Método de descontaminación de una solución de ácidos nucleicos indeseables.

Método de descontaminación de una solución de cualquier ácido nucleico presente en esta solución,

que comprende las etapas siguientes:

- someter, durante un tiempo suficiente, la solución a la acción de al menos una molécula de fragmentación, formada por un complejo constituido por dos moléculas de 1,10-fenantrolina asociado a un átomo metálico que forma el complejo bis(1,10-enantrolina)/metal, en presencia de reductor orgánico, hasta la degradación total de dichos ácidos nucleicos, y

- detener de la actividad de la molécula de fragmentación mediante la adición:

* de un exceso de reductor orgánico, o

* de un agente complejante, tal como EDTA.

Método de descontaminación de una solución de ácidos nucleicos indeseables

La presente invención se refiere a un método de descontaminación de una solución de ácidos nucleicos indeseables. La presente invención se refiere también a la utilización de tal solución así tratada.

El desarrollo de la biología molecular ha hecho posible la manipulación de los ácidos nucleicos. Los métodos de amplificación se han convertido entonces una herramienta indispensable, permitiendo obtener a partir de una muy baja cantidad de ácidos nucleicos, una mayor cantidad en un tiempo relativamente corto. Un inconveniente principal de estas técnicas reside en la amplificación de ácidos nucleicos indeseables, produciendo unos resultados erróneos, incluso unos falsos positivos en unos ensayos clínicos. Es lo que se denomina contaminación.

Esta contaminación puede provenir de varias fuentes: mesas de laboratorio mal limpiadas, el personal, el entorno, equipamientos y dispositivos de pipeteo, muestras no estériles.

Se ha establecido un cierto número de recomendaciones que pretenden limitar estas contaminaciones. Se trata de métodos preventivos que se refieren, por ejemplo, a la manipulación de las muestras (técnicas de esterilización, en particular) o también a los equipos de laboratorio (zonas de trabajo físicamente delimitadas, utilización de campanas de extracción, gradiente de presión entre el exterior y el interior, a fin de que el flujo permita siempre la evacuación en la dirección deseada, etc.).

La contaminación puede también provenir de los amplicones procedentes de amplificaciones anteriores o de una contaminación cruzada entre muestras.

Otra fuente no desdeñable de contaminación reside en la materia prima (enzimas, reactivos) utilizada en la reacción de amplificación. Así, Corless et al. exponen las consecuencias de la contaminación de la taq polimerasa sobre la sensibilidad de la PCR en tiempo real para la detección del ARN 16S (J. Clin. Microbiol., 38(5), 1747-1752 (2)).

Una primera forma de remediar la contaminación de las enzimas necesarias para la amplificación, consiste en unos métodos de descontaminación enzimática.

Así, la patente US-A-5,418,149 describe un método que utiliza la uracil-ADN-glicosilasa, que permite degradar los ácidos nucleicos que provienen de la célula productora de la enzima. Esta técnica utiliza la sobreexpresión de una proteína deseada, en este caso una polimerasa, en unas células de E. coli deficientes en uracil-ADN-glicosilasa (UNG) y una desoxiuridina trifosfatasa (dUTPasa). Gracias a la deficiencia en UNG, la célula no elimina las bases desoxluracllo Incorporadas. Por la deficiencia en dUTPasa, la célula aumenta su pool de desoxiuridina. Así, el medio de cultivo permite la producción de la proteína deseada (polimerasa) y la incorporación de desoxiuridina en los ácidos nucleicos. Las proteínas sintetizadas son entonces purificadas mediante técnicas estándar de purificación y mediante un tratamiento por uracil-ADN-glicosilasa, que fragmenta el residuo uracilo de los ácidos nucleicos residuales. La glicosilasa se inactiva después por calor a fin de evitar la destrucción del ADN diana durante una reacción de amplificación.

Siendo este método específico de la producción de proteínas recombinantes, su principal inconveniente se debe a su utilización. Además, la descontaminación está limitada a los ácidos nucleicos que contienen uracilo. Finalmente, otro inconveniente eventual es que el tratamiento por calor induce sólo una inactivación parcial de la uracil-ADN- glicosilasa. El ADN diana puesto en contacto con la proteína puede entonces eventualmente ser destruido.

Otro método enzimático descrito por Ashkenas et al. (Biotechniques; julio de 25; 39(1 ):69-73), consiste en descontaminar una solución que contiene el conjunto de los elementos necesarios para una amplificación. Se trata aquí de un cóctel de enzimas de restricción utilizado en el ámbito de una RT-PCR. Estas enzimas degradan el ADN bicatenario presente en el medio de reacción de amplificación que contiene el ARN diana a amplificar. Después, se inactivan por calor cuando se produce la transcripción inversa. Una alternativa a este método para una aplicación PCR, por lo tanto en presencia de ADN diana bicatenario, es asimismo descrita pero está limitada a la utilización de un solo tipo de enzima de restricción (tipo IIS RE). Sin embargo, la utilización de enzimas de restricción presenta el inconveniente de escindir sólo unos ácidos nucleicos bicatenarios que además deben presentar el sitio de reconocimiento. De este modo, los contaminantes en forma monocatenaria y/o que presentan pocos o ninguno de tales sitios no son entonces eliminados.

Otros métodos enzimáticos de descontaminación consisten, en sí mismos, en eliminar los ácidos nucleicos indeseables de una solución antes de la puesta en contacto con los ácidos nucleicos dianas. La solicitud de patente WO-A-99/7887 describe la utilización de una ADNasa termolábil que permite degradar los ácidos nucleicos bicatenarios contenidos en el medio de reacción antes de la puesta en contacto con los ácidos nucleicos dianas. La enzima se inactiva después por calor.

El inconveniente principal de esta técnica es que esta enzima no permite la degradación de contaminantes en forma

de ARN, de ADN monocatenario o de heterodúplex ARN/ADN. Además, la inactivación de esta enzima por calor en el medio de reacción necesita la utilización de polimerasas termoestables.

La técnica anterior tiene en cuenta también unos métodos no enzimáticos.

Así, Mohammadi ef al. (J. Clin. Microbiol. Oct. de 23; 41(1):4796-8) describe una técnica que consiste en la filtración sobre columnas de los reactivos de extracción y, eventualmente, de la digestión por una enzima de restricción, Sau3AI, de los reactivos de la PCR antes de la amplificación. El Inconveniente de las técnicas de filtración reside en el hecho de que estas técnicas no se pueden aplicar a medios complejos sin cambiar la concentración ni las propiedades. Además, esta etapa suplementaria de filtración puede ser, en sí misma, fuente de contaminación.

La solicitud de patente WO-A-94/12515 describe un método de tratamiento por un compuesto fotorreactivo de una solución que contiene la Taq polimerasa y potencialmente unos ácidos nucleicos contaminantes. Este compuesto fotorreactivo, por ejemplo un derivado furocumarina, es activado por una exposición a la radiación ultravioleta. Un inconveniente principal de esta técnica, además de sus dificultades de utilización, es el efecto perjudicial de las radiaciones sobre las proteínas. Además, este método sigue siendo poco eficaz debido a la degradación aleatoria de dichos ácidos nucleicos, y puede generar unos fragmentos también amplificables.

Otro método no enzimático descrito por Chang ef al., (RNA. mayo de 25; 11 (5):831-6) utiliza un complejo de cobalto para la inhibición de la traducción. Este complejo permite la hidrólisis de los enlaces fosfatodiésteres del ADN y del ARN.

Los inconvenientes principales de esta técnica son la degradación incompleta de los ácidos nucleicos y la lentitud de la reacción de descontaminación (24 horas).

También se han descrito unos complejos metálicos en la solicitud de patente WO-A-26/349 a fin de purificar unas moléculas biológicas contaminadas por unos ácidos nucleicos. Así, un complejo de fragmentación constituido de dos moléculas de fenantrolina asociadas a un átomo de cobre (bis(1,1-fenantrolina)/Cu) es utilizado para purificar una solución que contiene la taq polimerasa. Esta solución es después purificada por unas técnicas estándar de cromatografía a fin de eliminar los ácidos nucleicos contaminantes y/o las moléculas de fragmentación.

El principal inconveniente de este método es la presencia de una etapa de purificación, que hace difícil su realización y que aumenta el riesgo de nuevas contaminaciones.

La patente EP-B-.646.18 describe un procedimiento que permite inactivar unas secuencias de nucleótidos por unos quelatos metálicos. Un complejo de fragmentación tal como el bi(1,1-fenantrolina)/Cu se utiliza para descontaminar las soluciones, después de la etapa de amplificación, de todos los ácidos nucleicos presentes. Esto permite evitar la contaminación de nuevas muestras por unos amplicones procedentes de una reacción de amplificación anterior. Este documento describe también la utilización de una molécula de fragmentación para descontaminar unas preparaciones de productos biológicos.

En el caso de la primera utilización, un principal inconveniente de este método es que no permite la degradación de todos los ácidos... [Seguir leyendo]

1. Método de descontaminación de una solución de cualquier ácido nucleico presente en esta solución, que comprende las etapas siguientes:

- someter, durante un tiempo suficiente, la solución a la acción de al menos una molécula de fragmentación, formada por un complejo constituido por dos moléculas de 1,1-fenantrolina asociado a un átomo metálico que forma el complejo bis(1,1-enantrol¡na)/metal, en presencia de reductor orgánico, hasta la degradación total de dichos ácidos nucleicos, y

- detener de la actividad de la molécula de fragmentación mediante la adición:

* de un exceso de reductor orgánico, o

* de un agente complejante, tal como EDTA.

2. Método de descontaminación de una solución, que contiene unos ácidos nucleicos contaminantes y unos ácidos nucleicos de interés que comprenden las etapas siguientes:

- someter, durante un tiempo suficiente, la solución a la acción de al menos una molécula de fragmentación formada por un complejo constituido de dos moléculas de 1,1-fenantrolina asociado a un átomo metálico que forma el complejo bis(1,1-fenantrolina)/metal, en presencia de reductor orgánico, y esto hasta la degradación de dichos ácidos nucleicos contaminantes conservando al mismo tiempo los ácidos nucleicos de interés que están naturalmente protegidos de la acción de la molécula de fragmentación por un revestimiento exterior, y

- detener la actividad de la molécula de fragmentación mediante una adición:

* de un exceso de reductor orgánico, o

* de un agente complejante, tal como EDTA.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que el método comprende, después de la detención de la actividad de la molécula de fragmentación, una etapa suplementaria que consiste en una reacción de amplificación.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que el metal es un metal de transición tal como el cobre, el rutenio, el níquel, el hierro, el zinc, el rodio, el cobalto o el manganeso.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que los dos núcleos fenantrolina de la molécula de fragmentación están unidos el uno al otro mediante un miembro para formar una molécula ClipPhen.

6. Método según la reivindicación 5, caracterizado por que el miembro de unión entre los dos núcleos fenantrolina está constituido por una cadena de tres átomos de carbono sucesivos, cuyo átomo de carbono en la posición central es sustituido y cuyo átomo de carbono terminal está unido a un núcleo fenantrolina por un átomo de oxígeno.

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado por que el átomo de carbono en la posición central está sustituido por -NH2 o -NH-CO-CH3, y por que cada átomo de carbono terminal está unido a un núcleo fenantrolina por un átomo de oxígeno en la posición 2 o 3 de dicho núcleo.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado por que la molécula CliPhen es una 3- ClipPhen ((1,3-bis(1,1-fenantrolin-3-iloxi)propan-2-amina).

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que la molécula de fragmentación es un complejo cuproso de tipo I asociado a peróxido de hidrógeno H2O2 y, eventualmente, a otro reductor, preferiblemente orgánico.

1. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que la molécula de fragmentación es un complejo cúprico de tipo II asociado, preferiblemente, a otro reductor orgánico.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1, caracterizado porque el reductor tal como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, u otro reductor tal como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 9 o 1, es un reductor orgánico constituido por:

* un tiol, tal como el di-tiotreitol (DTT), un tio-ácido, tal como el ácido mercapto-propiónico, o

* un ácido carboxílico, o

* un derivado de un ácido carboxílico tal como el ascorbato, o

* una fosflna como la tri-carboxi-etil-fosfina (TCEP), o

* una combinación de al menos dos de estos reductores orgánicos.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que la molécula de fragmentación está Inmovilizada sobre un soporte sólido.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el reductor tal como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el otro reductor tal como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 9 o 1, está inmovilizado sobre un soporte sólido.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado por que el soporte sólido es una partícula, una membrana, una banda, una película o un filtro.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9 o 1, caracterizado por que la relación entre la molécula de fragmentación y el otro reductor orgánico, constituido por un ácido carboxílico o un derivado de tal ácido, está comprendida entre 1 por 1 y 1 por 1.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la relación entre dicha molécula de fragmentación y el reductor, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, constituido por un tiol, es superior a 1 por 1, y preferiblemente superior a 1 por 1.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado por que los ácidos nucleicos tratados son el ARN o el ADN, que se presenta en forma mono o blcatenaria, así como los heterodúplex ARN/ADN.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado por que la duración del tratamiento sufrido por los ácidos nucleicos tratados está comprendido entre 5 y 6 minutos, preferiblemente entre 1 y 3 minutos para unas concentraciones en CilpPhen/metal comprendidas entre 1 pM y 1 pM.

19. Utilización de una solución tratada por un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 18, para la amplificación de ácidos nucleicos diana, caracterizada por que la solución está mezclada con una muestra biológica que contiene dichos ácidos nucleicos diana, que se desean amplificar, pero también los cebadores de amplificación y las sondas de detección específicas de los ácidos nucleicos diana.

2. Utilización según la reivindicación 19, caracterizada por que el reductor orgánico, tal como el descrito en el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, es idéntico a otro reductor orgánico, según una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 1.

21. Utilización según la reivindicación 19, caracterizada por que el reductor orgánico, tal como el descrito en el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, es diferente del otro reductor orgánico, tal como el descrito en el método según una cualquiera de las reivindicaciones 9 o 1.