Método de diagnóstico y pronóstico de melanoma cutáneo.

La presente invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar melanoma cutáneo y un método in vitro para diferenciar nevus benigno de melanoma en una lesión cutánea basados en determinar el nivel de expresión de un marcador seleccionado del grupo formado por BCL3,

PIR, PEBP1 y sus combinaciones. Adicionalmente, la invención se refiere a un método in vitro para determinar la probabilidad de metástasis en un sujeto diagnosticado con melanoma cutáneo basado en determinar el nivel de expresión de un marcador seleccionado del grupo formado por M-MITF, PIR, BCL2 y sus combinaciones.

Método de diagnóstico y pronóstico de melanoma cutáneo CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuadra, en general, dentro del campo de diagnóstico y pronóstico de enfermedades; en particular, con el diagnóstico y pronóstico de melanoma cutáneo y con el diagnóstico diferencial entre melanoma cutáneo y una lesión cutánea no tumoral.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El melanoma maligno representa la mayor causa de mortalidad asociada al cáncer de piel y su incidencia está incrementando en los últimos años, especialmente entre la población de raza blanca y piel clara, diagnosticándose en el mundo 160.000 nuevos casos al año.

Las alteraciones moleculares implicadas en la patogenia del melanoma maligno se encuentran en constante estudio, lo que ha permitido determinar alteraciones genéticas que afectan a genes reparadores del ADN, oncogenes y genes supresores de tumores, además de genes implicados en las rutas de pigmentación. Sin embargo, estos avances siguen siendo insuficientes para establecer marcadores biológicos y dianas moleculares que faciliten un diagnóstico precoz y permitan desarrollar terapias más eficaces frente a esta neoplasia.

Se conocen diversos marcadores tumorales de melanoma, entre ellos LDH sérica, 5- S-CD, S-100P y MIA (Garbe C. et al Cáncer. 2003 Apr 1;97(7): 1737-45). Sin embargo, ninguno de estos marcadores tumorales da resultados positivos a menos que el melanoma esté en fase muy avanzada, tal como el estadio IV.

El tumor primario de un melanoma maligno tiene un comportamiento biológico donde se distinguen dos fases de crecimiento. La primera fase se denomina de crecimiento radial (FCR), porque los melanocitos proliferan intraepidérmicamente. La FCR puede durar meses o años, hasta que el tumor adquiere la capacidad de invadir la dermis, comenzando así lo que se denomina la fase de crecimiento vertical (FCV). La FCV implica mal pronóstico, dado que la infiltración de las células neoplásicas a las capas

inferiores de la piel posibilita su diseminación a través de los vasos linfáticos a los ganglios linfáticos o, a través de los vasos sanguíneos a cualquier órgano donde las células tumorales pueden proliferar con éxito generando metástasis.

En la actualidad la posibilidad de curación del melanoma está estrechamente ligada a la precocidad del diagnóstico y extirpación quirúrgica del tumor. Así, en la actualidad, el pronóstico de la enfermedad se basa fundamentalmente en la evaluación histológica de las biopsias y el tamaño de las lesiones cutáneas. Aproximadamente el 70% de los pacientes con melanoma son diagnosticados en estadios tempranos de la enfermedad (estadios I y II según la clasificación AJCC AJCC; Melanoma Staging Database, 2008), y se les considera pacientes de "bajo riesgo" por su elevada probabilidad de curación mediante la cirugía. Sin embargo, para los casos de melanoma metastásico todavía no existen métodos diagnósticos ni terapias eficaces capaces de mejorar la supervivencia de los pacientes.

La probabilidad de supervivencia de los pacientes con melanoma se relaciona con la ausencia de afectación ganglionar y de metástasis. La prueba del ganglio centinela (que consiste en la detección de células tumorales en la cadena de nodulos linfáticos más próxima al tumor) se ha convertido en un poderoso marcador pronóstico para determinar la supervivencia de los pacientes con melanoma maligno cutáneo con lesiones de un tamaño entre 1 y 4 mm.

La mortalidad detectada en los estadios tempranos de la progresión tumoral puede deberse, a menos en parte, a que a los pacientes con lesiones menores de 1 mm no se les realiza la biopsia del ganglio centinela. Por otro lado, un resultado negativo en la biopsia del ganglio centinela no excluye de la posibilidad de desarrollar una metástasis. De hecho, aproximadamente un 10% de los pacientes con ganglio centinela negativo desarrollan metástasis

Los únicos marcadores pronósticos utilizados en clínica hasta la fecha son los recogidos en el sistema de estadificación de la AJCC (American Join Committee of Cáncer) que se basa en la clasificación TNM (Tumor, Ganglios linfáticos afectados y Metástasis).

En la actualidad, y a diferencia de otros tumores como el carcinoma de colón o el de mama y pulmón, no se ha demostrado ningún marcador molecular que sea de utilidad

en la práctica clínica ya que no permiten predecir el riesgo en estadios tempranos (AJCC estadio I a III).

Por tanto, existe la necesidad de desarrollar nuevos métodos de diagnóstico de melanoma y de métodos para determinar la probabilidad de que un sujeto con melanoma desarrolle metástasis, de manera que pueda aplicarse un tratamiento adicional a la extirpación quirúrgica del tumor, en caso de que las células tumorales hayan adquirido ya el fenotipo invasivo.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la invención se refiere a método in vitro para diagnosticar melanoma cutáneo que comprende:

a) determinar el nivel de expresión de un marcador seleccionado del grupo formado por BCL3, PIR, PEBP1 y sus combinaciones en una muestra de un sujeto, y

b) comparar el nivel obtenido en la etapa a) con un valor de referencia para dicho marcador,

en donde un nivel de expresión aumentado de BCL3 y/o un nivel de expresión disminuido de PIR y/o PEBP1 con respecto al valor de referencia para dicho marcador es indicativo de que dicho sujeto padece un melanoma cutáneo.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para determinar la probabilidad de metástasis en un sujeto diagnosticado con melanoma cutáneo que comprende:

a) determinar el nivel de expresión de un marcador seleccionado del grupo formado por M-MITF, PIR, BCL2 y sus combinaciones en una muestra obtenida de un sujeto, y

b) comparar el nivel obtenido en la etapa a) con un valor de referencia para dicho marcador,

en donde un nivel de expresión disminuido de M-MITF, PIR y/o BCL2 con respecto al valor de referencia para dicho marcador es indicativo de que dicho sujeto tiene alta probabilidad de desarrollar metástasis.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para diferenciar nevus benigno de melanoma en una lesión cutánea que comprende:

a) determinar el nivel de expresión de un marcador seleccionado del grupo formado por BCL3, PIR, PEBP1 y sus combinaciones en una muestra de tejido de dicha lesión cutánea, y

b) comparar el nivel obtenido en la etapa a) con un valor de referencia para dicho marcador,

en donde un nivel de expresión aumentado de BCL3 y/o un nivel de expresión disminuido de PIR y/o PEBP1 con respecto al valor de referencia para dicho marcador es indicativo de que dicha lesión cutánea es melanoma.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit que comprende un reactivo capaz de determinar el nivel de expresión de un marcador seleccionado del grupo formado por BCL3, PIR, PEBP1, M-MITF, BCL2 y sus combinaciones.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un kit de la invención para diagnosticar melanoma cutáneo, para determinar la probabilidad de metástasis de un sujeto diagnosticado con melanoma cutáneo o para diferenciar un nevus benigno de melanoma.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Expresión relativa del gen PIR en líneas de melanoma y cultivos primarios de melanocitos. Todas las líneas de melanoma analizadas muestran una reducción significativa de los niveles de expresión de PIR con respecto a los cultivos primarios de los melanocitos. La media de expresión de PIR en los cultivos primarios de los melanocitos es de 134 y se indica en la gráfica con una línea de puntos discontinua. El porcentaje (%) de expresión es de al menos un 75% menos respecto a los melanocitos.

Figura 2. Expresión relativa del gen PEBP1 en líneas celulares de melanoma y cultivos primarios de melanocitos. La cuantificación de la expresión génica mediante RT-qPCR muestra un silenciamiento del gen PEBP1 en todas las líneas de melanoma analizadas con respecto a los cultivos primarios de los melanocitos. La media de expresión de PEBP1 en cultivos primarios de los melanocitos es de 20,9 y se indica en la gráfica con una línea de puntos discontinua. El % de expresión es de al menos un 75% menos respecto a los melanocitos.

Figura 3. Expresión relativa del gen BCL3 en líneas de melanoma y cultivos primarios de melanocitos. Las líneas de melanoma analizadas muestran una sobreexpresión estadísticamente significativa del gen BCL3 en relación a los niveles encontrados en los cultivos primarios de los melanocitos. La media de expresión de BCL3 en los cultivos primarios de los melanocitos... [Seguir leyendo]

1. Método in vitro para diagnosticar melanoma cutáneo que comprende:

a) determinar el nivel de expresión del marcador PIR en una muestra de un sujeto, y

b) comparar el nivel obtenido en la etapa a) con un valor de referencia para dicho marcador,

en donde un nivel de expresión disminuido de PIR con respecto al valor de referencia para dicho marcador es indicativo de que dicho sujeto padece un melanoma cutáneo.

2. Método in vitro según la reivindicación 1, que comprende además, determinar el nivel de expresión de los marcadores BCL-3 y/o PEBP1.

3. Método in vitro para determinar la probabilidad de metástasis en un sujeto diagnosticado con melanoma cutáneo que comprende:

a) determinar el nivel de expresión del marcador PIR en una muestra obtenida de un sujeto, y

b) comparar el nivel obtenido en la etapa a) con un valor de referencia para dicho marcador,

en donde un nivel de expresión disminuido de PIR, con respecto al valor de referencia para dicho marcador es indicativo de que dicho sujeto padece alta probabilidad de desarrollar metástasis.

4. Método in vitro según la reivindicación 3, que comprende además determinar el nivel de expresión de los marcadores M-MITF y BCL2.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la muestra es una muestra de tejido.

6. Método in vitro para diferenciar nevus benigno de melanoma en una lesión cutánea que comprende:

a) determinar el nivel de expresión del marcador PIR, en una muestra de tejido de dicha lesión cutánea, y

b) comparar el nivel obtenido en la etapa a) con un valor de referencia para dicho marcador,

en donde un nivel de expresión disminuido de PIR con respecto al valor de referencia para dicho marcador es indicativo de que dicha lesión cutánea es melanoma.

7. Método según la reivindicación 6, en donde el nevus benigno es nevus displásico o nevus de Spitz.

8. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, que comprende además, determinar el nivel de expresión de BCL-3 y/o PEBP1.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el nivel de expresión del marcador se determina por medio de ¡nmunohistoquímica, Western blot, ELISA o una matriz de proteínas.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el nivel de expresión del 5 marcador se determina mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa o

por medio de una matriz de ADN o de ARN o mediante técnicas de hibridación de nucleótidos.

11. Kit que comprende un anticuerpo monoclonal específico para el marcador PIR o una pareja de cebadores que híbrida específicamente con el polinucleótido que codifica PIR.

12. Uso de un kit según la reivindicación 11, para diagnosticar melanoma cutáneo, para 10 determinar la probabilidad de metástasis de un sujeto diagnosticado con melanoma cutáneo o

para diferenciar un nevus benigno de melanoma.