crecen de manera autónoma en medio libre de suero.

El documento WO 02/29083 se refiere a métodos para cultivar células de mamífero y para producir proteínas recombinantes en cultivos a gran escala de tales células.

Métodos para el cultivo libre de suero han producido resultados variables y han requerido la adición de insulina para el crecimiento celular y la producción de proteínas del factor VII. Por tanto, existe la necesidad en la técnica de métodos para el cultivo de células de mamífero libre tanto de suero como de otros componentes derivados de animales e insulina para producir cantidades de proteínas de coagulación, particularmente factor VII humano recombinante o polipéptidos relacionados con el factor VII.

Breve sumario de la invención Según aspectos específicos, la presente invención se refiere a un método para producir factor VII (FVII) humano recombinante que comprende obtener una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) que expresa FVII humano recombinante; y cultivar la célula CHO en medio libre de suero que carece de insulina; tal como se define en las reivindicaciones. Específicamente, la producción del FVII en la célula CHO es comparable a la producción de FVII en presencia de insulina.

La célula CHO usada en el método de producción se prepara adaptando una línea celular CHO que expresa FVII humano recombinante modificada para el crecimiento en cultivo libre de suero para crecer en cultivo celular en ausencia de insulina mediante el cultivo en serie de la línea celular CHO en cantidades decrecientes de insulina para

obtener una línea celular CHO que produce FVII que crece en ausencia de insulina.

En realizaciones específicas, la línea celular CHO que expresa FVII humano recombinante modificada para el crecimiento en cultivo libre de suero es la línea celular 1E9, línea celular depositada con el número de registro n.º 08100801 ante la Colección Europea de Cultivos Celulares, Porton Down, R.U., el 8 de octubre de 2008.

En otras realizaciones, la línea celular CHO que produce FVII producida para crecer en ausencia de insulina es una línea celular 1E9 depositada con el número de registro n.º 08100802 ante la Colección Europea de Cultivos Celulares, Porton Down, R.U., el 8 de octubre de 2008.

El medio de cultivo celular usado en el método de producción comprende preferiblemente vitamina K1. Más particularmente, el medio es una formulación basada en DMEM/F12 de HAM libre de suero complementada con uno o más de los siguientes aditivos i) glutamina; concentración final de 0, 9 g/l, ii) sulfato férrico x7H2O 0, 0006 g/l, iv) putrescina, x 2HCl 0, 0036 g/l, vi) vitamina K1 0, 0025 g/l, vii) Synperonic; concentración final de 1 g/l, rojo de fenol 0, 008 g/l, etanolamina 0, 00153 g/l e hidrogenocarbonato de Na 2 g/l) .

Las células se preparan usando un método en el que el cultivo en serie comprende pulsar pases sucesivos de células CHO con concentraciones decrecientes de insulina. Se encontró que tal pulsación produce células viables mientras que hacer crecer dichas células en una cantidad de insulina sucesivamente menor sin el pulsado no produce células viables.

Una etapa a modo de ejemplo en el método de pulsado comprende hacer crecer una línea celular CHO hasta el día 14 en medio libre de suero convencional que contiene insulina y en el día 14 transferir la línea celular a un medio libre de suero y libre de insulina.

En un aspecto específico, las células se hacen crecer entonces en el medio libre de suero y libre de insulina durante de 1 a 3 días, preferiblemente un día y entonces se transfieren de nuevo a un medio que contiene insulina que comprende insulina 0, 2 mg/ml y se hacen crecer en el medio que contiene insulina durante de 1 a 3 días, preferiblemente 3 días. Posteriormente, tras el crecimiento durante de 1 a 3 días, pero preferiblemente, 3 días en medio que contiene insulina, la línea celular CHO se transfiere de nuevo a medio libre de suero y libre de insulina.

En realizaciones a modo de ejemplo, las células se hacen crecer entonces en un medio libre de suero y libre de insulina durante un periodo de tiempo adicional, preferiblemente un día y entonces se transfieren a un medio que contiene insulina que comprende insulina 0, 070 mg/ml y se hacen crecer en el medio que contiene insulina durante de 3 a 8 días, pero preferiblemente 8 días. Tras el crecimiento durante los de 3 a 8 días, pero preferiblemente 8 días en medio que contiene insulina, la línea celular CHO se transfiere a medio libre de suero y libre de insulina. El método implica entonces hacer crecer las células en un medio libre de suero y libre de insulina durante un día y entonces transferir las células a un medio que contiene insulina que comprende insulina 0, 030 mg/ml y hacer crecer la línea celular CHO en el medio que contiene insulina durante de 3 a 9 días, pero preferiblemente, 9 días. De nuevo, tras el crecimiento durante de 3 a 9 días, pero preferiblemente 9 días en medio que contiene insulina, la línea celular CHO se transfiere a medio libre de suero y libre de insulina. Esta línea celular... [Seguir leyendo]

1. Método para producir factor VII (FVII) humano recombinante, que comprende:

a) obtener una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) que expresa FVII humano recombinante; y b) cultivar dicha célula CHO en medio libre de suero que carece de insulina, en el que dicha célula CHO se prepara adaptando una línea celular CHO que expresa FVII humano recombinante modificada para el crecimiento en cultivo libre de suero para crecer en cultivo celular en ausencia de insulina mediante el cultivo en serie de dicha línea celular CHO en cantidades decrecientes de insulina para obtener una línea celular CHO que produce FVII que crece en ausencia de insulina, y en el que dicho cultivo en serie comprende pulsar pases sucesivos de células CHO con concentraciones 15 decrecientes de insulina.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha línea celular CHO que expresa FVII humano recombinante modificada para el crecimiento en cultivo libre de suero es la línea celular 1E9, línea celular depositada con el número de registro n.º 08100801 ante la Colección Europea de Cultivos Celulares, Porton Down, R.U., el 8 de octubre de 2008.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dicho medio de cultivo celular comprende vitamina K1.

4. Método según la reivindicación 1, en el que una etapa en el pulsado comprende hacer crecer una línea

celular CHO hasta el día 14 en medio libre de suero convencional que contiene insulina y en el día 14 transferir dicha línea celular a un medio libre de suero y libre de insulina.

5. Método según la reivindicación 4, que comprende entonces hacer crecer dichas células en un medio libre de suero y libre de insulina durante de 1 a 3 días y entonces transferir dichas células a un medio que contiene insulina que comprende insulina 0, 2 mg/ml y hacer crecer dicha línea celular CHO en dicho medio que contiene insulina durante de 1 a 3 días, y posteriormente, tras el crecimiento durante de 1 a 3 días en medio que contiene insulina, transferir dicha 35 línea celular CHO a medio libre de suero y libre de insulina.

6. Método según la reivindicación 5, que comprende entonces hacer crecer dichas células en un medio libre de suero y libre de insulina durante preferiblemente 1 día y entonces transferir dichas células a un medio que contiene insulina que comprende insulina 0, 070 mg/ml y hacer crecer dicha línea celular CHO en dicho medio que contiene insulina durante de 3 a 8 días, y, tras el crecimiento durante de 3 a 8 días en medio que contiene insulina, transferir dicha línea celular CHO 45 a medio libre de suero y libre de insulina.

7. Método según la reivindicación 6, que comprende entonces hacer crecer dichas células en un medio libre de suero y libre de insulina durante 1 día y entonces transferir dichas células a un medio que contiene insulina que comprende insulina 0, 030 mg/ml y hacer crecer dicha línea celular CHO en dicho medio que contiene insulina durante de 3 a 9 días, y tras el crecimiento durante de 3 a 9 días en medio que contiene insulina, transferir dicha línea celular CHO a medio libre de suero y libre de insulina.

8. Método según la reivindicación 7, que comprende entonces hacer crecer dichas células en un medio libre de suero y libre de insulina durante 1 día y entonces transferir dichas células a un medio que contiene insulina que comprende insulina 0, 016 mg/ml y hacer crecer dicha línea celular CHO en dicho medio que contiene insulina durante de 3 a 9 días, y entonces transferir dicha línea celular CHO a medio libre de suero y libre de insulina.

9. Método de adaptación de una línea celular que produce FVII que crece en medio libre de suero a una línea 65 celular que crece en medio libre de suero y libre de insulina, que comprende pulsar pases sucesivos de células CHO con concentraciones decrecientes de insulina, en el que dicho pulsado comprende a) hacer

crecer dicha línea celular durante de 1 a 9 días en medio que contiene insulina seguido por b) crecimiento en medio libre de suero y libre de insulina durante de 1 a 3 días y repetir las etapas a) y b) , en el que el medio en cada etapa a) sucesiva contiene aproximadamente la mitad de la concentración de insulina que en la etapa a) anterior hasta que el medio no contiene insulina detectable.

10. Método según la reivindicación 9, en el que dicho método comprende:

a) hacer crecer una línea celular CHO hasta el día 14 en medio libre de suero convencional que contiene insulina y en el día 14 transferir dicha línea celular a un medio libre de suero y libre de insulina;

b) hacer crecer dichas células de la etapa b) en un medio libre de suero y libre de insulina durante de 1 a 2 días y entonces transferir dichas células a un medio que contiene insulina que comprende insulina 0, 2 mg/ml y hacer crecer dicha línea celular CHO en dicho medio que contiene insulina durante de 1 a 3 días;

c) tras el crecimiento durante de 1 a 3 días en medio que contiene insulina de la etapa b) , transferir dicha línea celular CHO a medio libre de suero y libre de insulina;

d) hacer crecer dichas células de la etapa c) en un medio libre de suero y libre de insulina durante de 1 a 3 días y entonces transferir dichas células a un medio que contiene insulina que comprende insulina 0, 070 mg/ml y hacer crecer dicha línea celular CHO en dicho medio que contiene insulina durante de 3 a 8 días;

e) tras el crecimiento durante de 3 a 8 días en medio que contiene insulina en la etapa d) , transferir dicha 25 línea celular CHO a medio libre de suero y libre de insulina;

f) hacer crecer dichas células de la etapa e) en un medio libre de suero y libre de insulina durante de 1 a 2 días y entonces transferir dichas células a un medio que contiene insulina que comprende insulina 0, 030 mg/ml y hacer crecer dicha línea celular CHO en dicho medio que contiene insulina durante de 3 a 9 días;

g) tras el crecimiento durante de 3 a 9 días en medio que contiene insulina en la etapa f) , transferir dicha línea celular CHO a medio libre de suero y libre de insulina;

h) hacer crecer dichas células de la etapa g) en un medio libre de suero y libre de insulina durante de 1 a 2 días y entonces transferir dichas células a un medio que contiene insulina que comprende insulina 0, 016 mg/ml y hacer crecer dicha línea celular CHO en dicho medio que contiene insulina durante de 3 a 9 días; y i) tras el crecimiento durante de 3 a 9 días en medio que contiene insulina en la etapa h, transferir dicha línea celular CHO a medio libre de suero y libre de insulina, en el que las células en la etapa i) se adaptan para el crecimiento a largo plazo en medio libre de suero y libre de insulina.

11. Célula CHO que puede obtenerse mediante el método según la reivindicación 9 o la reivindicación 10. 45

12. Célula CHO según la reivindicación 11, en el que la célula CHO puede obtenerse mediante el método según la reivindicación 9, y en el que la célula CHO es una célula CHO recombinante que expresa FVII humano y se adapta para el crecimiento en un medio libre de insulina que carece de componentes derivados de animales.

13. Método para la producción a gran escala de un FVII o un polipéptido relacionado con FVII en células CHO, comprendiendo dicho método:

(a) inocular una célula CHO según la reivindicación 11 en un recipiente de cultivo que contiene medio libre 55 de suero y libre de insulina y propagar dicho cultivo de células de mamífero al menos hasta que las células alcancen una densidad predeterminada;

(b) transferir dicho cultivo simiente propagado a un recipiente de cultivo a gran escala que contiene medio libre de suero y libre de insulina;

(c) propagar dicho cultivo a gran escala en medio libre de suero y libre de insulina, al menos hasta que dichas células alcancen una densidad predeterminada;

(d) mantener el cultivo obtenido en la etapa (c) en medio libre de suero y libre de insulina, en condiciones 65 apropiadas para la expresión de FVII o la expresión de polipéptido relacionado con FVII; y

(e) recuperar el FVII o el polipéptido relacionado con FVII del cultivo mantenido.

14. Método según la reivindicación 13, que comprende además, antes de la etapa (b) , repetir la etapa (a)

usando recipientes de cultivo de simiente de tamaño progresivamente creciente. 5

15. Método según la reivindicación 13, que comprende además: mantener el cultivo obtenido en la etapa (c) en medio libre de suero y libre de insulina mediante la recogida regular del medio de cultivo y la sustitución por nuevo medio.

16. Método según la reivindicación 13, en el que el método se selecciona del grupo que consiste en:

A) procedimiento de microportadores;

B) un procedimiento en suspensión; y 15 C) un procedimiento de cultivo quimiostático.

17. Método según la reivindicación 16, en el que el método es un procedimiento de microportadores, y en el que el método es un procedimiento de portadores macroporosos.

18. Método según la reivindicación 16, en el que el método es un procedimiento de microportadores, y en el que el método se selecciona del grupo que consiste en:

A) un procedimiento de microportadores convencional; y 25 B) un procedimiento de perfusión de microportadores.

19. Método según la reivindicación 16, en el que el método es un procedimiento en suspensión, y en el que el método se selecciona del grupo que consiste en: A) un procedimiento de perfusión; y B) un procedimiento discontinuo/semicontinuo. 35 20. Método según la reivindicación 19, en el que el método es un procedimiento discontinuo/semicontinuo, y en el que el método se selecciona del grupo que consiste en: A) un procedimiento discontinuo sencillo;

B) un procedimiento alimentado por lotes; y C) un procedimiento semicontinuo.

21. Método según la reivindicación 13, en el que dichas células, antes de dicha etapa de inoculación, son 45 capaces de crecer en cultivo en suspensión.

22. Método según la reivindicación 13, en el que dicho FVII o polipéptido relacionado con FVII deseado es FVII humano o un polipéptido relacionado con FVII humano.

23. Método según la reivindicación 13, en el que se produce FVII o un polipéptido relacionado con FVII a un nivel de al menos aproximadamente 1 mg/l/día de cultivo; preferiblemente en el que se produce FVII o un polipéptido relacionado con FVII a un nivel de al menos aproximadamente 2, 5 mg/l/día de cultivo.

24. Método según la reivindicación 23, en el que se produce FVII o un polipéptido relacionado con FVII a un 55 nivel de al menos aproximadamente 5 mg/l/día de cultivo.

25. Método según la reivindicación 24, en el que se produce FVII o un polipéptido relacionado con FVII a un nivel de al menos aproximadamente 8 mg/l/día de cultivo.

26. Método según la reivindicación 24, en el que se produce FVII o un polipéptido relacionado con FVII a un nivel de aproximadamente 3-4 mg/l/día.

27. Método según la reivindicación 24, en el que las unidades de FVII o polipéptido relacionado con FVII producidas son al menos 5000 U/l/día, preferiblemente en el que las unidades de FVII o polipéptido

relacionado con FVII producidas son al menos 7000 U/l/día, más preferiblemente en el que las unidades de actividad de FVII o polipéptido relacionado con FVII producidas son aproximadamente 7000-10.000 U/l/día.

28. Método según la reivindicación 13, que comprende además: mantener el cultivo obtenido en la etapa (c) en medio libre de productos animales y libre de insulina mediante la recogida regular de parte del sobrenadante de cultivo tras la sedimentación de los portadores que contienen células y la sustitución por nuevo medio.

29. Método según la reivindicación 28, que comprende además: enfriar el cultivo hasta una temperatura predeterminada por debajo del punto de consigna del cultivo antes de la sedimentación de portadores, preferiblemente en el que el cultivo se enfría hasta una temperatura de desde 5ºC hasta 30ºC por debajo del punto de consigna de temperatura del cultivo antes de la sedimentación de portadores, preferiblemente en el que el cultivo se enfría hasta una temperatura de desde 5ºC hasta 20ºC por debajo del punto de consigna de temperatura del cultivo, preferiblemente en el que el cultivo se enfría hasta una temperatura de desde 5ºC hasta 15ºC por debajo del punto de consigna de temperatura del cultivo, preferiblemente en el que el cultivo se enfría hasta una temperatura de aproximadamente 10ºC por debajo del punto de consigna de temperatura del cultivo.

30. Método según la reivindicación 1, la reivindicación 9 o la reivindicación 13, en el que dicho medio es una formulación basada en DMEM/F12 de HAM libre de suero complementada con uno o más de los siguientes aditivos i) glutamina; concentración final de 0, 9 g/l, ii) sulfato férrico x7H2O 0, 0006 g/l, iv) putrescina, x 2HCl 0, 0036 g/l, vi) vitamina K1 0, 0025 g/l, vii) Synperonic; concentración final de 1 g/l, rojo de fenol 0, 008 g/l, etanolamina 0, 00153 g/l e hidrogenocarbonato de Na 2 g/l) .