BIOSENSOR PARA DETERMINAR LA FUNCIÓN EXPORTADORA DE CRM1.

Biosensor para determinar la función exportadora de CRM1.

La presente invención se refiere a un método para determinar si la función de una variante de CRM1 está alterada en una muestra y a un método para identificar un compuesto con capacidad de modular la función de CRM1 o de una variante equivalente de la misma.

La presente invención también se refiere a una proteína de fusión y al uso de dicha proteína de fusión para determinar si la función de una variante de CRM1 está alterada en una muestra y para identificar un compuesto con capacidad de modular la función de CRM1.

Biosensor para determinar la función exportadora de CRM1 CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método para determinar si la función de una variante de CRM1 está alterada en una muestra y a un método para identificar un compuesto con capacidad de modular la función de CRM1 o de una variante equivalente de la misma. La presente invención también se refiere a una proteína de fusión y al uso de dicha proteína de fusión para determinar si la función de una variante de CRM1 está alterada en una muestra y para identificar un compuesto con capacidad de modular la función de CRM1.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La proteína CRM1/exportina1, es un miembro de la familia de las carioferinas, un grupo de proteínas que funcionan como receptores en el transporte de macromoléculas entre el núcleo y el citoplasma a través de los poros nucleares. Los receptores de transporte nuclear se pueden clasificar funcionalmente en dos grandes grupos: los receptores de importación (importinas) y los receptores de exportación (exportinas). En el citoplasma celular, las importinas reconocen y se unen a secuencias específicas de aminoácidos, denominadas señales de localización nuclear (NLS, nuclear localization signal) en las proteínas "cargo" que han de ser transportadas al núcleo. La importina facilita la entrada del cargo al núcleo a través del poro nuclear y, una vez en el núcleo, el complejo importina/cargo se disocia por la unión de RanGTP a la importina. El proceso de transporte inverso, la exportación de proteínas al citoplasma, esta mediada principalmente por el receptor de exportación CRM1. En el núcleo, y en presencia de RanGTP, CRM1 reconoce y se une a secuencias de aminoácidos denominadas señales de exportación nuclear (NES, nuclear export signal) en los cargos que han de ser exportados. El complejo trimérico CRM1/cargo/RanGTP atraviesa el poro nuclear y se disocia en el citoplasma tras la hidrólisis del GTP. El transporte nucleocitoplásmico de proteínas es un proceso esencial para la homeostasis celular, y se encuentra alterado en varios procesos patológicos, incluido el cáncer.

Numerosas proteínas celulares dependen de la función de CRM1 para ser exportadas al citoplasma y así desarrollar de modo correcto su función. Entre estas proteínas se encuentran importantes reguladores del ciclo celular y de la apoptosis como p53 o survivina

(Stommel et al., 1999, EMBO J. 18:1660-1672; Rodríguez et al., 2002, Exp. Cell Res. 275: 44-53), cuya alteración es causa frecuente del desarrollo tumoral. Recientemente, se han identificado mutaciones puntuales del gen XPO1, que codifica CRM1, en pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL) (Puente et al., 2011, Nature. 475: 101-105). Debido a su importante función en la homeostasis celular, y a su papel central como regulador de proteínas relacionadas con el desarrollo de tumores, CRM1 constituye una interesante diana terapéutica para el tratamiento del cancer (Turner et al., 2012, Biochem. Pharmacol., 83:1021-1032).

La función de CRM1 se ha analizado en numerosos estudios utilizando diferentes métodos, dirigidos fundamentalmente a determinar su capacidad de unión a una secuencia NES (aislada o en el contexto de una proteína). Estos métodos pueden clasificarse en dos grandes grupos según se lleven a cabo en un tampón de reacción bien definido bioquímicamente (ensayos in vitro), o en células intactas o permeabilizadas (ensayos celulares).

Los ensayos in vitro se basan en la utilización de proteínas recombinantes producidas in vitro o purificadas a partir de sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos. A la secuencia de aminoácidos de estas proteínas recombinantes se añaden a menudo epítopos artificiales (por ejemplo GST o 6xHistidine) que facilitan su aislamiento o detección. Usualmente, las proteínas recombinantes (CRM1 y NES) purificadas se añaden a un tampón, que contiene RanGTP, el tercer componente del complejo de exportación. Utilizando diversas variantes de ensayos de co-purificación (por ejemplo GST-pull down) (Grespin et al., 2008, J. Biol. Chem. 283: 25576-25588; Güttler et al., 2010, Nat. Struct. Mol. Biol. 17:1367-1376) o ensayos basados en la cuantificación de la hidrólisis de GTP (RanGAP protection assay) (Askjaer et al., 1999, Mol. Cell. Biol., 19: 6276-6285) se determina si se produce la interacción CRM1/NES. Los ensayos in vitro presentan la limitación de que se llevan a cabo en un medio distinto al fisiológico.

Los ensayos celulares pueden estar dirigidos a evaluar la función de la proteína CRM1 producida de modo natural por las propias células en las que se realiza el ensayo (CRM1 endógena), por ejemplo mediante la transfección o microinyección de sustratos de CRM1 fluorescentes (Ossareh-Nazari et al., 1997, Science 278: 141-144; Cabot et al. 2002, Biol. Reprod. 67: 814-819; Fetz et al., 2009, Sensors 9: 5423-5445). Sin embargo, los ensayos que analizan la función de CRM1 endógena no permiten comparar directamente la función de distintas variantes mutadas de CRM1. Dicha comparación sí es posible utilizando

ensayos celulares en los que se induce la expresión ectópica de CRM1 mediante transfección. La interacción de CRM1 ectópica con una NES se ha investigado mediante co-inmunoprecipitación (Kanai et al., 2007, Nat. Cell Biol., 9: 1175 - 1183), mediante ensayos de doble híbrido (Yang et al., 2001, Mol. Cell 8: 397-406) y también mediante ensayos de relocalización. En estos últimos, se co-transfectan células con plásmidos de expresión que codifican CRM1 y una proteína con NES fusionadas a epítopos que faciliten su detección mediante microscopía de fluorescencia (por ejemplo GFP o Flag). La proteína con NES se utiliza como "cebo" y la interacción CRM1/NES se detecta como un cambio en la localización subcelular de CRM1 (Daelemans et al., 2002, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99: 14440-14445). Estos ensayos evalúan la capacidad de CRM1 para unirse a una NES, pero no directamente su capacidad para exportar una proteína.

Existe por tanto, una necesidad en el estado de la técnica de desarrollar biosensores que permitan la determinación de la funcionalidad en un entorno celular de variantes de CRM1 así como la identificación de compuestos capaces de modular la función de CRM1 basados en el análisis de la capacidad de exportación de dicha exportina.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han desarrollado un método para evaluar la función de la exportina CRM1 basado en la detección de la localización subcelular de un biosensor construido a partir de un cargo natural de CRM1, survivina. Survivina es una proteína constitutivamente citoplasmática. Los autores de la presente invención han diseñado una proteína de fusión que comprende survivina cuya localización es constitutivamente nuclear y que relocaliza al citoplasma en respuesta a la sobreexpresión de una proteína CRM1 funcional.

En un primer aspecto, la invención se refiere a un método para determinar si la función de una variante de CRM1 en una muestra que comprende al menos una célula está alterada, que comprende:

(i) proporcionar una muestra que comprende al menos una célula en donde dicha al menos una célula comprende una proteína de fusión y en donde dicha proteína de fusión comprende:

a) un primer dominio polipeptídico que comprende una variante de survivina seleccionada entre:

1) una variante de survivina que carece de la totalidad o parte del

dominio de homodimerización resultando en un dominio de

homodimerización no funcional; y

2) una variante de survivina que carece de la totalidad o parte del

dominio de homodimerización resultando en un dominio de

homodimerización no funcional y comprende la señal de exportación nuclear (NES) de survivina;

b) al menos, un segundo dominio polipeptídico que comprende una señal de localización nuclear (NLS); y

c) al menos, un tercer dominio polipeptídico reportero;

en donde si la variante de survivina carece de la totalidad o parte de su señal NES, entonces dicha proteína de fusión comprende además

d) un cuarto dominio polipeptídico que comprende una NES;

(ii) introducir en dicha al menos una célula un casete de expresión o un plásmido que codifica para dicha variante de CRM1;

(iii) crecer dicha al menos una célula bajo condiciones que permitan la correcta expresión de dicha variante de CRM1;

(iv) detectar la señal del dominio reportero de dicha proteína de fusión;

(v) determinar la localización subcelular de dicha proteína de fusión;

(vi) comparar la localización subcelular de dicha proteína de fusión determinada en la etapa (v) con dicha localización... [Seguir leyendo]

1. Proteína de fusión que comprende:

(i) un primer dominio polipeptídico que comprende una variante de survivina seleccionada entre:

a) una variante de survivina que carece de la totalidad o parte del dominio de homodimerización resultando en un dominio de homodimerización no funcional; y

b) una variante de survivina que carece de la totalidad o parte del dominio de homodimerización resultando en un dominio de homodimerización no funcional y comprende una señal de exportación nuclear (NES) de survivina;

(ii) al menos, un segundo dominio polipeptídico que comprende una señal de localización nuclear (NLS);

(iii) al menos, un tercer dominio polipeptídico reportero;

en donde si la variante de survivina carece de la totalidad o parte de su

señal NES, entonces dicha proteína de fusión comprende además

(iv) un cuarto dominio polipeptídico que comprende una secuencia NES de survivina humana,

y, en donde dicha variante de survivina es de origen humano.

2. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en donde dicha variante de survivina comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2.

3. Proteína de fusión según la reivindicación 1, en donde dicha NES comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 17.

4. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha NLS se selecciona del grupo formado por: secuencia NLS del antígeno T

grande del virus SV40, secuencia NLS de nucleoplasmina, secuencia NLS de c-myc, secuencia NLS del dominio IBB de la importina alfa, secuencia NLS de la proteína T de mioma, la secuencia NLS de la proteína p53 humana, secuencia NLS de la proteína c-abl IV murina, secuencia NLS de la proteína NS1 del virus de la gripe, la secuencia NLS del antígeno delta del virus de la hepatitis, la secuencia NLS de la proteína Mx1 murina, secuencia NLS de la poli(ADP-ribosa) polimerasa, la secuencia NLS de los receptores de hormonas esteroideas humanos y la secuencia NLS de la proteína p17 del reovirus aviar.

5. Proteína de fusión según la reivindicación 4, en donde dicha NLS comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3.

6. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha proteína de fusión comprende dos segundos dominios polipeptídicos y en donde dichos dos segundos dominios polipeptídicos son idénticosy, en donde cada uno de dichos dos dominios polipeptídicos comprenden la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 3.

7. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho al menos un tercer dominio polipeptídico comprende un polipéptido que se selecciona del grupo formado por: epítopo FLAG, epítopo HA, epítopo Myc, epítopos AU1 y AU5, epítopo Glu-Glu, epítopo KT3, epítopo IRS, epítopo Btag, epítopo de proteína quinasa-C, epítopo de VSV, polipéptido de hexahistidinas y péptido de unión a calmodulina.

8. Proteína de fusión según la reivindicación 7, en donde dicho tercer dominio polipeptídico comprende el epítopo flag.

9. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha proteína de fusión comprende tres terceros dominios polipeptídicos y en donde dichos tres terceros dominios polipeptídicos son idénticos, y en donde dichos tres terceros dominios polipeptídicos comprenden el epítopo flag.

10. Proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1a 9, en donde dicha proteína de fusión comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 52.

11. Ácido nucleico que codifica para la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1a 10.

12. Casete de expresión que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 11 en donde dicho ácido nucleico se encuentra operativamente unido a un sistema de transcripción y/o traducción apropiado.

13. Plásmido que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 11 o el casete de expresión según la reivindicación 12.

14. Célula hospedadora que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 11, el casete de expresión según la reivindicación 12 o el plásmido según la reivindicación 13.

15. Uso de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1a 10 para determinar si la función de una variante de CRM1 está alterada en una muestra o para identificar un compuesto con capacidad de modular la función de CRM1 o de una variante funcionalmente equivalente de la misma en una muestra.

16. Método para determinar si la función de una variante de CRM1 está alterada en una muestra que comprende al menos una célula, en donde dicho método comprende:

(i) proporcionar una muestra que comprende al menos una célula en donde dicha célula comprende una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10;

(ii) introducir en dicha al menos una célula un casete de expresión o un plásmido que codifica para dicha variante de CRM1;

(iii) crecer las células bajo condiciones que permitan la correcta expresión de dicha variante de CRM1;

(iv) detectar la señal del dominio reportero de dicha proteína de fusión;

(v) determinar la localización subcelular de dicha proteína de fusión;

(vi) comparar la localización subcelular determinada en la etapa (iv) con dicha localización subcelular obtenida para dicha proteína de fusión en una muestra de referencia;

en donde dicha variante de CRM1 tiene un grado de identidad de, al menos, el 60% con respecto a la secuencia de CRM1; y

en donde una alteración de la localización subcelular de dicha proteína de fusión es indicativa de una función alterada de CRM1.

17. Método para identificar un compuesto con capacidad de modular la función de CRM1 o de una variante funcionalmente equivalente de la misma en una muestra que comprende al menos una célula, comprendiendo dicho método:

(i) poner en contacto un compuesto candidato con una muestra que comprende al menos una célula en donde dicha célula comprende:

a) una proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10; y

b) un casete de expresión o un plásmido que codifica para CRM1 o una variante funcionalmente equivalente de la misma;

(ii) detectar la señal del dominio reportero de dicha proteína de fusión;

(iii) detectar la localización subcelular de dicha proteína de fusión;

(iv) comparar la localización subcelular de dicha proteína de fusión obtenida en la etapa (iv) con la localización subcelular de dicha proteína de fusión obtenida en una muestra que comprende al menos una célula que no ha sido tratada con dicho compuesto;

en donde dicha variante de CRM1 tiene un grado de identidad de, al menos, el 60% con respecto a la secuencia de CRM1; y

en donde una alteración de la localización subcelular de la proteína de fusión detectada en la etapa (iii) con respecto a dicha localización subcelular en dicha muestra no tratada es indicativa de que dicho compuesto es capaz de modular la función de dicha CRM1 o de dicha variante funcionalmente equivalente de la misma.